李珊珊，牟玥靜，劉逢芹，鄭世存

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省千佛山醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014；3.山東省婦幼保健院，山東 濟(jì)南 250021)

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扶骨黃酮分散片中葛根素、大豆苷和淫羊藿苷的含量測(cè)定

李珊珊1，牟玥靜1，劉逢芹2*，鄭世存3

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省千佛山醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014；3.山東省婦幼保健院，山東 濟(jì)南 250021)

摘要：建立了扶骨黃酮分散片中的葛根素、大豆苷和淫羊藿苷含量測(cè)定的高效液相色譜法。采用Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈：0.3%乙酸水溶液梯度洗脫，流速為0.8 mL/min，柱溫為25 ℃，葛根素、大豆苷檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm,淫羊藿苷檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。結(jié)果表明，葛根素檢測(cè)濃度在0.002 08 mg/mL～0.104 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，加樣回收率為100.29%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.89%；大豆苷檢測(cè)濃度在0.000 98 mg/mL～0.039 2 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，加樣回收率為98.29%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.29%；淫羊藿苷檢測(cè)濃度在0.001 04 mg/mL～0.041 6 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，加樣回收率為99.07%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.08%。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，可作為扶骨黃酮分散片的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；扶骨黃酮分散片；葛根素；大豆苷；淫羊藿苷

扶骨黃酮分散片是由葛根、淫羊藿等藥材提取物和珍珠粉制備的中藥制劑，主要治療骨質(zhì)疏松癥。葛根是豆科多年生落葉藤本植物葛(Puerariaelobata(Willd)Ohwi.)的干燥根，含有多種異黃酮類化合物，具有抗骨質(zhì)疏松和雌激素樣作用[1-2]等。淫羊藿(EpimediiFolium)是小檗科淫羊藿屬多年生草本植物，具有補(bǔ)腎壯骨、抗腫瘤[3-4]等功效，其中黃酮類成分淫羊藿苷發(fā)揮主要藥效作用。扶骨黃酮分散片中的有效成分是葛根素、大豆苷和淫羊藿苷，為了更好地控制扶骨黃酮分散片的質(zhì)量[5-6]，本文采用高效液相色譜法對(duì)扶骨黃酮分散片中的主要有效成分葛根素、大豆苷和淫羊藿苷進(jìn)行了含量測(cè)定。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試藥

安捷倫1120高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)，包括DAD紫外檢測(cè)器(G1315C)、進(jìn)樣器(G4290A)、梯度泵(G4290A)和柱溫箱(G4290A)；BSA124S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；SB-5200D超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；葛根素對(duì)照品(批號(hào)110752-200209)、大豆苷對(duì)照品(批號(hào)111738-200501)和淫羊藿苷對(duì)照品(批號(hào)110737-200312)，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；扶骨黃酮分散片(自制，批號(hào)分別為140908,140909,140910)；乙腈為色譜純(上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；其他溶劑為分析純，水為純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動(dòng)相為0.3%乙酸水溶液(A):乙腈(B)梯度洗脫，B項(xiàng)體積分?jǐn)?shù)隨時(shí)間的變化：0～17 min，12%；18～26 min，15%；27～55 min，25%；56～65 min，100%；流速為0.8 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 、270 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液制備

精密稱取葛根素對(duì)照品5.2 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇定容到刻度，作為葛根素儲(chǔ)備液；精密稱取大豆苷對(duì)照品5.0 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇定容到刻度，作為大豆苷儲(chǔ)備液；精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品5.2 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇定容到刻度，作為淫羊藿苷儲(chǔ)備液。

精密量取葛根素儲(chǔ)備液4 mL、大豆苷儲(chǔ)備液0.5 mL以及淫羊藿苷儲(chǔ)備液1 mL于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容到刻度，作為葛根素、大豆苷、淫羊藿苷對(duì)照品的混合溶液。

2.2.2供試品溶液制備

取扶骨黃酮分散片6片，粉碎研磨，精密稱取0.1 g于具塞錐形瓶中，精密加入 30%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理1 h，再稱定重量，用 30%乙醇補(bǔ)足失重，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對(duì)照品溶液制備

分別取扶骨黃酮分散片、葛根陰性對(duì)照片、淫羊藿陰性對(duì)照片以及全輔料陰性對(duì)照片各6片，粉碎研磨，精密稱取0.1 g于具塞錐形瓶中，精密加入 30%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理1 h，再稱定重量，用 30%乙醇補(bǔ)足失重，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1專屬性實(shí)驗(yàn)

分別吸取對(duì)照品、供試品與陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀， 按2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1～8所示，陰性對(duì)照品無干擾。

圖1　樣品HPLC圖譜Fig.1　HPLC figure of the sample

圖2　葛根素對(duì)照品HPLC圖譜Fig.2　HPLC figure of puerarin

圖3　大豆苷對(duì)照品HPLC圖譜Fig.3　HPLC figure of daidzin

圖4　淫羊藿苷對(duì)照品HPLC圖譜Fig.4　HPLC figure of lcariin

圖5　混合對(duì)照品HPLC圖譜Fig.5　HPLC figure of mixed reference substance

圖6　葛根陰性對(duì)照品HPLC圖譜Fig.6　HPLC figure of Radix puerariae (negative reference)

圖7　淫羊藿陰性對(duì)照品HPLC圖譜Fig.7　HPLC figure of epimedium (negative reference)

圖8　全輔料對(duì)照品HPLC圖譜Fig.8　HPLC figure of accessory (negative reference)

2.3.2線性關(guān)系考察

分別量取葛根素儲(chǔ)備液0.10、0.50、1、4、5 mL，大豆苷儲(chǔ)備液0.05、0.10、0.5、1、2 mL,淫羊藿苷儲(chǔ)備液0.05、0.10、0.50、1、2 mL于5個(gè)10 mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，制備5個(gè)不同濃度的混合溶液，過0.45 μm微孔濾膜濾過，按2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，得到近似通過原點(diǎn)的直線。葛根素回歸方程為y=59 661x+15.461(R=0.999 9)，說明葛根素在0.002 08 mg/mL～0.104 00 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。大豆苷回歸方程為y=52 863x+1.010 1(R=0.999 9)，說明大豆苷在0.000 98 mg/mL～0.039 20 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。淫羊藿苷回歸方程為y=30 474x-2.255 8 (R=0.999 9)，說明淫羊藿苷在0.001 04 mg/mL～0.041 60 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4精密度實(shí)驗(yàn)

吸取混合對(duì)照品溶液于高效液相色譜儀中，按2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，得葛根素、大豆苷和淫羊藿苷對(duì)照品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.27%、0.19%、0.20%，表明儀器精密度良好。

2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批號(hào)扶骨黃酮分散片6份，按2.2.2項(xiàng)下制備方法制備樣品溶液，按2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得葛根素、大豆苷和淫羊藿苷的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.89%、1.29%、1.08%。表明方法的重復(fù)性良好。

2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一扶骨黃酮分散片樣品溶液10 μL，分別在1、2、4、8、12、24 h測(cè)定，結(jié)果葛根素、大豆苷和淫羊藿苷的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.49%、1.43%、0.51%。表明本品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7回收率實(shí)驗(yàn)

取同一批號(hào)扶骨黃酮分散片0.05 g，9份，按2.2.2項(xiàng)下制備方法制備樣品溶液，分別加入低(80%)、中(100%)、高(120%)濃度的葛根素、大豆苷和淫羊藿苷對(duì)照品各3份，測(cè)定含量，計(jì)算回收率，測(cè)得結(jié)果見表1。

表1　加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8含量測(cè)定

分別取批號(hào)為140908、140909、140910的扶骨黃酮分散片各6片，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果3個(gè)批號(hào)扶骨黃酮分散片含量測(cè)試平均值如表2所示。

表2　扶骨黃酮分散片含量測(cè)試平均值

3討論

在供試品溶液的制備預(yù)實(shí)驗(yàn)中,分別采用加熱回流提取法[7]和超聲提取法[8]進(jìn)行制備，供試品溶液用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，所得結(jié)果后者好于前者，且超聲提取比加熱回流提取方法簡(jiǎn)便、用時(shí)短，更易于操作，因此本實(shí)驗(yàn)確定供試品溶液制備采用超聲提取法。

在對(duì)高效液相流動(dòng)相選擇的實(shí)驗(yàn)預(yù)試中，最初參考文獻(xiàn)[9-10]采用的純水作單一流動(dòng)相，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)部分成分的峰型不標(biāo)準(zhǔn)，且峰滯留時(shí)間過長(zhǎng)，因此嘗試在水中加入一定量的酸作為流動(dòng)相[11-12]，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)摸索，發(fā)現(xiàn)0.3%乙酸水溶液可以使峰型更加標(biāo)準(zhǔn)，故采用0.3%乙酸水溶液作為本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相。另外本實(shí)驗(yàn)先采用流動(dòng)相等度洗脫方法，發(fā)現(xiàn)對(duì)制劑中所含有的3種黃酮類有效成分的分離需要近2 h的時(shí)間，既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，而且峰面積差異較大；后嘗試采用乙酸水溶液和乙腈作梯度洗脫，通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定流動(dòng)相條件為0.3%乙酸水溶液(A):乙腈(B)梯度洗脫，B項(xiàng)體積分?jǐn)?shù)隨時(shí)間的變化：0～17 min，12%；18～26 min，15%；27～55 min，25%；56～65 min，100%，所得高效液相色譜圖譜清晰理想。

本實(shí)驗(yàn)供試品溶液的制備方法簡(jiǎn)單、易于操作；含量測(cè)定采用梯度洗脫，節(jié)省時(shí)間，3種有效成分分離較好，峰形理想且與其他成分之間無干擾。本實(shí)驗(yàn)選用方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確而且重現(xiàn)性能好，可以作為該產(chǎn)品在實(shí)際生產(chǎn)中質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)。

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Content determination of puerarin, daidzin and icariin in Fugu Huangtong Dispersible Tablets

LI Shan-shan1,MU Yue-jing1, LIU Feng-qin2，ZHENG Shi-cun3

(1.School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;2. Shandong Qianfoshan Hospital, Jinan 250014, China;3. Shandong Provincial Maternity and Child Care Hospital, Jinan 250021, China)

Abstract∶We established a HPLC method for content determination of puerarin, daidzin and icariin in Fugu Huangtong Dispersible Tablets. It involves Eclipse XDB-C18column (4.6 mm×250 mm,5 μm), mobile phase acetonitrile-water-acetic acid solution with flow rate of 0.8 mL·min-1and column temperature of 25 ℃, detection wavelength of 250 nm for puerarin and daidzin, and detection wavelength of 270 nm for icariin. Experimental results show that puerarin has better linear relationship with peak area in the range of 0.002 08 mg/mL～0.104 mg/mL, recovery rate of 100.29% and relative standard deviation of 0.89%. Daidzin has better linear relationship with peak area in the range of 0.000 98 mg/mL～0.039 2 mg/mL, recovery rate of 98.29% and relative standard deviation of 1.29%. Icariin has better linear relationship with peak area in the range of 0.001 04 mg/mL～0.041 6 mg/mL, recovery rate of 99.07% and relative standard deviation of 1.08%. The method is of simplicity, accuracy, good reproducibility and stability, so it can be applied to quality control of Fugu Huangtong Dispersible Tablets.

Key words∶HPLC; Fugu Huangtong Dispersible Tablets; puerari; daidzin; icariin

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-4026(2016)02-0004-05

作者簡(jiǎn)介：李珊珊(1989-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿⑿聞┬汀?通訊作者，劉逢芹。Email:13791120885@163.com

基金項(xiàng)目：山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃(2013-201)；山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2013GSF1120)

收稿日期：2015-07-27

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.02.002

【中藥與天然活性產(chǎn)物】