陳　芳，馬鳳霞，李　洋，徐方運(yùn)，池　穎，盧士紅，韓忠朝

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院　北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院　血液學(xué)研究所　血液病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300020

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·論著·

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌白介素- 6對(duì)白血病細(xì)胞分化的影響

陳芳，馬鳳霞，李洋，徐方運(yùn)，池穎，盧士紅，韓忠朝

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300020

摘要：目的探討臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSC)對(duì)白血病細(xì)胞分化的影響。方法體外建立UC-MSC與急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系NB4細(xì)胞共培養(yǎng)體系，通過細(xì)胞形態(tài)、硝基四唑氮藍(lán)還原實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞表面粒系分化標(biāo)志CD11b的檢測(cè)，評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的分化狀態(tài)。結(jié)果UC-MSC在體外能夠誘導(dǎo)NB4細(xì)胞向粒系分化成熟并和小劑量全反式維甲酸共同應(yīng)用時(shí)存在誘導(dǎo)作用聯(lián)合增強(qiáng)。白介素(IL)- 6Ra中和阻斷IL- 6作用后可部分逆轉(zhuǎn)UC-MSC的促分化作用，外源性IL- 6對(duì)NB4細(xì)胞發(fā)揮促粒系分化作用。結(jié)論UC-MSC通過分泌IL- 6可以誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞向粒系分化成熟，且和小劑量全反式維甲酸同時(shí)應(yīng)用可以達(dá)到誘導(dǎo)分化作用聯(lián)合增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細(xì)胞；急性早幼粒細(xì)胞白血?。籒B4；分化；白介素- 6

ActaAcadMedSin，2016,38(2)：164-168

由于間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)是人體微環(huán)境的重要組成部分，且在體外易于擴(kuò)增培養(yǎng)，它潛在的應(yīng)用價(jià)值近年來一直是研究的熱點(diǎn)。研究表明MSC在組織損傷[1]、自身免疫病[2]、移植物抗宿主病[3]等疾病中的應(yīng)用可以獲得較好的效果。迄今為止，對(duì)于MSC在腫瘤性疾病中的作用卻存在較大的爭議。有學(xué)者研究了MSC對(duì)血液來源及非血液來源的腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果仍是尚無定論[4- 5]。既往研究顯示MSC在體內(nèi)和體外都可以促進(jìn)正常的造血干祖細(xì)胞向髓系細(xì)胞和淋巴系細(xì)胞分化[6- 7]。研究顯示，MSC在體外能夠促進(jìn)HL- 60細(xì)胞分化，但作用機(jī)制不明[8]。HL- 60細(xì)胞來源于急性髓系白血病M2亞型，而臨床上唯一進(jìn)行誘導(dǎo)分化治療的白血病為M3亞型，即急性早幼粒細(xì)胞白血病[9]。本研究采用人臍帶來源的MSC(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，UC-MSC)和急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系NB4細(xì)胞探討MSC對(duì)其分化的影響及其機(jī)制。

材料和方法

材料全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)、硝基四唑氮藍(lán)(nitroblue tetrazolium，NBT)、佛波酯從Sigma-Aldrich公司購買；PE標(biāo)記的CD11b和CD14抗體從BD公司購買；白介素(interleukin，IL)- 6Ra的中和抗體從R&D公司購買；重組人IL- 6從 Peprotech公司購買。

UC-MSC的分離培養(yǎng)及白血病細(xì)胞的培養(yǎng)UC-MSC知情同意后從婦產(chǎn)醫(yī)院分娩附屬組織臍帶中獲取，分離、體外擴(kuò)增及鑒定同文獻(xiàn)[10]。NB4細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室液氮凍存，復(fù)蘇后用含有10%胎牛血清，雙抗(青霉素100 IU/ml、鏈霉素100 μg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。共培養(yǎng)體系在6孔板中建立，共分4個(gè)組：NB4單獨(dú)培養(yǎng)組；NB4+UC-MSC組；NB4+10 nmol ATRA組；NB4+UC-MSC+10 nmol ATRA組。UC-MSC增殖達(dá)到80%融合狀態(tài)時(shí)給予30 Gy劑量銫源照射，其后NB4細(xì)胞以105/ml濃度接種。

NB4細(xì)胞的分化狀態(tài)鑒定通過細(xì)胞形態(tài)、NBT還原實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞表面分化抗原CD11b和CD14的檢測(cè)評(píng)價(jià)NB4細(xì)胞的分化狀態(tài)。甩片機(jī)(cytospin 4)將2×105個(gè)NB4細(xì)胞甩至載玻片上，瑞氏-吉姆薩染色，取2×105個(gè)HL- 60細(xì)胞于cytospin 4細(xì)胞離心涂片機(jī)(thermo)甩片，待玻片自然晾干后滴加瑞氏-吉姆薩染色20 min，流水沖洗1 min，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并照相；通過NBT還原實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)過氧化物生成情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，2×105個(gè)NB4細(xì)胞懸于0.5 ml PBS中，加入NBT溶液(1 mg/ml)和佛波酯(200 ng/ml)37℃作用60 min，取細(xì)胞懸液涂片，番紅-O染色，隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中含有藍(lán)紫色斑的陽性細(xì)胞，計(jì)算陽性比例；培養(yǎng)48 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)膜表面分化標(biāo)志CD11b 和 CD14進(jìn)行定量，每個(gè)檢測(cè)管細(xì)胞量大約5×105個(gè)，用PBS洗1次，加入熒光標(biāo)記CD11b抗體或CD14及其同型對(duì)照抗體，置4℃標(biāo)記45 min，PBS洗1次；上LSRⅡ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測(cè)。

細(xì)胞周期分析NB4細(xì)胞以1×105/ml濃度培養(yǎng)于6孔板中，48 h后收集細(xì)胞。70%濃度冷乙醇固定24 h后加入50 μg/ml RNA酶 A 37℃孵育30 min，最后加入50 mg/ml碘化丙啶染色后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)碘化丙啶熒光強(qiáng)度。利用MODFIT軟件分析細(xì)胞周期。

Transwell實(shí)驗(yàn)在6孔板中進(jìn)行，0.4 μm孔徑的隔膜將培養(yǎng)孔分為上下兩個(gè)小室，UC-MSC培養(yǎng)于下室，30 Gy照射UC-MSC后，上室加入5×105個(gè)NB4細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后，收集腫瘤細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)膜表面CD11b的陽性率。

ELISA檢測(cè)IL- 6濃度收集無細(xì)胞培養(yǎng)上清-80℃保存。人IL- 6檢測(cè)ELISA試劑盒從Neobioscience公司購買，按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～5次，其中ELISA檢測(cè)各研究組設(shè)兩個(gè)平行孔(即復(fù)孔)，其余實(shí)驗(yàn)均為單孔。以至少3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。單因素方差(One-Way ANOVA)分析方法比較各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

UC-MSC促進(jìn)NB4細(xì)胞向粒系分化成熟細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，觀察細(xì)胞形態(tài)改變并進(jìn)行NBT還原實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)48 h檢測(cè)CD11b和CD14的表達(dá)，結(jié)果顯示NB4+UC-MSC組的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)分化跡象，NB4+UC-MSC+ATRA組的細(xì)胞呈現(xiàn)更加成熟的形態(tài)，桿狀核細(xì)胞增多，甚至偶有分葉核粒細(xì)胞；NBT還原實(shí)驗(yàn)中，UC-MSC及ATRA分別可以產(chǎn)生少量陽性反應(yīng)細(xì)胞，當(dāng)二者同時(shí)作用時(shí)，NBT陽性反應(yīng)的細(xì)胞明顯增多(圖1)。與對(duì)照組CD11b基礎(chǔ)表達(dá)(4.35±2.29)%相比，UC-MSC上調(diào)NB4細(xì)胞表面CD11b表達(dá)至(30.70±1.97)%(P=0.001)，兩者同時(shí)應(yīng)用上調(diào)CD11b陽性率為(65.50±9.02)%，顯著高于ATRA單獨(dú)應(yīng)用組(38.03±8.67)% (P=0.001)。而CD14的陽性率一直低于3%，因此NB4細(xì)胞是向粒細(xì)胞分化，而不是向單核細(xì)胞分化。

UC-MSC促使NB4細(xì)胞周期出現(xiàn)G0/G1期阻滯細(xì)胞培養(yǎng)48 h后進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)分析顯示，UC-MSC和ATRA分別使G0/G1期細(xì)胞所占比例增高，當(dāng)兩者同時(shí)應(yīng)用時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例相對(duì)更為增高。在NB4細(xì)胞G0/G1細(xì)胞周期阻滯的同時(shí)，伴有S期細(xì)胞比例的降低，G2/M期細(xì)胞比例變化無明顯趨勢(shì)(圖2)。

UC-MSC通過分泌可溶性因子發(fā)揮促進(jìn)NB4細(xì)胞分化的作用為了明確UC-MSC是通過可溶性細(xì)胞因子還是細(xì)胞直接接觸發(fā)揮作用的，進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，UC-MSC培養(yǎng)在下層小室，NB4細(xì)胞培養(yǎng)在上層小室。細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，NB4+UC-MSC直接接觸組陽性率為(29.35±2.21)%，Transwell組陽性率為(26.35±6.57)% (P=0.614)；NB4+UC-MSC+ATRA直接接觸組陽性率為(67.18±10.77)%，Transwell組陽性率為(65.23±10.18)% (P=0.742)。Transwell組的UC-MSC可以有效上調(diào)CD11b的表達(dá)，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

UC-MSC通過分泌IL- 6誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化ELISA測(cè)定共培養(yǎng)上清中的粒系集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)和IL- 6因子濃度均有顯著升高。然而，使用 G-CSF 中和抗體或吲哚美辛阻斷 PGE2 的合成，并不能減弱 CD11b 的表達(dá)。將50 μg/ml的IL- 6Ra中和抗體加入共培養(yǎng)體系阻斷IL- 6與其受體結(jié)合，48 h后檢測(cè)CD11b表達(dá)情況，結(jié)果顯示IL- 6Ra中和抗體可以減弱CD11b的上調(diào)(圖3A)。在培養(yǎng)體系中加入外源性重組人IL- 6 (50 ng/ml)，48 h后再次檢測(cè)CD11b陽性率，IL- 6明顯上調(diào)分化抗原CD11b的表達(dá) (圖3B)，并使NB4細(xì)胞形態(tài)學(xué)上出現(xiàn)分化特征(圖3C)。由于共培養(yǎng)體系中IL- 6濃度上調(diào)，阻斷IL- 6作用可以逆轉(zhuǎn)分化抗原的表達(dá)，外源性IL- 6上調(diào)分化抗原的表達(dá)。

UC-MSC：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；ATRA：全反式維甲酸

UC-MSC：umbilical cord-derived mesenchymal stem cells；ATRA：all-trans retinoic acid

A. 共培養(yǎng)72 h后瑞氏-吉姆薩染色；B. 共培養(yǎng)72 h后硝基四唑氮藍(lán)還原實(shí)驗(yàn)

A. Wright-Giemsa staining after 72 hours of co-culture；B. nitrablue tetrazolium reduction test after 72 hours of co-culture

圖 1UC-MSC與NB4細(xì)胞共培養(yǎng)后檢測(cè)NB4細(xì)胞分化狀態(tài)

Fig 1Evaluation of the differentiation status of NB4 cells after co-culture with UC-MSC

圖 2UC-MSC與NB4細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞周期變化

Fig 2Cell cycle analysis of NB4 cells after co-culture with UC-MSC

IL- 6：白介素- 6

IL- 6：interleukin- 6

A. 共培養(yǎng)體系中加入IL- 6Ra，48 h后檢測(cè)CD11b的表達(dá)；B. NB4細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)體系中加入外源性重組IL- 6，48 h后檢測(cè) CD11b表達(dá)；C. NB4細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)體系中加入外源性重組IL- 6，48 h后瑞氏-吉姆薩染色

A. CD11b detection when the IL- 6Ra was added to the co-culture system for 48 hours；B. CD11b analysis of NB4 cells when they were treated with exogenous recombinant IL- 6 for 48 hours；C. Wright-Giemsa staining of NB4 cells when they were treated with exogenous recombinant IL- 6 for 48 hours

圖 3IL- 6介導(dǎo)UC-MSC誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化的作用

Fig 3Differentiation induction of NB4 cells by UC-MSC is mediated by IL- 6

討論

研究顯示間充質(zhì)干細(xì)胞在多種疾病中具有治療潛力和應(yīng)用前景，尤其是組織損傷和免疫紊亂相關(guān)疾病。然而，其在惡性腫瘤中的作用存在很大爭議，近年來的相關(guān)文獻(xiàn)主要報(bào)道了MSC對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響[4- 5]，研究結(jié)果也不盡一致。

本研究顯示臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可以在體外誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系NB4細(xì)胞向粒系終末分化，并且和小劑量的ATRA同時(shí)應(yīng)用，作用聯(lián)合增強(qiáng)。UC-MSC在誘導(dǎo)分化的同時(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象，這是與ATRA的作用機(jī)制存在的共同點(diǎn)[11]。

本研究顯示共培養(yǎng)體系中IL- 6濃度上調(diào)，阻斷IL- 6作用可以逆轉(zhuǎn)分化抗原的表達(dá)，外源性IL- 6上調(diào)分化抗原的表達(dá)，表明IL- 6介導(dǎo)UC-MSC對(duì)NB4細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。IL- 6Ra中和抗體部分逆轉(zhuǎn)了UC-MSC上調(diào)CD11b的效應(yīng)，但并沒有完全逆轉(zhuǎn)。原因可能是IL- 6Ra中和抗體并不能完全阻斷IL- 6的作用，也可能IL- 6不是發(fā)揮作用的唯一因子，也許還有其他的某些可溶性因子同時(shí)發(fā)揮作用。文獻(xiàn)報(bào)道，G-CSF[12- 13]和PGE2[14]可以增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)的早幼粒白血病細(xì)胞的分化作用。本研究同時(shí)對(duì)這兩種因子進(jìn)行了檢測(cè)并分析，結(jié)果顯示G-CSF和PGE2并不參與介導(dǎo)UC-MSC的誘導(dǎo)分化作用。

綜上，本研究顯示UC-MSC可以誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞向粒系終末分化，并且和小劑量的ATRA同時(shí)應(yīng)用時(shí)，作用聯(lián)合增強(qiáng)。本研究不僅從細(xì)胞分化的角度進(jìn)一步闡明了MSC與腫瘤細(xì)胞的相互作用，并且為MSC的潛在應(yīng)用價(jià)值提供了理論依據(jù)。

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Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells Secrete Interleukin- 6 to Influence Differentiation of Leukemic Cells

CHEN Fang，MA Feng-xia，LI Yang，XU Fang-yun，CHI Ying，LU Shi-hong，HAN Zhong-chao

State Key Laboratory of Experimental Hematology，Institute of Hematology and Hospital of Blood Diseases，CAMS and PUMC，Tianjin 300020，China

ABSTRACT：ObjectiveTo investigate the effect of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UC-MSC) on the differentiation of leukemic cells. MethodThe co-culture system of UC-MSC with acute promyelocytic leukemic cell line NB4 cells was constructed in vitro，and the differentiation status of the leukemic cells was assessed by cell morphology，nitroblue tetrazolium reduction test，and cell surface differentiation marker CD11b. ResultsUC-MSC induced the granulocytic differentiation of NB4 cells. When UC-MSC and a small dose of all-trans retinoic acid were applied together，the differentiation-inducing effect was enhanced in an additive manner. Interleukin (IL)- 6Ra neutralization attenuated differentiation and exogenous IL- 6-induced differentiation of leukemic cells. ConclusionUC-MSC can promotd granulocytic differentiation of acute promyelocytic leukemia cells by way of IL- 6 and presented additive effect when combined with a small dose of all-trans retinoic acid.

Key words：mesnchymal stem cells；acute promyelocytic leukemia；NB4；differentiation；interleukin- 6

(收稿日期：2015- 04- 23)

Corresponding author：HAN Zhong-chaoTel：022- 23909186，E-mail：hanzhongchao@hotmail.com

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.02.007

中圖分類號(hào):R557+.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào)：1000- 503X(2016)02- 0164- 05

通信作者：韓忠朝電話：022- 23909186，電子郵件：hanzhongchao@hotmail.com

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2011CB964802)、國家自然科學(xué)基金 (81500098)和國家科技支撐計(jì)劃 (2013BAI01B09) Supported by the National Basic Research Program of China (973 Program) (2011CB964802)，National Natural Sciences Foundation of China (81500098)，and National Key Technology R&D Program(2013BAI01B09)