張　帥　鄧佳卉　徐志卿　戚曉東*

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)北京軍區(qū)總醫(yī)院臨床學(xué)院乳腺科，北京100700；2.首都醫(yī)科大學(xué)三博腦科醫(yī)院功能神經(jīng)外科，北京 100093；3. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京 100069)

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甘丙肽及其受體亞型在人乳腺癌標(biāo)本中的表達(dá)

張帥1鄧佳卉2徐志卿3戚曉東1*

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)北京軍區(qū)總醫(yī)院臨床學(xué)院乳腺科，北京100700；2.首都醫(yī)科大學(xué)三博腦科醫(yī)院功能神經(jīng)外科，北京 100093；3. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京 100069)

【摘要】目的 探索甘丙肽(galanin，GAL)及其受體亞型(galanin receptor1、2、3， GALR1、2、3)在乳腺癌及癌周組織中的表達(dá)情況，分析其與不同臨床治療方法的關(guān)系。方法qRT-PCR法檢測(cè)乳腺癌及癌周組織的GAL及其3種受體亞型mRNA的表達(dá)情況。Western blotting分析GAL在乳腺癌及癌周組織中的表達(dá)情況。t檢驗(yàn)分析不同術(shù)前處理組之間癌組織的GAL及其受體亞型表達(dá)的變化，而配對(duì)t檢驗(yàn)用于分析同一術(shù)前處理組內(nèi)癌組織和癌周組織之間GAL及其受體亞型表達(dá)的變化。結(jié)果在術(shù)前無治療組中，癌組織GAL mRNA及GAL蛋白比癌旁組織高(P<0.05，P<0.01)，而GALR1、GALR2、GALR3 mRNA比癌旁組織低(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。經(jīng)過新輔助化學(xué)治療(neoadjuvant chemotherapy, NAC)與高強(qiáng)度聚焦超聲射頻消融術(shù)(high intensity focused ultrasound, HIFU)治療后，癌組織與癌旁組織相比，GAL及其受體mRNA和蛋白差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是與術(shù)前無治療組癌組織相比，GAL mRNA及GAL蛋白明顯降低(P<0.05)。此外，經(jīng)過NAC治療后癌組織中GALR3 mRNA要明顯高于術(shù)前無治療組的癌組織(P<0.01)。結(jié)論GAL及其受體亞型在乳腺癌中存在異常表達(dá)，并與臨床治療方法有關(guān)，可能為乳腺癌的診斷、治療及預(yù)后提供了新的生物學(xué)標(biāo)志。

【關(guān)鍵詞】乳腺癌；甘丙肽；甘丙肽受體亞型

乳腺癌是國內(nèi)外女性最常見的惡性腫瘤之一，且其發(fā)病率仍呈上升趨勢(shì)[1-2]。乳腺癌的綜合治療方案制定目前主要依據(jù)雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)、人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2, Her-2)、細(xì)胞增生核抗原(cell proliferation associated nuclear antigen, Ki-67)等分子標(biāo)志物的檢測(cè)。其中針對(duì)Her-2這一靶點(diǎn)而開發(fā)的曲妥珠單抗在臨床的應(yīng)用開啟了乳腺癌的靶向治療時(shí)代[3]，但是針對(duì)三陰性乳腺癌和其他難治性乳腺癌，仍沒有理想的治療靶點(diǎn)和特異性藥物，相關(guān)藥物靶點(diǎn)的尋找和特異性藥物的開發(fā)仍然是目前研究的熱點(diǎn)之一。

甘丙肽(galanin，GAL)是一種由30個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的神經(jīng)肽，已知的3種受體亞型(galanin receptor1、2、3，GALR1、2、3)均為G蛋白偶聯(lián)型受體[4]。除在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)外，研究[5-6]顯示GAL及其受體亞型在多種腫瘤中均有表達(dá)，且在診斷、治療、預(yù)后和細(xì)胞生物學(xué)特性等方面扮演著重要的角色。然而，目前國內(nèi)外針對(duì)GAL及其受體亞型與乳腺腫瘤的關(guān)系的研究僅有少量報(bào)道[7-8]，在乳腺腫瘤及瘤周組織中的表達(dá)情況及與臨床資料的關(guān)系尚未明確。本研究即對(duì)其在乳腺癌及癌周組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，分析與不同臨床治療方法之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1臨床標(biāo)本

選取2015年2月至2015年10月于北京軍區(qū)總醫(yī)院乳腺中心術(shù)前經(jīng)穿刺病理確診為乳腺癌并行手術(shù)患者19例(表1)。均于術(shù)中切取腫瘤及瘤周乳腺組織標(biāo)本，所取標(biāo)本立即使用干冰凍存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

1.2主要試劑

RNA提取試劑盒(Qiagen公司，德國)；熒光定量PCR試劑盒(ABI公司，美國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司，美國)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司，美國)，甘內(nèi)肽小鼠抗人單克隆抗體(Sigma公司，美國)，β-actin小鼠抗人單克隆抗體(Sigma公司，美國)，HRP二抗(Amersham公司，美國)，Western blotting相關(guān)試劑(普利萊基因技術(shù)有限公司，中國)。

表1　乳腺癌患者信息

ER:estrogen receptor; PR:progesterone receptor; Her-2:human epidermal growth factor receptor-2; Ki-67:cell proliferation associated nuclear antigen; HIFU：high intensity focused ultrasound; NAC：neoadjuvant chemotherapy.

1.3主要方法

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GAL及其受體GALR1、GALR2和GALR3 mRNA的量

按照Qiagen公司RNA提取試劑盒操作說明提取制備總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。設(shè)計(jì)并驗(yàn)證人GAL及其受體引物(表2)，引物均由Invitrogen公司合成。GAL及其受體GALR1、GALR2和GALR3表達(dá)用相對(duì)定量PCR的SYBR Green法檢測(cè)，每例重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。以術(shù)前無治療組的癌周組織mRNA的相對(duì)變化的倍數(shù)作為100%參照。

表2　甘丙肽及其受體引物

1.3.2蛋白質(zhì)提取和Western blotting法檢測(cè)GAL蛋白表達(dá)量

提取乳腺組織總蛋白，經(jīng)BCA法定量，調(diào)整樣本為相同蛋白濃度，取10 μL相同總量蛋白上樣，經(jīng)SDA-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，鼠抗人GAL (1∶100稀釋)，內(nèi)參GAPDH (1∶5 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，室溫孵育二抗1 h，顯影曝光并采集圖像，通過Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1乳腺癌組織中GALmRNA的表達(dá)

術(shù)前未經(jīng)治療的乳腺癌組織中GALmRNA表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)，而經(jīng)過新輔助化學(xué)治療(neoadjuvant chemotherapy, NAC)或高強(qiáng)度聚焦超聲射頻消融術(shù)(high intensity focused ultrasound, HIFU)治療的乳腺癌組織中GALmRNA表達(dá)與癌旁組織相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是明顯低于未經(jīng)治療的乳腺癌組織(P<0.05)，詳見圖1。

2.2GAL蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)

術(shù)前未經(jīng)治療的乳腺癌組織中GAL蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.01)，而經(jīng)過NAC或HIFU治療的乳腺癌組織中GAL蛋白表達(dá)與癌旁組織相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是明顯低于未經(jīng)治療的乳腺癌組織(P<0.05)，詳見圖2。

2.3乳腺癌組織中GALR1 mRNA的表達(dá)

術(shù)前未經(jīng)治療的乳腺癌組織中GALR1 mRNA表達(dá)顯著低于癌旁組織(P<0.05)，而經(jīng)過NAC或HIFU治療的乳腺癌組織中GALR1 mRNA表達(dá)與癌旁組織相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖1　乳腺癌組織中GAL mRNA的表達(dá)

*P<0.05;#P<0.05; GAL:galanin; HIFU：high intensity focused ultrasound; NAC：neoadjuvant chemotherapy; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

圖2　Western blotting法檢測(cè)乳腺癌組織中

**P<0.01;#P<0.05; GAL:galanin;HIFU：high intensity focused ultrasound; NAC：neoadjuvant chemotherapy; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

圖3　乳腺癌組織中GALR1 mRNA的表達(dá)

*P<0.05; GALR:galanin receptor;HIFU：high intensity focused ultrasound; NAC：neoadjuvant chemotherapy; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

2.4乳腺癌組織中GALR2 mRNA的表達(dá)

術(shù)前未經(jīng)治療的乳腺癌組織中GALR2 mRNA表達(dá)顯著低于癌旁組織(P<0.05)，而經(jīng)過NAC或HIFU治療的乳腺癌組織中GALR2 mRNA表達(dá)與癌旁組織相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

圖4　乳腺癌組織中GALR2 mRNA的表達(dá)

*P<0.05; GALR:galanin receptor; HIFU：high intensity focused ultrasound; NAC：neoadjuvant chemotherapy; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

2.5乳腺癌組織中GALR3 mRNA的表達(dá)

術(shù)前未經(jīng)治療的乳腺癌組織中GALR3 mRNA表達(dá)顯著低于癌旁組織(P<0.01)，而經(jīng)過NAC或HIFU治療的乳腺癌組織中GALR3 mRNA表達(dá)略低于癌旁組織但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)過NAC治療后癌組織中GALR3 mRNA要明顯高于術(shù)前無治療組的癌組織(P<0.01)，詳見圖5。

3討論

研究[4]顯示多種非神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中都有神經(jīng)肽及其受體表達(dá)。這些肽和受體為腫瘤的診斷、同位素示蹤和具有細(xì)胞毒性的肽類似物治療提供了分子學(xué)依據(jù)。其表達(dá)與腫瘤的分化程度及侵襲性相關(guān)，其促進(jìn)或者抑制癌細(xì)胞增生活性的作用，有指導(dǎo)治療的價(jià)值。

GAL在不同腫瘤中有著不同的表達(dá)情況與臨床意義。如Kim等[6]報(bào)道結(jié)腸腺癌中GAL與GALmRNA要高于癌旁組織，且其表達(dá)會(huì)隨著腫瘤大小的增長與分期的增加而明顯升高，并與患者預(yù)后相關(guān)。Sugimoto等[9]報(bào)道頭頸部鱗癌中GALmRNA水平是升高的。目前針對(duì)GAL及其受體系統(tǒng)與乳腺癌關(guān)系的研究很少，Ormandy等[7]報(bào)道甘丙肽基因定位于11q13，該位點(diǎn)在乳腺癌中常發(fā)生擴(kuò)增。本研究中，在術(shù)前無治療組的癌組織中GAL及GALmRNA水平比癌周組織的要高，其可能與基因擴(kuò)增有關(guān)。

圖5　乳腺癌組織中GALR3 mRNA的表達(dá)

**P<0.01;##P<0.01; GALR:galanin receptor; HIFU：high intensity focused ultrasound; NAC：neoadjuvant chemotherapy; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

Chung等[8]在乳腺癌及多種其他癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)GAL受體基因-GALR2基因啟動(dòng)子存在過度甲基化的現(xiàn)象，這部分解釋了GALR2的mRNA顯著低于癌旁組織的原因。在人頭頸部鱗癌中，GALR1[10]及GALR2[11]分別被證明有抑制細(xì)胞增生和誘導(dǎo)凋亡的作用，本研究中GAL及GALmRNA升高并伴隨受體mRNA表達(dá)降低的現(xiàn)象，是否因?yàn)榕潴w的高表達(dá)而引起受體的代償性下調(diào)，或由于受體的下調(diào)而導(dǎo)致配體的代償性高表達(dá)，及其與癌細(xì)胞增生或凋亡的關(guān)系，值得進(jìn)一步的研究。

乳腺癌有多個(gè)亞克隆細(xì)胞群，不同的細(xì)胞群對(duì)不同治療方案有不同的敏感性，因此在治療過程中，腫瘤分子表達(dá)的特征可能發(fā)生改變[12]。GALR1[13]和GALR2[14]與結(jié)腸癌對(duì)特定化學(xué)治療藥物的敏感性有關(guān)，HIFU治療也會(huì)改變癌細(xì)胞的分子表達(dá)特征[15]，這可能解釋了在NAC與HIFU組癌組織中3種受體亞型的mRNA雖然降低但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GAL及GALmRNA升高但差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且明顯低于術(shù)前無治療組的現(xiàn)象。此外，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過NAC治療后癌組織中GALR3 mRNA要明顯高于術(shù)前無治療組的癌組織，GALR3是否也與乳腺癌化學(xué)治療敏感性有關(guān)，尚需要進(jìn)一步研究。綜上，筆者推測(cè)GAL及其受體系統(tǒng)參與了乳腺癌對(duì)不同治療方案反應(yīng)的差異性，但其表達(dá)情況及與臨床治療方法的關(guān)系仍需進(jìn)一步探討，相關(guān)的研究具有一定的臨床指導(dǎo)意義。

總之，本研究顯示了GAL及其受體亞型在乳腺癌中存在差異表達(dá)，且與臨床治療方法相關(guān)，該研究可能為乳腺癌的診斷、治療及預(yù)后提供了新的資料?？紤]到本研究樣本量較少，與患者臨床及病理資料的相關(guān)性未能明確，今后，本課題組將進(jìn)一步收集樣本，完善患者臨床及病理資料，進(jìn)一步闡明GAL及其受體亞型在乳腺癌中表達(dá)的臨床意義。

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編輯孫超淵

Expression of galanin and its receptor subtypes in human breast cancer

Zhang Shuai1，Deng Jiahui2，Xu Zhiqing3，Qi Xiaodong1*

(1.DepartmentofBreast，theMilitaryGeneralHospitalofBeijing，ClinicalSchoolofAnhuiMedicalUniversity，Beijing100700，China; 2.DepartmentofFunctionalNeurosurgery,SanboBrainHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100093,China; 3.DepartmentofNeurobiology,SchoolofBasicMedicalSciences，CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

【Abstract】ObjectiveTo determine the expression of galanin(GAL) and galanin receptor 1、2、3 (GALR1、2、3) in breast cancer and the paired peritumoral tissues; To analyze the relationship between the different clinical therapies and the expression of galanin and its receptor subtypes. MethodsqRT-PCR was performed to detect the mRNA level of galanin and its three receptor subtypes in breast cancer and the paired peritumoral tissues. Western blotting was carried out to detect the GAL protein level in breast cancer and the paired peritumoral tissues. t-test was used to analyze the expression of galanin and its three receptor subtypes in cancer tissues of different groups; while paired t-test was performed to analyze the expression of galanin and its three receptor subtypes in breast cancer and the paired peritumoral tissues of the same group. ResultsThe GAL mRNA and protein levels of cancer tissues were higher than the paired peritumoral tissues in the group of no preoperative treatment (P<0.05, P<0.01), whereas the mRNA levels of GALR1, GALR2 and GALR3 were lower than the paired peritumoral tissue (P<0.05, P<0.05, P<0.01). In the NAC and HIFU groups, there were no significant differences in GAL protein, GAL and its receptors mRNA levels between the cancer and the paired peritumoral tissues (P<0.05, P<0.05, P<0.01). However, the GAL protein and GAL mRNA levels were lower than the group of no preoperative treatment (P<0.05). In addition, the GALR3 mRNA level was higher than the group of no preoperative treatment in the NAC group (P<0.01). ConclusionThe abnormal expression of galanin and its receptor subtypes in breast cancer was relevant to different clinical therapies, which might be used as a potential biomarker for breast cancer diagnosis, therapy and prognosis.

【Key words】breast cancer; galanin; galanin receptor subtypes

(收稿日期：2016-03-10)

【中圖分類號(hào)】R 739.9

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.02.020]

*Corresponding author， E-mail：qixiaodongbj@sina.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31171032)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(31171032).

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-04-1221∶13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20160412.2113.032.html

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