楊春平+李俐華+羅英+劉紅兵+劉月輝

【摘要】目的：檢測(cè)喉鱗狀細(xì)胞癌患者外周血Treg細(xì)胞和Thl7細(xì)胞比例，研究其變化與意義。方法：采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)10例健康對(duì)照者和42例喉鱗狀細(xì)胞癌患者外周血Treg和Thl7細(xì)胞比例，并觀察Th17/Treg在喉癌分期中的變化。結(jié)果：與健康對(duì)照組比較，喉癌患者外周血Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例明顯升高（P<0.05）；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的Treg和Th17細(xì)胞比例增高（P<0.05）；通過(guò)分析不同喉癌分期中Th17/Treg細(xì)胞的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅲ+Ⅳ期組Th17細(xì)胞的比例和Ⅰ+Ⅱ期無(wú)明顯差異，而Treg細(xì)胞在Ⅲ+Ⅳ期比Ⅰ+Ⅱ期明顯增高（P<0.05）。結(jié)論：喉癌外周血中Th17和Treg細(xì)胞數(shù)量增多，二者比例增高，并隨著疾病的進(jìn)展而增加，表明二者均參與了喉癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

【關(guān)鍵詞】喉鱗狀細(xì)胞癌；Thl7細(xì)胞；Treg細(xì)胞；表達(dá)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R730.6 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）08-0086-02

Abstract：Objective To investigate Th17 /T regulatory （ Treg） cell ratio in laryngeal cancer.Methods The two T cell subsets were determined in the peripheral blood of 42 patients with laryngeal squamous cell carcinoma（ LSCC） and 10 healthy volunteers by flow cytometry.Results Compared with the healthy controls，patients had a significantly higher proportion of both Th17 and Treg cells.Higher frequencies of Treg and Th17 cells were found in patients with lymph node involvement.Moreover，The results showed that there was no significant difference in the proportion of Th17 cells and the early stage of cells， while the Treg cells were significantly higher than those in group III and IV.Conclusion Our results suggested a counter regulation of Th17and Treg cells maybe involved in the development and progression of LSCC.

Keywords：Laryngeal Squamous Cell Carcinoma； Th17cell； Treg Cell； Expression

喉癌是發(fā)病率僅次于鼻咽癌的頭頸部惡性腫瘤。目前采用手術(shù)、放化療后生存率有顯著提高，但是部分患者仍有局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。免疫逃逸是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)的主要原因，也是體內(nèi)多種免疫細(xì)胞相互作用的結(jié)果。其中Thl7細(xì)胞及Treg細(xì)胞是近年來(lái)最受關(guān)注的CD4+T細(xì)胞亞群，在調(diào)節(jié)免疫功能中起重要作用，它們?cè)谀[瘤形成、發(fā)展中的作用和相互關(guān)系引起了相關(guān)學(xué)者的極大興趣。本研究通過(guò)檢測(cè)不同分期喉癌患者外周血中Th17及 Treg細(xì)胞水平的變化，探討二者表達(dá)與喉癌發(fā)生、發(fā)展及變化的關(guān)系，為開(kāi)發(fā)新的免疫治療方法提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料研究對(duì)象為2013年1月至12月在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科收治的、未經(jīng)任何治療的男性喉鱗狀細(xì)胞癌患者42例，年齡41～75歲，平均年齡（54.2±16.4）歲。根據(jù)2002年UICC關(guān)于喉癌的分期標(biāo)準(zhǔn)，（Ⅰ+Ⅱ）期18例，（Ⅲ+Ⅳ）期24例，其中頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例。另外以10例健康體檢者作為對(duì)照組。受檢者在清晨空腹采取靜脈血2.0ml，肝素鈉抗凝，2000r/min離心10min分離出血清后于-20℃凍存。采用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，用于RNA提取和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.2主要試劑APC標(biāo)記的抗人CD4抗體、PE標(biāo)記的抗人CD25抗體、FITC標(biāo)記的抗人IL-17、Foxp3抗體（eBioscience公司）、Th17破膜劑（BF公司）、Foxp3檢測(cè)專(zhuān)用固定劑和破膜劑（eBioscience公司）、RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）、新生小牛血清（杭州四季青公司）、淋巴細(xì)胞分離液（上海朗頓生物科技有限公司）、佛波酯、離子霉素、莫能霉素（Sigma公司）。流式細(xì)胞分析儀（BD公司）、BIORAD model 550型酶標(biāo)儀（伯樂(lè)公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法Th17細(xì)胞檢測(cè)：調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞懸液濃度至1×106ml-1，分別加入50ng/ml（終濃度）佛波酯、1μg/ml離子霉素、1μg/ml BFA及含10%新生小牛血清的1640培養(yǎng)液。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h后收集培養(yǎng)的細(xì)胞，1%多聚甲醛固定15min，PBS洗滌、離心5min后棄上清液，加入APC標(biāo)記的抗人CD4抗體2μl、破膜劑及FITC標(biāo)記的抗人IL-17抗體，孵育30min后，PBS洗滌后再重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)至流式細(xì)胞儀專(zhuān)用管內(nèi)避光檢測(cè)Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例。

Treg細(xì)胞檢測(cè)：調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞懸液濃度至1×106ml-1，取100μl細(xì)胞懸液，加入10μl FITC標(biāo)記的CD4抗體對(duì)細(xì)胞染色，4℃避光孵育30min，PBS洗滌細(xì)胞、然后加入Foxp3檢測(cè)專(zhuān)用固定劑和破膜劑孵育洗滌細(xì)胞，加入10μl Foxp3單抗，室溫下避光孵育20min，洗滌重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，以CD4和CD25設(shè)門(mén)，分析門(mén)內(nèi)Foxp3細(xì)胞亞群比例。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1喉癌組與健康對(duì)照組外周血Th17和Treg細(xì)胞百分率比較流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示喉癌患者組Th17和Treg細(xì)胞百分率均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1；Ⅰ+Ⅱ期組中Th17細(xì)胞百分率與Ⅲ+Ⅳ期組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而Ⅰ+Ⅱ期組中Treg細(xì)胞百分率與Ⅲ+Ⅳ期組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2；其中無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者外周血Th17和Treg細(xì)胞百分率均明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3 。

3討論

免疫逃逸是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)以及復(fù)發(fā)的重要原因，腫瘤細(xì)胞通過(guò)修飾自身表面抗原及改變組織微環(huán)境等途徑來(lái)逃避自身免疫系統(tǒng)的識(shí)別及攻擊，表現(xiàn)為腫瘤局部及外周血中免疫細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子之間的平衡被打亂。Th17和Treg細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞重要的細(xì)胞亞群，在正常機(jī)體內(nèi)Th17和Treg細(xì)胞保持一定的比例，其比例失調(diào)就會(huì)引起免疫功能低下或免疫耐受，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展，使腫瘤細(xì)胞逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊[1]。Th17細(xì)胞通過(guò)分泌IL-17在介導(dǎo)細(xì)胞外病原體感染、腫瘤、哮喘、移植排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。有研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中Th17高表達(dá)者預(yù)后較差、病死率較高、生存期縮短。Foxp3是控制Treg細(xì)胞發(fā)育、分化及發(fā)揮免疫抑制功能的關(guān)鍵細(xì)胞因子，既對(duì)Treg細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)起到“開(kāi)關(guān)”的作用。Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子參與抑制抗腫瘤免疫，誘導(dǎo)腫瘤局部免疫耐受，通過(guò)分泌抑制性細(xì)胞因子抑制機(jī)體免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞在外周血中也同樣升高，且數(shù)量與腫瘤的進(jìn)展程度和預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[3-5]。

目前，對(duì)Th17與Treg細(xì)胞在炎癥和自身免疫性疾病中存在失衡現(xiàn)象的研究較多，而在腫瘤中的研究則較少。Kryczek[6]發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤的進(jìn)展，Th17和Treg細(xì)胞數(shù)量均增加，而Treg細(xì)胞增加的幅度高于Th17細(xì)胞；Li等[7]報(bào)道IL-17、Foxp3在肺癌和癌旁組織的表達(dá)水平均隨腫瘤分期而上升，提示IL-17、Foxp3可能共同參與促進(jìn)腫瘤進(jìn)展；另外的研究也發(fā)現(xiàn)肺癌患者外周血中Treg細(xì)胞、Treg /Th17比值均高于健康對(duì)照組，且晚期患者更明顯[8-9]。

本研究表明，喉癌患者外周血中Th17、Treg細(xì)胞水平均較對(duì)照組明顯升高，Ⅲ+Ⅳ組高于Ⅰ+Ⅱ組，腫瘤分期越晚，Treg比Th17細(xì)胞增多更為明顯。該結(jié)果提示，喉癌患者外周血中Th17和Treg細(xì)胞水平升高，且與腫瘤分期相關(guān)。而Th17細(xì)胞在Ⅲ+Ⅳ組中的比例與Ⅰ+Ⅱ組比較無(wú)提高，可能是晚期腫瘤通過(guò)局部浸潤(rùn)和血管轉(zhuǎn)移，致被招募到腫瘤內(nèi)的Th17細(xì)胞又釋放至外周血中，出現(xiàn)晚期患者外周血中IL-17細(xì)胞比例比早期患者和健康者增高的現(xiàn)象。該淋巴細(xì)胞循環(huán)方式導(dǎo)致了外周血IL-17在不同臨床分期患者中的所占比例有所不同。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中Th17和 Treg細(xì)胞比例也較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組升高，表明增多的Treg細(xì)胞可能通過(guò)介導(dǎo)免疫耐受，一定程度上促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展。動(dòng)物研究結(jié)果也證實(shí)受腫瘤浸潤(rùn)的淋巴結(jié)及外周血的效應(yīng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，被腫瘤特異性Treg細(xì)胞的抑制，導(dǎo)致Treg細(xì)胞在局部占優(yōu)勢(shì)促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，提示Th17/Treg細(xì)胞分化失衡可能參與喉癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程[10]。

綜上所述，喉癌外周血中Th17和Treg細(xì)胞數(shù)量增多，參與了喉癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，但Th17和Treg細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境內(nèi)的變化失衡的具體機(jī)制及其對(duì)臨床干預(yù)策略的意義，還有待進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Bettelli E， Carrier Y， Gao W，et al.Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells[J].Nature，2006，441（7090）：235-238.

[2]Wakita D，Sumida K，Iwakura Y，et al. Tumor-infiltrating IL-17-producing gamma delta T cells support the progression of tumor by promoting angiogenesis[J].Eur J Immunol，2010，40（7） ：1927-1937.

[3]Tao H，Mimura Y，Aoe K，et al.Prognostic potential of FOXP3 expression in non-small cell lung cancer cells combined with tumor infiltrating regulatory T cells[J].Lung Cancer，2012，75（1） ：95-101.

[4]Chen C， Chen D，Zhang Y，et al.Changes of CD4+CD25+FoxP3+ and CD8+CD28-regulatory T cells in non-small cell lung cancer patients undergoing surgery[J]. Int Immunopharmacol，2014，18（2） ：255-261.

[5]Maruyama T， Kono K， Mizukami Y， et al.Distribution of Th17 cells and FoxP3（+） regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes，tumor-draining lymph nodes and peripheral blood lymphocytes in patients with gastric cancer[J].Cancer Sci，2010，101（9） ：1947-1954.

[6]Kryczek I， Wu K， Zhao E， et al.IL-17+ regulatory T cells in the microenvironments of chronic inflammation and cancer[J].J Immunol，2011，186（7）：4388-4395.

[7]Li S， Li Y， Qu X，et al. Detection and significance of TregFoxP3（+） and Th17 cells in peripheral blood of non-small cell lung cancerpatients[J].Arch Med Sci，2014，10（2）：232-239.

[8]李莎，李巖，梁婧，等.非小細(xì)胞肺癌患者外周血FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Thl7的檢測(cè)與臨床意義[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2012，32（7） ：642-646.

[9]Zhao L，Yang J，Wang HP，et al.Imbalance in the Th17 /Treg and cytokine environment in peripheral blood of patients with adenocarcinoma and squamous cell carcinoma[J].Med Oncol，2013，30（1）：461-468.

[10]Tosolini M， Kirilovsky A，Mlecnik B，et al.Clinical impact of different classes of infiltrating T cytotoxic and helper cells （Th1，th2，treg，th17） in patients with colorectal cancer[J].Cancer res，2011，71（4）：1263-1271.

（收稿日期：2016.02.03）