杜春華 徐怡 李東嫻 曹紅云 秦波 游燕

摘要：目的分析測定經(jīng)過60℃烘烤前后滇重樓中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量變化。方法采用HPLC法，色譜柱為WatersSunFire-C18（4.6 mm×150 mm，5μm），流動相為乙腈-水為流動相，梯度洗脫；進樣量10 μL，柱溫30℃，檢測波長203 nm。結(jié)果8個不同產(chǎn)地的滇重樓藥材，經(jīng)過60℃烘烤前后滇重樓中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量變化有差異，其中四種皂苷總量及重樓皂苷Ⅰ含量明顯降低。結(jié)論經(jīng)過60℃烘烤后對滇重樓的品質(zhì)有影響。

關(guān)鍵詞：滇重樓；重樓皂苷；含量變化；高效液相色譜法

中圖分類號：R284.1文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2016）05-0049-03

重樓首載于《滇南本草》，為重樓屬植物，學(xué)名為[Paris polyphylla var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.]，現(xiàn)稱滇重樓。在云南的別名為土三七、七葉一枝花、重樓、大重樓、重臺、兩把傘、獨角蓮（滇南本草），根莖入藥，有消腫解毒，止血止痛，利小便之功能[1-2]。滇重樓是中成藥，如云南白藥、季德勝蛇藥片、宮血寧膠囊、樓蓮膠囊、熱毒清膠囊等的主要原料之一[3]-4]。甾體皂苷是重樓的主要活性成分，并含有氨基酸、甾酮、蛻皮激素、黃酮苷等化合物，具有止血、抗菌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜等作用。甾體皂苷：按苷元的不同主要有兩類，一類為薯蕷皂苷元（diosgenin）的糖苷，另一類為偏諾皂苷元（pennogenin）的糖苷，重樓皂苷中屬于薯蕷皂苷元的有重樓皂苷I、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ，屬于偏諾皂苷元的有重樓皂苷Ⅶ[3，5]?，F(xiàn)采用HPLC測定經(jīng)過60℃烘烤不同產(chǎn)地的滇重樓藥材中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量變化，為評價其內(nèi)在質(zhì)量、臨床藥理研究及產(chǎn)地加工提供理論參考。

1實驗部分

1.1儀器和試藥

1.1.1儀器Waters e2695高效液相色譜儀系統(tǒng)（美國Waters）、AG285型電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）、DHG-9031A型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

1.1.2試劑重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為：111590-200402，111591-201103，111592-201203，111593-200402）；乙腈為色譜純（德國默克公司），甲醇為分析純，水為超純水。

1.1.3藥材采集8個不同產(chǎn)地滇重樓藥材，均為栽培品種，產(chǎn)地分別為：大理九頂山、新平縣嘎灑鎮(zhèn)、云龍縣白石鎮(zhèn)、云龍縣關(guān)坪鄉(xiāng)、耿馬縣大興鄉(xiāng)、蒙自冷泉鎮(zhèn)、馬關(guān)縣南撈鄉(xiāng)、祿勸縣撒營盤鄉(xiāng)（見表1），經(jīng)云南省藥物所究所天然藥物資源研究中心高級工程師戚育芳鑒定為為百合科植物云南重樓[P.polyphylla var.yunnanensis（Fr.）Hand.-Mazz.]的干燥根莖。

1.2方法與結(jié)果

1.2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性色譜柱為（WatersSunFire-C18，4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（流動相A 0→40 min，30%→70%；40→50 min，60%→40%），流速：1.0 min·mL-1，進樣量：10 μL，柱溫30℃，檢測波長203 nm。在此色譜條件下，理論板數(shù)按重樓皂苷Ⅰ峰計算不低于4000。

1.2.2標準品溶液的制備取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成濃度為0.4110、0.3950、0.4300、0.4380 mg/mL的溶液，即得對照品混合溶液。

1.2.3樣品的制備將清洗前后各8個不同產(chǎn)地的滇重樓藥材，每一批號的樣品先用鐵錘敲小平均分為2份，一份直接用萬能粉碎機打粉，過3號篩；另一份用自來水清洗3遍，裝于鐵絲網(wǎng)篩中濾干水分后放入電熱恒溫干燥箱中，60℃恒溫干燥24 h，放冷后用萬能粉碎機打粉，過三號篩備用，同時測定水分含量。取約0.5 g 重樓藥材粉末（過三號篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4線性關(guān)系考察精密吸取對照品混合溶液2、5、10、15、20、25、30 μL分別進樣，記錄色譜圖，測定峰面積。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的回歸方程分別為：YⅠ=145362XⅠ+20908（r=0.9995）；YⅡ=280662XⅡ-15056（r=0.9993）；YⅥ=370123XⅥ+10054（r=0.9996）；YⅦ=254145XⅦ+13908（r=0.9995）。線性范圍分別為2.1222～12.1000、2.1014～13.7500、1.6455～14.5000、1.8805～12.6600 μg。

1.2.5儀器精密度試驗精密吸取對照品混合溶液10μl，按“1.2.1”項下條件連續(xù)進樣5次，各成分峰面積的RSD分別為0.98%、1.17%、1.02%、0.88%。表明該方法儀器精密度良好。

1.2.6重復(fù)性試驗取同一產(chǎn)地的樣品5 份，按“1.2.3”項方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項條件，分別進樣10 μL，測定重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量。其含量的RSD分別為1.78、2.00、1.65、2.12%。表明方法重復(fù)性良好。

1.2.7穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣10 μL，測定峰面積，計算各成分峰面積的RSD分別為1.98、2.36、2.07、2.14%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.8回收率試驗取已知含量的同一供試品6份，每份0.5 g，精密稱定，分別添加對照品貯備液1 mL（重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ分別為0.1058 mg.m l-1、0.0625 mg.m l-1、0.0682 mg.m l-1、0.0578 mg.m l-1），按“1.2.3”項方法制備供試品溶液。按“1.2.1”項條件，分別精密進樣10μl，測得重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的平均回收率分別為97.55、96.06、98.08、98.20%；RSD分別為2.88、2.65、2.58、2.76%。表明該方法的準確度良好。

1.2.9樣品的測定精密稱取8個不同產(chǎn)地滇重樓藥材粉末各2份，每份約0.5 g。按1.2.3項下方法制備供試品溶液，按1.2.1項條件進樣，測得各色譜峰的峰面積。按外標一點法計算重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量（見表1）。對照品及樣品圖譜（見圖1）。結(jié)果表明，8個不同產(chǎn)地的滇重樓藥材，經(jīng)過60℃烘烤前后滇重樓中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量變化有差異，其中四種皂苷總量及重樓皂苷Ⅰ含量明顯降低。重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ的變化無明顯規(guī)律。

2討論

滇重樓化學(xué)成分復(fù)雜，對滇重樓有效成分的藥理研究表明其藥理活性強，如：重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ具有細胞毒活性、重樓皂苷Ⅰ～Ⅲ具有免疫調(diào)節(jié)活性，偏諾皂苷的止血活性強于薯蕷皂苷[6]。《中國藥典》2015年版一部規(guī)定按干燥品計算，重樓皂苷Ⅰ（C44H70O16），重樓皂苷Ⅱ（C51H82O20），重樓皂苷Ⅵ（C39H62O13）和重樓皂苷（C51H82O21）的總量作為重樓含量測定的指標成分，且不得少于0.60%[7]。

實驗結(jié)果表明，8個不同產(chǎn)地樣品清洗后經(jīng)過60℃烘烤后重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ總量及重樓皂苷Ⅰ的含量有明顯的降低，有效成分的藥理活性是否也會相應(yīng)的降低，還有待進一步的藥理研究。在滇重樓干燥過程中，伴隨著滇重樓內(nèi)水分的散失，其生理活性和物理形態(tài)也發(fā)生著顯著的變化，不同干燥方法對滇重樓的品質(zhì)影響較大[8]?！吨袊幍洹?015年版一部規(guī)定藥材產(chǎn)地加工及炮制的干燥方法中低溫干燥（一般不超過60℃）。滇重樓經(jīng)過60℃烘烤24 h后，確實對其品質(zhì)有影響。

近年來，隨著國家對天然藥物生產(chǎn)制劑和原料進行控制和管理，從天然藥物的源頭抓起，以保證藥材質(zhì)量的穩(wěn)定，那么對滇重樓選取適宜的干燥方法和干燥溫度還有待進一步摸索研究，從而保證其作為中成藥的原料藥的品質(zhì)奠定基礎(chǔ)，也為滇重樓產(chǎn)地采收加工提供理論依據(jù)。

參考文獻：

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