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三陰性裸鼠乳腺癌模型的構(gòu)建及熱層析檢測

2016-05-25 07:45霍慧萍霍建彬萬文博李俊來
關(guān)鍵詞:動物模型

霍慧萍,霍建彬,萬文博,李俊來

1中國人民解放軍總醫(yī)院南樓超聲診斷科,北京 100853

2內(nèi)蒙古巴彥淖爾市臨河區(qū)人民醫(yī)院保健科,內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000

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·論著·

三陰性裸鼠乳腺癌模型的構(gòu)建及熱層析檢測

霍慧萍1,霍建彬2,萬文博1,李俊來1

1中國人民解放軍總醫(yī)院南樓超聲診斷科,北京 100853

2內(nèi)蒙古巴彥淖爾市臨河區(qū)人民醫(yī)院保健科,內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000

摘要:目的利用標(biāo)記了熒光素酶和綠色熒光蛋白的人乳腺癌MDA-MB- 231細(xì)胞系建立乳腺癌裸鼠移植瘤模型,用熱層析成像儀聯(lián)合超聲對早期微小腫瘤進(jìn)行檢測。方法采用轉(zhuǎn)染了慢病毒載體的人三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB- 231,經(jīng)傳代培養(yǎng)后接種于BALB/C裸鼠的左肩胛部皮下、右側(cè)第4對乳房墊下及尾靜脈注射,利用熱層析成像儀和超聲儀在腫瘤生長早期進(jìn)行檢測,并用小動物活體成像儀監(jiān)測腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長情況。結(jié)果成功構(gòu)建了三陰性乳腺癌裸鼠皮下、原位移植瘤及轉(zhuǎn)移癌模型。利用熱層析成像儀和超聲儀同時檢測微小腫瘤,熱層析成像儀對微小腫瘤的檢出要早于超聲檢出。結(jié)論熱層析成像儀可以較早期地監(jiān)測到腫瘤的生長變化,探測到異常組織,有望為人類早期乳腺癌的篩查提供一個方便、快捷、靈敏和可靠的檢查手段。

關(guān)鍵詞:三陰性乳腺癌;動物模型;熱層析成像儀系統(tǒng);小動物活體成像系統(tǒng)

ActaAcadMedSin,2016,38(2):198-204

三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是指雌激素受體、孕激素受體和人原癌基因Her- 2均陰性表達(dá)的乳腺癌[1- 3]。雖然TNBC的發(fā)病率不及其他亞型乳腺癌,但因其侵襲性較強(qiáng)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險較高、臨床預(yù)后極差、死亡風(fēng)險較高,故而引起腫瘤學(xué)家們的廣泛關(guān)注[1,4- 5]。盡可能在早期發(fā)現(xiàn)并積極治療是改善預(yù)后、提高生存率的關(guān)鍵[6- 7]。為研究乳腺癌發(fā)生發(fā)展早期的生物學(xué)特性,探討其診斷及治療的有效措施,建立仿真活體動物模型有重要的意義[8]。因此,在裸鼠體內(nèi)建立早期人TNBC動物模型,可以深入研究TNBC細(xì)胞系在動物體內(nèi)的發(fā)展過程及生物學(xué)行為,符合人體腫瘤特征,具有良好的可重復(fù)性,為研究該疾病早期檢測和治療提供理論依據(jù)[9- 10]。熱層析成像技術(shù)是近年影像醫(yī)學(xué)發(fā)展起來的一項新技術(shù),通過探測生物體內(nèi)部熱分布信息來靈敏的感知疾病在體內(nèi)的發(fā)生發(fā)展過程,從而提供疾病診斷線索和鑒別診斷依據(jù)[11- 12]。熱層析成像技術(shù)將形態(tài)影像學(xué)和功能影像學(xué)信息集成于一體,提供盡可能多的影像學(xué)信息用于醫(yī)學(xué)分析和研究[13- 17]。本研究利用熱層析成像技術(shù)對成瘤裸鼠進(jìn)行早期檢測,觀察乳腺癌發(fā)生早期的生長狀況,探討乳腺癌細(xì)胞在生物體內(nèi)的生長趨勢及其特征,并與目前我國常用的超聲篩查手段進(jìn)行比較,以期發(fā)現(xiàn)更小、更早期的乳腺癌病變,從而為TNBC的早期檢測提供可靠、靈敏、便捷的新的檢查方式。

材料和方法

材料轉(zhuǎn)染了慢病毒載體的人三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB- 231(標(biāo)記為MDA-MB- 231-GFP-luc)購自中國人民解放軍總醫(yī)院腫瘤中心實(shí)驗室。BALB/C裸鼠購自北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司(No.11400700097297),實(shí)驗動物倫理申請批號 2015-X10- 24。選用雌性,無特定病原體級實(shí)驗動物17只,4~6周齡,體質(zhì)量16~20 g,飼養(yǎng)于中國人民解放軍總醫(yī)院層流無菌國標(biāo)免疫缺陷動物房。DMEM、1640培養(yǎng)液、PBS緩沖液、青霉素、鏈霉素及胎牛血清購自Gibco (China)公司;熒光素酶底物購自北京冷泉港生物科技有限公司。中國武漢昊博科技有限公司自主研發(fā)的熱層析成像儀(HB-T- 2A型,探測器的光譜響應(yīng)波長范圍:8~14 μm,測溫范圍:20℃~40℃);超聲儀(PHILIPS,CX50,Epiq 7,西雅圖,美國),倒置熒光顯微鏡(Ocean Optics Corporation,USA)、小動物活體成像儀(Xenogen IVIS200 imaging spectrum system,USA)。

細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及傳代嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。遵從“速溶慢凍”的實(shí)驗原則,將凍存的MDA-MB- 231-GFP-luc細(xì)胞按照操作規(guī)程逐步提取、離心、培養(yǎng)。將傳代2次的MDA-MB- 231-GFP-luc細(xì)胞在其對數(shù)生長期細(xì)胞用計數(shù)器計數(shù),得到細(xì)胞濃度為5×107個/ml 的細(xì)胞懸液共2.5 ml,經(jīng)錐蟲藍(lán)染色測定活細(xì)胞數(shù)>95%。

動物接種將裸鼠分為4組,隨機(jī)選取2只為對照組,不做任何處理,另外15只隨機(jī)分為3組,每組各5只,1組為皮下瘤模型組,于右側(cè)肩胛近腋窩處皮下接種MDA-MB- 231-GFP-luc細(xì)胞懸液,150 μl/只;2組為原位瘤模型組,于右側(cè)第四對乳房墊下接種細(xì)胞懸液,150 μl/只。3組為轉(zhuǎn)移瘤模型組,尾靜脈注射細(xì)胞懸液,150 μl/只。每組小鼠分籠飼養(yǎng),專用鼠糧紫外線消毒處理,飲用去離子純凈水。4組小鼠分別用不同顏色涂料在其耳朵上標(biāo)記并打耳標(biāo)加以區(qū)分。

熱層析、超聲及小動物活體成像儀檢測為關(guān)注乳腺癌發(fā)生初期的腫瘤代謝特征,在注射癌細(xì)胞的次日起每天進(jìn)行監(jiān)測,采用武漢昊博公司生產(chǎn)的近紅外熱層析成像儀、超聲儀及小動物活體成像儀監(jiān)測癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的存活狀態(tài)。每只裸鼠腹腔注射20 mg/ml的熒光素酶底物熒光素酶報告基因150 μl,10~15 min內(nèi)用美國小動物活體熒光成像儀活體成像系統(tǒng)(IVIS200)進(jìn)行活體成像,隨后分別進(jìn)行熱層析和超聲檢查。接種第2天起每天監(jiān)測裸鼠的各項體征及接種部位的變化,于第5天起,實(shí)驗組皮下及原位瘤模型組小鼠肉眼觀察到其接種部位外觀略有變化,并用手感覺到有小顆粒狀硬結(jié),對照組及轉(zhuǎn)移瘤模型組無變化。此時用熱層析檢測可見腫瘤部位有異常表現(xiàn),隨后用超聲檢查,未見異常發(fā)現(xiàn)。

結(jié)果

BALB/C裸鼠皮下瘤模型的建立MDA-MB- 231-GFP-luc細(xì)胞懸液150 μl接種到裸鼠右側(cè)肩胛近腋窩處,觀察至第7天時肉眼可見局部微微隆起的小腫物,用手輕觸感覺到有小顆粒狀硬結(jié),活動度差。腹腔內(nèi)注射20 mg/ml的熒光素酶底物150 μl,注射10~15 min內(nèi)用IVIS200進(jìn)行活體成像,腫瘤部位已有較強(qiáng)的熒光信號,腫瘤部位熒光圖像可見彩虹樣熒光標(biāo)志。待實(shí)驗全程結(jié)束觀察完畢后處死裸鼠,取病理標(biāo)本做HE染色,顯示細(xì)胞核異型,濃染,細(xì)胞排列紊亂,可見癌株及癌巢(圖1)。

BALB/C裸鼠原位瘤模型的建立采用與皮下瘤模型同樣的方法接種裸鼠右側(cè)第4對乳頭下方乳墊區(qū),觀察至第5天時肉眼可見局部微微隆起的小腫物,用手輕觸感覺到有小顆粒狀硬結(jié),活動度差。小動物活體熒光成像可見腫瘤部位呈彩虹樣熒光標(biāo)志。待實(shí)驗完畢后取病理標(biāo)本HE染色示細(xì)胞核異型,濃染,細(xì)胞排列紊亂(圖2)。

A.皮下荷瘤裸鼠模型白光圖;B. 熒光素酶報告基因與轉(zhuǎn)染了慢病毒的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB- 231-GFP-luc反應(yīng)后的活體生物熒光成像圖;C.裸鼠乳腺癌病理HE染色(×40)

A. photo of a subcutaneous tumor-bearing nude mouse model;B.invivoimaging system fluorescence imaging of luciferase substrate reacted with transfection of the slow virus breast cancer cells MDA-MB- 231-GFP-luc;C. pathological HE staining of breast cancer in nude mice(×40)

圖 1皮下荷瘤裸鼠模型

Fig 1Subcutaneous tumor-bearing nude mouse model

A. 原位荷瘤裸鼠模型白光圖;B. 熒光素酶報告基因與轉(zhuǎn)染了慢病毒的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB- 231-GFP-luc反應(yīng)后的活體生物熒光成像圖;C.裸鼠乳腺癌病理HE染色(×40)

A. photo of the orthotopic tumor-bearing nude mouse model;B.invivoimaging system fluorescence imaging of luciferase substrate reacted with transfection of the slow virus breast cancer cells MDA-MB- 231-GFP-luc;C. pathological HE staining of breast cancer in nude mice(×40)

圖 2原位荷瘤裸鼠模型

Fig 2Orthotopic tumor-bearing nude mouse model

BALB/C裸鼠轉(zhuǎn)移癌模型的建立MDA-MB- 231-GFP-luc細(xì)胞懸液150 μl于裸鼠尾靜脈緩慢注射。小動物活體成像儀連續(xù)觀察腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移種植情況,用手觸及始終未摸到腹腔腫物,用熱層析及超聲也未能檢測到異常信號,于第10天時,小動物活體熒光成像儀于腹腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)多處熒光信號,在熒光信號引導(dǎo)下剖腹探查區(qū)病理組織,同時取周圍未見熒光信號的組織做HE染色,病理切片可見熒光信號處細(xì)胞排列紊亂,核異型,可見核溝,核濃染(圖3)。

熱層析檢測及超聲檢測結(jié)果在乳腺癌細(xì)胞接種后每天進(jìn)行熱層析及超聲檢測,同時用小動物活體熒光成像儀觀察腫瘤細(xì)胞是否在裸鼠體內(nèi)存活生長。于第5天起,熱層析在裸鼠皮下及原位模型中可檢測到異常熱圖,腫瘤部位明顯異常于正常組織部位,同時用超聲設(shè)備尚不能夠很好地顯示腫瘤結(jié)節(jié)。此時用電子游標(biāo)卡尺測量腫瘤平均直徑僅為2.8 mm。熱層析顯像雖然可以顯示出腫瘤部位與周圍正常組織有所差異,但是未能如理論推測顯示為高溫區(qū),即腫瘤部位較周圍正常組織溫度升高,而是顯示為低溫區(qū)。在給裸鼠進(jìn)行熱層析監(jiān)測時為了不影響其基礎(chǔ)體溫及病變部位的原始溫度,特意未給裸鼠運(yùn)用任何氣、液麻藥。連續(xù)觀察至第9天時,熱層當(dāng)腫瘤直徑達(dá)5 mm以上時超聲方可探及異常聲像圖(圖4)。

病理檢測結(jié)果當(dāng)連續(xù)觀察完腫瘤早期發(fā)生發(fā)展情況后,對每一只裸鼠進(jìn)行斷頸處死,取組織病理標(biāo)本進(jìn)行HE染色。對腹腔轉(zhuǎn)移瘤標(biāo)本進(jìn)行剖腹探查,在熒光顯像處及正常部位均取組織標(biāo)本做病理染色。病理切片可見熒光信號處細(xì)胞排列紊亂、密集,核異型,可見核溝,核濃染(圖5)。

A.裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌模型白光圖;B.熒光素酶報告基因與轉(zhuǎn)染了慢病毒的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB- 231-GFP-luc反應(yīng)后的活體生物熒光成像圖;C.裸鼠乳腺癌腹腔轉(zhuǎn)移灶病理HE染色(×40)A. photo of the peritoneal metastasis model of nude mice;B. luciferase reporter gene and transfection of the slow virus breast cancer cells MDA-MB- 231-GFP-luc after reactioninvivobiological fluorescence imaging;C. pathological HE staining of peritoneal metastasis of breast cancer in nude mice(×40)

圖 3裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌模型

Fig 3Peritoneal metastasis model of nude mice

上圖:接種癌細(xì)胞后連續(xù)觀察至第5天熱層析可見異常表現(xiàn);下圖:超聲連續(xù)觀察至第9天可見異常聲像圖(箭頭)

up:after inoculation of cancer cells for fifth consecutive days,thermal tomography showed abnormal performance;down:ninth days of ultrasound can detect abnormal sonographic image (arrow)

圖 4腫瘤生長早期的熱層析及超聲表現(xiàn)

Fig 4Thermal tomography and ultrasound findings in early stage of cancer

A.同一只裸鼠的皮下瘤模型;B.熱層析成像圖;C.HE病理染色乳腺癌細(xì)胞浸潤(×40)A. the same nude mouse subcutaneous tumor model;B. thermal tomography;C. pathological staining of breast cancer cells by HE staining (×40)

圖 5荷瘤裸鼠的熱層析對照及病理驗證

Fig 5Thermal tomography and pathology of tumor bearing nude mice

討論

乳腺癌動物模型的建立為研究人類乳腺癌的預(yù)防、發(fā)生、診斷及治療發(fā)揮重要的作用[18- 19]。本研究在實(shí)驗組皮下及原位模型成功率較高,達(dá)到100%,而轉(zhuǎn)移瘤模型成功率較低,一方面是由于BALB/C裸鼠缺少胸腺,為T細(xì)胞免疫缺陷動物,體液免疫降低但并不完全喪失,而尾靜脈內(nèi)注射癌細(xì)胞后由于存在部分體液免疫,部分癌細(xì)胞被體液免疫所破壞,所以成瘤率略低;另一方面,癌細(xì)胞數(shù)目也是決定成瘤率的重要因素,細(xì)胞濃度過高會造成血管或心臟栓塞,造成小鼠死亡??蒲泄ぷ髡弑仨氄莆崭鞣N模型的建模要點(diǎn),根據(jù)實(shí)驗設(shè)計及研究終點(diǎn)選擇適當(dāng)?shù)哪P蚚20- 22],優(yōu)化動物模型的制作思路[23- 24],從而研制出更能真實(shí)客觀模擬人類癌癥特點(diǎn)的模型,使其與人類腫瘤的生物學(xué)、組織學(xué)特性越來越接近,乳腺癌的動物模型才會更具科學(xué)價值[25- 27]。

熱層析圖在腫瘤生長早期即可探測到其變化[28],可以較早期地顯示出腫瘤部位與周圍正常組織的差異,而且較臨床中常用的超聲篩查乳腺病變方法靈敏度提高,因此有進(jìn)一步的研究和探索價值。本研究對同一種動物模型進(jìn)行雙模態(tài)檢測,比較哪種檢測手段更能夠接近事實(shí),以最終的病理和動態(tài)的小動物活體成像儀驗證其可靠性。為更好地模擬人類乳腺癌細(xì)胞在活體內(nèi)的生物學(xué)行為,本研究選用缺少胸腺的部分性免疫缺陷裸鼠作為活體載體,該裸鼠不具有T細(xì)胞免疫功能,但具有略微降低了的體液免疫功能,同時選用人類三陰性乳腺癌細(xì)胞,以期讓該細(xì)胞在活體內(nèi)生長擴(kuò)增,展示其特異性的侵襲性生物學(xué)行為,雖然不能夠完全模擬人類乳腺癌細(xì)胞在具有正常免疫功能的人體內(nèi)的生長狀況,但只能是盡可能的接近活體模擬狀態(tài)。在癌細(xì)胞懸液接種到裸鼠體內(nèi)后,前3 d活細(xì)胞量由于生長環(huán)境改變、培養(yǎng)基缺失、營養(yǎng)不足等因素大部分會死掉,3 d以后有細(xì)小的毛細(xì)血管開始爬入進(jìn)行營養(yǎng)供應(yīng),使得部分存活細(xì)胞得以繼續(xù)生長繁殖[29]。在細(xì)胞擴(kuò)增的過程中,給予連續(xù)性的監(jiān)測,一種手段是臨床中常用的超聲設(shè)備,另一種手段是新開發(fā)研制的高靈敏度熱層析檢測儀,對比哪種方法能更早期地捕捉到腫瘤的生長變化,研究結(jié)果顯示,熱層析系統(tǒng)可以在細(xì)胞接種第5天,即經(jīng)過活細(xì)胞量驟減的前3天后,存留活細(xì)胞在生物體內(nèi)得到新的血液供應(yīng)的第2天開始就可以觀察到不同于周圍正常組織的細(xì)微變化,而在繼續(xù)連續(xù)監(jiān)測到第9天時,熱層析的腫瘤圖像持續(xù)變大,超聲圖像才可以觀察到腫瘤形態(tài)結(jié)構(gòu)顯像。因此,熱層析系統(tǒng)在腫瘤的早期檢測方面優(yōu)于超聲。本研究未能顯示腫瘤部位為高溫區(qū),即腫瘤部位較周圍正常組織溫度升高,而是顯示為低溫區(qū),究其原因,可能由于裸鼠皮膚較薄,體表無保溫層,皮下無脂肪組織,腫瘤種植于皮下后突出皮膚較明顯,惡性腫瘤的溫度散失較明顯;加之超凈臺中風(fēng)機(jī)影響,腫瘤區(qū)溫度未能完全模擬人乳腺癌的本質(zhì),造成腫瘤區(qū)溫度較低。

綜上,本研究采用小動物活體熒光成像儀進(jìn)行協(xié)助建模,較之前常用的實(shí)驗動物方法,即在每一個時間點(diǎn)對其進(jìn)行處死取材進(jìn)行病理驗證有了極大改善,可以連續(xù)對同一只裸鼠進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測,這樣更加合理、客觀、真實(shí)地反映腫瘤細(xì)胞的動態(tài)發(fā)生發(fā)展過程。熱層析系統(tǒng)可以在細(xì)胞接種后連續(xù)觀察至第5天開始就可以觀察到不同于周圍正常組織的細(xì)微變化,繼續(xù)監(jiān)測至第9天時,熱層析圖像的腫瘤持續(xù)變大,此時超聲圖像才可以觀察到腫瘤形態(tài)結(jié)構(gòu)顯像。因此,熱層析系統(tǒng)在腫瘤的早期檢測方面優(yōu)于超聲。在接下來的實(shí)驗中,將進(jìn)一步探討更能模擬人乳腺癌細(xì)胞在較厚的皮下脂肪層內(nèi)的發(fā)生發(fā)展過程,力求制作出仿真動物模型,將新型熱層析成像系統(tǒng)的科學(xué)作用發(fā)揮出來,為人類乳腺癌的相關(guān)研究提供更加可靠、方便、快捷、靈敏的診療手段。

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Construction of Nude Mouse Model of Triple Negative Breast Cancer and Value of Thermal Tomography

HUO Hui-ping1,HUO Jian-bin2,WAN Wen-bo1,LI Jun-lai1

1Department of South Building Ultrasound,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China2Department of Health,Inner Mongolia Bayinnaoer City Linhe People’s Hospital,Bayannur,Inner Mongolia 015000,China

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the early detection of breast cancer by ultrasonic imaging and thermal tomography of luciferase or green fluorescent protein (GFP)-labeled MDA-MB- 231 breast cancer cell line-xenografts in nude mice. MethodsFluorescence-tagged lentiviral vectors were transfected into the triple-negative breast cancer cell line MDA-MB- 231. These cells were implanted either subcutaneously under the right breast pad or intravenously into the tail vein of nude BALB/C mice. Thermal tomography and ultrasound imaging were used to detect tumor formation and to monitor tumor growth and metastasis in vivo.ResultsTriple negative breast cancer cell line-xenografts were used to successfully construct an orthotopic nude mice model of breast cancer metastasis in the peritoneum. Thermal tomography and ultrasound imaging were used together to detect small tumors. Thermal tomography imaging detected small tumors earlier than ultrasound imaging. ConclusionsThermal tomography can be used to monitor changes in tumor growth and detect abnormal tissue. Therefore,it can serve as a convenient,rapid,sensitive,and reliable technique for early screening of human breast cancer.

Key words:triple negative breast cancer;animal model;thermal tomography imaging system;in vivo imaging spectrum system

(收稿日期:2015- 12- 11)

Corresponding author:LI Jun-laiTel:010- 66876050,E-mail:li_jl@yeah.net

DOI:10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.02.013

中圖分類號:R445.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1000- 503X(2016)02- 0198- 07

通信作者:李俊來電話:010- 66876050,電子郵件:li_jl@yeah.net

基金項目:科技部國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(2012YQ1020304)Supported by the National Major Scientific Equipment Development Program (2012YQ1020304)

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