蘇軍紅， 徐曉臣， 王英杰， 趙冉冉

(1邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，邯鄲　056002； 2邯鄲市第一醫(yī)院急診科； *通訊作者，E-mail:15830404276@163.com)

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原花青素對(duì)血管性認(rèn)知功能障礙大鼠腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

蘇軍紅1， 徐曉臣1， 王英杰1， 趙冉冉2*

(1邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，邯鄲056002；2邯鄲市第一醫(yī)院急診科；*通訊作者，E-mail:15830404276@163.com)

摘要：目的觀察原花青素(proanthocyanidins，PAC)對(duì)血管性認(rèn)知功能障礙(vascular cognitive impairment,VCI)大鼠認(rèn)知功能和腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和單胺氧化酶含量的影響。方法選取健康成年雄性Wistar大鼠48只，隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(sham)、血管性認(rèn)知功能障礙組(VCI)、低劑量原花青素組(L-PAC,100 mg/kg)和高劑量原花青素組(H-PAC,200 mg/kg)。雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)制備血管性認(rèn)知功能障礙模型，造模后每天灌胃給藥，給藥容量為2 ml，共給予28 d。Morris水迷宮檢測(cè)VCI大鼠認(rèn)知功能，水迷宮結(jié)束后取材，采用分光光度計(jì)檢測(cè)前腦皮層單胺氧化酶(monoamine oxidase, MAO)的含量，高效液相色譜儀法檢測(cè)大鼠前腦皮層去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)和多巴胺(doparmine,DA)的含量。結(jié)果與sham組相比較，VCI組大鼠前腦皮層中5-HT、NE和DA的含量均顯著下降(P<0.05)，MAO含量明顯升高(P<0.05)；與VCI組相比較，低劑量和高劑量PAC治療明顯增加VCI大鼠前腦皮層中NE、DA和5-HT的含量(P<0.05)，減少M(fèi)AO的含量(P<0.05)。結(jié)論原花青素能夠明顯提高VCI大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，能夠調(diào)節(jié)VCI大鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)。

關(guān)鍵詞：血管性認(rèn)知功能障礙；原花青素；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)

血管性認(rèn)知功能障礙(vascular cognitive impairment,VCI)由心、腦血管病引起，表現(xiàn)為認(rèn)知功能的下降，嚴(yán)重時(shí)表現(xiàn)為血管性癡呆。隨著人口老齡化的到來(lái)，心腦血管病的發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，醫(yī)療水平的提高使心腦血管疾病的生存率不斷升高，因此VCI病人數(shù)量迅速增長(zhǎng)，帶來(lái)了沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。目前臨床中尚缺乏能夠改善VCI認(rèn)知水平的特效藥物。目前研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激參與了血管性認(rèn)知功能障礙的發(fā)病過(guò)程，抗氧化劑通過(guò)減輕機(jī)體氧化應(yīng)激水平，具有改善血管性認(rèn)知功能障礙的作用。原花青素是優(yōu)良的自由基清除劑，在體內(nèi)具有強(qiáng)效抗氧化功能。既往已有研究發(fā)現(xiàn)，原花青素能夠改善阿爾茲海默模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，并顯著提高大鼠腦內(nèi)抗氧化酶的活性[1]。本研究通過(guò)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎制備血管性認(rèn)知功能障礙大鼠模型，觀察原花青素對(duì)血管性認(rèn)知功能障礙大鼠前腦皮層中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、單胺氧化酶含量的影響及對(duì)認(rèn)知功能的保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1藥品和主要試劑

原花青素(proanthocyanidins,PAC)由Sigma公司提供，去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)和多巴胺(doparmine,DA)標(biāo)準(zhǔn)品均由中國(guó)生物藥品制品檢定所提供，單胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和模型制備

健康雄性Wistar大鼠48只，體重250-290 g，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：假手術(shù)組(sham)、血管性認(rèn)知功能障礙組(VCI)、低劑量原花青素組(L-PAC)和高劑量原花青素組(H-PAC)，每組12只。腹腔注射10%水合氯醛麻醉動(dòng)物后，仰臥位固定，頸前區(qū)去毛并消毒，頸前正中縱行切開皮膚及皮下組織，鈍性分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈，套以絲線結(jié)扎近心端和遠(yuǎn)心端，從兩個(gè)結(jié)扎點(diǎn)間剪斷動(dòng)脈后縫合皮膚，放回籠中，嚴(yán)密觀察大鼠一般情況。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不阻斷血流。sham組和VCI組每日灌胃2 ml生理鹽水，L-PAC組和H-PAC組給予100 mg/kg和200 mg/kg PAC灌胃相應(yīng)劑量，每日1次，共28 d。

1.3Morris水迷宮試驗(yàn)

于實(shí)驗(yàn)第29天起行Morris水迷宮試驗(yàn)，第29-33天為定位航行試驗(yàn)，每日大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限順序分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入水中，記錄120 s內(nèi)大鼠爬上平臺(tái)花費(fèi)時(shí)間為逃避潛伏期，第34天為空間探索試驗(yàn)，將平臺(tái)撤去，記錄大鼠2 min內(nèi)停留在平臺(tái)所在象限的時(shí)間。

1.4高效液相色譜儀分析NE、DA、5-HT含量

Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后，大鼠以7%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉后，斷頭取腦，冰盤上快速分離前腦皮層組織，稱濕重，按1∶10(mg ∶μl)加入預(yù)冷的高氯酸，在冰浴中制備成10%勻漿，離心后取上清液，采用高效液相色譜儀分析各指標(biāo)含量。

1.5MAO檢測(cè)

Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后大鼠斷頭取腦，冰盤上快速分離前腦皮層組織，稱濕重后加冰生理鹽水制備成10%勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)步驟。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，逃避潛伏期數(shù)據(jù)應(yīng)用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，其余數(shù)據(jù)均應(yīng)用one-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與sham組相比較，VCI組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯縮短(P<0.05)；L-PAC組和H-PAC組分別與VCI組相比逃避潛伏期均明顯縮短(P<0.05)，目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05，見表1)。各組大鼠游泳速度無(wú)差異。

表1原花青素對(duì)Morris水迷宮成績(jī)的影響(s)

Table 1The effects of PAC on Morris water maze performance(s)

組別 逃避潛伏期Day29Day30Day31Day32Day33目標(biāo)象限停留時(shí)間sham組58.21±10.2150.45±10.2831.10±9.5120.48±9.4311.37±3.6327.07±5.12VCI組66.34±13.1254.67±12.4142.71±10.59*39.52±11.70*26.46±8.41*9.39±4.81*L-PAC組59.54±11.4552.46±10.3640.61±10.84#28.34±10.47#15.31±6.01#14.93±5.21#H-PAC組61.21±13.4349.89±10.4835.18±8.2926.71±7.5913.05±2.8222.65±6.84

與sham組比較，*P<0.05；與VCI組比較，#P<0.05

2.2原花青素對(duì)前腦皮層單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和MAO含量的影響

與sham組相比，VCI組大鼠前腦皮層內(nèi)NE、DA和5-HT的水平明顯降低(P<0.05)，MAO的含量顯著升高(P<0.05)；低劑量原花青素組和高劑量原花青素組均能明顯緩解血管性認(rèn)知功能障礙大鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的紊亂，明顯升高NE、DA和5-HT的含量(P<0.05)，并能使MAO的含量顯著升高(P<0.05)；低劑量原花青素組NE、DA、5-HT和MAO仍未達(dá)到對(duì)照組的正常水平，高劑量原花青素組各項(xiàng)指標(biāo)水平與sham組相比無(wú)顯著差異(見表2)。

3討論

血管性認(rèn)知功能障礙可由高血壓、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、吸煙等影響腦血流量等多種因素誘發(fā)[2]。VCI患者的主要臨床表現(xiàn)是學(xué)習(xí)和記憶功能的下降。由于VCI發(fā)病人數(shù)的上升，VCI已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)研究的前沿和熱點(diǎn)。近年來(lái)的研究表明，VCI的發(fā)病機(jī)制可能是由于氧化應(yīng)激、神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、促炎因子的釋放等多重因素導(dǎo)致神經(jīng)元和白質(zhì)的損害所致[3-5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后大鼠腦內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化性DNA損傷均明顯增加[6,7]?？寡趸锌赡苁茄苄哉J(rèn)知功能障礙的有效治療靶點(diǎn)[8]。

表2原花青素對(duì)前腦皮層NE、DA、5-HT和MAO含量的影響

Table 2Effects of PAC on levels of NE, DA, 5-HT and MAO in the forebrain cortex

組別 NE(ng/g)DA(ng/g)5-HT(ng/g)MAO[U/(h·mg)]Sham組312.11±19.53411.94±38.25433.17±31.5320.83±2.41VCI組183.27±10.81*253.51±18.90*218.51±14.66*38.21±3.73*L-PAC組 268.32±18.51*# 314.10±30.33*# 387.27±34.13*# 29.12±1.78*#H-PAC組299.80±19.56#420.20±31.28#420.33±31.48#18.38±1.39#

與sham組相比較，*P<0.05；與VCI組相比較，#P<0.05

目前研究認(rèn)為[9-12]，神經(jīng)遞質(zhì)與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)，膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的狀態(tài)與認(rèn)知密切相關(guān)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在學(xué)習(xí)、記憶過(guò)程中發(fā)揮了易化作用。5-HT是重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，與睡眠、情感、學(xué)習(xí)、記憶功能密切相關(guān)。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放是學(xué)習(xí)、記憶功能正常的基礎(chǔ)。腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的下降是認(rèn)知功能受損的典型特點(diǎn)[10]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，5-HT再攝取抑制劑藥物能有效改善動(dòng)物在Morris水迷宮中的表現(xiàn)，表明調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量具有改善認(rèn)知功能的作用[11]。

原花青素(PAC)是天然存在的多酚類化合物，廣泛存在于植物中，尤以葡萄籽中含量最高。PAC具有極強(qiáng)的抗氧化能力，也可清除體內(nèi)的活性氧自由基，其抗氧化能力是維生素的50倍。大量研究表明，PAC通過(guò)抗氧化能力具有神經(jīng)保護(hù)和抗衰老作用。既往研究證實(shí)，原花青素能夠改善阿爾茨海默和血管性癡呆大鼠的認(rèn)知功能[13]，但其具體機(jī)制還未明確。

本研究表明，通過(guò)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后，大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力明顯下降，血管性認(rèn)知功能障礙模型建立成功，原花青素干預(yù)4周后大鼠認(rèn)知功能得到明顯的改善，且改善作用與劑量相關(guān)；進(jìn)一步檢測(cè)大鼠皮前腦層中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量發(fā)現(xiàn)，VCI大鼠DA、NE和5-HT的含量均有明顯下降，MAO含量顯著升高，而原花青素干預(yù)4周后可減輕改善單胺類神經(jīng)遞質(zhì)失衡。證實(shí)PAC具有保護(hù)VCI大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能的作用，同時(shí)PAC能夠調(diào)節(jié)前腦皮層中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量。然而，PAC究竟是通過(guò)何種機(jī)制調(diào)節(jié)了單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量，還有待進(jìn)一步研究。

總的來(lái)說(shuō)，原花青素在血管性認(rèn)知功能障礙大鼠模型中，具有保護(hù)認(rèn)知功能的作用，而且能夠調(diào)節(jié)前腦皮層中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量。本研究為血管性認(rèn)知功能的臨床治療提供了理論依據(jù)。原花青素有可能成為治療血管性認(rèn)知功能障礙的有效藥物，還需進(jìn)一步的研究以驗(yàn)證其治療作用。

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Effects of proanthocyanidins on monoamine transmitters in vascular cognitive impairment rats

SU Junhong1, XU Xiaochen1, WANG Yingjie1, ZHAO Ranran2*

(1DepartmentofNeurology,FirstHospitalofHandan,Handan056002，China;2DepartmentofEmergency,FirstHospitalofHandan;*Correspondingauthor,E-mail:15830404276@163.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the effects of proanthocyanidins(PAC) on the contents of monoamine neurotransmitters and monoamine oxidase(MAO) in vascular cognitive impairment rats.MethodsForty-eight healthy adult male Wistar rats were randomly assigned into four groups: sham group, VCI group, low-dose PAC group and high-dose PAC group. Bilateral common carotid arteries were occluded in healthy adult male Wistar rats to establish VCI model. Morris water maze was used to evaluate spacial learning and memory function. MAO was measured spectrophotometrically, and the levels of norepinephrine(NE), doparmine(DA) and 5-HT in the forebrain cortex were detected by HPLC.ResultsCompared to sham group, the contents of NE, DA and 5-HT significantly decreased in VCI group(P<0.05), while MAO significantly increased(P<0.05). Compared with VCI group, NE, DA and 5-HT significantly increased in both low-dose PAC group and high-dose PAC group(P<0.05), while MAO decreased(P<0.05).ConclusionPAC could significantly improve spacial learning and memory abilities, and restore central monoamine neurotransmitters system.

Key words:vascular cognitive impariment;proanthocyanidins;monoamine transmitter

[收稿日期：2015-10-24]

作者簡(jiǎn)介：蘇軍紅，女，1971-12生，本科，副主任醫(yī)師.

中圖分類號(hào)：R742

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-6611(2016)02-0124-03

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.02.005

基金項(xiàng)目：邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(1523108138)