杜改梅 胡志華 羅碧平 吳結(jié)革 張淼 晏文梅 劉茂軍

摘要：【目的】研究生長素（Ghrelin）基因沉默對仔豬胃酸分泌的調(diào)節(jié)作用，為防治仔豬斷奶后某些消化系統(tǒng)功能障礙或分泌異常研究提供新靶點(diǎn)，進(jìn)而闡明Ghrelin對胃酸分泌的調(diào)節(jié)作用機(jī)制?！痉椒ā坎捎弥|(zhì)體將RNA干擾沉默的shGhrelin轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的豬胃黏膜上皮細(xì)胞，優(yōu)化確立最佳轉(zhuǎn)染條件，并通過熒光定量RT-PCR檢測shGrelin轉(zhuǎn)染對胃黏膜上皮細(xì)胞中Ghrelin基因mRNA表達(dá)及H+-K+-ATPase（質(zhì)子泵）活性的影響?！窘Y(jié)果】質(zhì)粒（shGhrelin）與脂質(zhì)體（Lipofectamine 2000）的最佳轉(zhuǎn)染比例為1∶3，最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間24 h。與正常對照組相比，以shGhrelin轉(zhuǎn)染胃黏膜上皮細(xì)胞后，其Ghrelin基因mRNA的表達(dá)顯著降低（P<0.05，下同），H+-K+-ATPase活性也顯著下降。【結(jié)論】采用RNA干擾技術(shù)能沉默胃黏膜上皮細(xì)胞Ghrelin基因表達(dá)和抑制H+-K+-ATPase活性，表明Ghrelin對胃酸分泌具有重要的調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞： 生長素（Ghrelin）；胃黏膜上皮細(xì)胞；胃酸分泌；RNA干擾

中圖分類號： S828 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）08-1396-05

Abstract：【Objective】The regulating effect of Ghrelin gene silencing on gastric acid secretion were investigated， in order to provide new target for digestive system dysfunctions or diacrisis of weaning piglet， and then clarify regulation mechanism of ghrelin in the gastric acid secretion. 【Method】shGhrelin was transfected into in vitro porcine gastric mucosal cells using liposome， and the transfection conditions were further optimized. The effects of shGhrelin transfection on Ghrelin gene mRNA expression and H+-K+-ATPase（proton pump） activity were detected by fluorescent quantitative RT-PCR. 【Result】The results showed that， the optimal transfection ratio of plasmid（shGhrelin） to lipofectamine 2000 was 1∶3， and the optimal transfection time was 24 h. Furthermore， after shGhrelin was transfected into in vitro porcine gastric mucosal cells， Ghrelin gene mRNA expression and H+-K+-ATPase activity were reduced significantly（P<0.05）， compared with control group. 【Conclusion】Ghrelin gene expression is silenced successfully by using RNA interference（RNAi） technology， and H+-K+-ATPase activity is inhibited. It indicated that ghrelin plays an important role in regulating gastric acid secretion.

Key words： Ghrelin； gastric mucosal cell； gastric acid secretion； RNA interference

0 引言

【研究意義】在消化系統(tǒng)中，胃是蛋白質(zhì)消化的重要場所，也是抵御有害微生物入侵的重要屏障。胃黏膜組織中壁細(xì)胞分泌的胃酸對胃蛋白酶原激活起關(guān)鍵作用，同時(shí)具有抑制有害菌增殖的作用。隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；牟粩喟l(fā)展，仔豬斷奶日齡越來越小，但其胃腸道功能發(fā)育尚未完善，常導(dǎo)致仔豬食欲不良、消化功能紊亂，嚴(yán)重的甚至出現(xiàn)腹瀉或死亡現(xiàn)象等，嚴(yán)重影響我國養(yǎng)豬業(yè)的健康快速發(fā)展（張宏福和顧憲紅，2001）。因此，有效激發(fā)仔豬內(nèi)源性的胃酸分泌能力，提高斷奶前后仔豬的消化功能是防止其斷奶后腹瀉的關(guān)鍵。【前人研究進(jìn)展】生長素（Ghrelin）是一種主要由胃粘膜分泌的短肽，與受體結(jié)合可發(fā)揮許多生物學(xué)功能（Kojima et al.，1999，2008；Date et al.，2000；Muller et al.，2015）。Ghrelin免疫活性細(xì)胞主要分布在胃底部泌酸腺黏膜上（Date et al.，2000），將胃部的泌酸區(qū)切除后，機(jī)體的血清Ghrelin含量顯著下降（Ariyasu et al.，2001）。Ghrelin基因在胃底和幽門部均有表達(dá)，但在胃底部的表達(dá)量顯著高于幽門部（杜改梅等，2005）。近年來，有關(guān)Ghrelin及其受體的研究主要集中在人類和鼠類上，并證實(shí)胃腸道功能與Ghrelin間存在密切關(guān)系，但有關(guān)Ghrelin對胃功能發(fā)育的影響作用尚有不同觀點(diǎn)。部分研究揭示，Ghrelin可降低應(yīng)激對小鼠胃腸道黏膜的損害作用，并促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)及食物消化（陳晨，2002；黃希貴等，2004；Levin et al.，2005），或促進(jìn)大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)和胃酸分泌（Masuda et al.，2000）；但也有研究表明，Ghrelin對大鼠胃酸分泌具有顯著的抑制作用（Sibilia et al.，2002）；而Dornonville等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin對胃腸道運(yùn)動(dòng)具有促進(jìn)作用，但對胃酸分泌無任何促進(jìn)或抑制作用。即關(guān)于Ghrelin對胃酸分泌的調(diào)節(jié)作用尚無定論，有待進(jìn)一步研究闡明?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制（Calero- Nieto et al.，2009），目前已成為研究基因功能的一個(gè)重要工具，在許多疾病的預(yù)防和治療中得到推廣應(yīng)用（Rao et al.，2009）。因此，研究RNA干擾沉默Ghrelin基因?qū)ψ胸i胃酸分泌的影響，對闡明其調(diào)節(jié)作用機(jī)制具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過RNA干擾沉默Ghrelin基因表達(dá)，研究Ghrelin調(diào)節(jié)胃酸分泌的作用，以期為防治仔豬斷奶后某些消化系統(tǒng)功能障礙或分泌異常研究提供新靶點(diǎn)，進(jìn)而闡明Ghrelin對胃酸分泌的調(diào)節(jié)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

H+-K+-ATPase Kit和胰蛋白酶（Trypsin）購自南京建成生物科技有限公司，DMEM/F-12和Triton X-100購自美國Gibco公司，胎牛血清、Rabbit Monclonal to CK18和FITC標(biāo)志親和純化羊抗兔IgG（H+L）購自美國Sigma公司，Trizol試劑盒和SYBR-Green I購自TaKaRa公司，質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo購自GenePharma公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1. 2 胃黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)

迅速剖取斷奶小梅山豬的胃，用含青霉素（500 U/mL）和鏈霉素（500 U/mL）的預(yù)冷（4 ℃）D-Hanks液快速清洗胃內(nèi)容物，充分洗凈后迅速剝離胃黏膜，參照Terano等（1982）的方法進(jìn)行胃黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)。0.15%胰蛋白酶37 ℃消化30 min，過銅網(wǎng)后1000 r/min離心5 min；D-Hanks液洗離心沉淀1次，同樣方法離心收集沉淀，用含10%胎牛血清、青霉素（500 U/mL）和鏈霉素（500 U/mL）的DEME/F-12懸浮沉淀，制成細(xì)胞懸液，確保細(xì)胞存活率在95%以上。調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)80%。

1. 3 胃黏膜上皮細(xì)胞免疫熒光鑒定

消化分離生長良好的黏膜上皮細(xì)胞于96孔板中貼壁生長24 h，棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，每次5 min；于200 μL乙醇中4 ℃固定30 min，PBS洗3次；用1% BSA在37 ℃下封閉30 min，PBS洗3次；加入Rabbit Monclonal to CK18（一抗），37 ℃下孵育1.5 h，PBS洗3次；加入FITC標(biāo)志親和純化羊抗兔IgG（二抗），37 ℃下避光孵育1 h，PBS洗3次。熒光顯微鏡下觀察并拍照，陽性信號為綠色熒光。

1. 4 shGhrelin轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1 d，將細(xì)胞接種至6孔板中（培養(yǎng)液為不含抗生素的DMEM/F-12），37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。按照Lipofectamine 2000使用說明進(jìn)行操作（Elbashir et al.，2001），優(yōu)化shGhrelin和Lipofectamine 2000的混合比例，分別按1∶2、1∶3和1∶4的比例將shGhrelin轉(zhuǎn)染胃黏膜上皮細(xì)胞，同時(shí)設(shè)正常對照組和陰性對照組。在DMEM/F-12無血清培養(yǎng)基加入質(zhì)粒DNA，輕輕混勻；用無血清的DMEM/F-12稀釋Lipofectamine 2000，輕輕混勻，室溫放置5 min；將稀釋好的Lipofectamine 2000與質(zhì)粒DNA混勻，室溫放置20 min，形成DNA/Lipofectamine復(fù)合物。將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的6孔板中，來回輕輕搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中溫育，分別于轉(zhuǎn)染后24、48 h熒光檢測轉(zhuǎn)染情況，選擇轉(zhuǎn)染效率高且細(xì)胞狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)染組提取細(xì)胞RNA和總蛋白。

1. 5 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測Ghrelin基因mRNA表達(dá)量

轉(zhuǎn)染結(jié)束后，采用Trizol試劑盒提取細(xì)胞中總RNA。測定總RNA的濃度和純度，并以1.4%瓊脂糖—甲醛變性凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。用隨機(jī)引物對所有樣品RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（RT）以獲得cDNA，RT反應(yīng)體系25.0 μL，其中總RNA 2.0 μg，0.4 mmol/L dNTP 1.0 μL，0.4 μmol/L隨機(jī)引物2.0 μL，加ddH2O至10.0 μL；70 ℃變性5 min后即刻冰上冷卻，加入8 U RNA酶抑制劑、5.0 μL 5×RT Buffer和100 U M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，DEPC水補(bǔ)足至25.0 μL；然后37 ℃反應(yīng)60 min，95 ℃反應(yīng)5 min。以不加反轉(zhuǎn)錄酶的體系作陰性對照（C1），用于檢測RNA樣品是否存在基因組DNA污染。Ghrelin基因引物序列根據(jù)GenBank中豬的相關(guān)cDNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，所有引物（表1）由寶生物工程（大連）有限公司合成。

以GAPDH為內(nèi)標(biāo)基因，采用熒光定量RT-PCR檢測目的基因的表達(dá)量，重復(fù)3次，2-△△Ct統(tǒng)計(jì)分析有效性數(shù)據(jù)。同時(shí)以ddH2O和RNA為模板，檢驗(yàn)是否存在外源和基因組DNA污染。

1. 6 H+-K+-ATPase（質(zhì)子泵）活性測定

轉(zhuǎn)染結(jié)束后棄培養(yǎng)液，每孔中加入1.0 mL的0.2% Triton X-100，吹打破碎細(xì)胞，收集細(xì)胞破碎液，按試劑盒說明進(jìn)行測定，結(jié)果以反應(yīng)1 h內(nèi)H+-K+-ATPase磷酸化釋放磷量和細(xì)胞總蛋白含量比值來表示，單位為μmol/mg·h。

1. 7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以單因子方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 胃黏膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

如圖1和圖2所示，胰酶消化法可有效分離獲得胃黏膜上皮細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后細(xì)胞大量增殖。通過免疫熒光鑒定，發(fā)現(xiàn)有大量綠色熒光陽性信號，即確定培養(yǎng)的細(xì)胞為仔豬胃黏膜上皮細(xì)胞。

2. 2 shGrelin轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化確定

通過優(yōu)化脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，最終確定質(zhì)粒（shGhrelin）和脂質(zhì)體（Lipofectamine 2000）比例為1∶3，以轉(zhuǎn)染后24 h的綠色熒光細(xì)胞數(shù)量最多（圖2）。轉(zhuǎn)染48 h后的熒光細(xì)胞數(shù)量與轉(zhuǎn)染24 h的相近，無明顯變化。

2. 3 shGrelin轉(zhuǎn)染對胃黏膜上皮細(xì)胞中Ghrelin基因mRNA表達(dá)的影響

與正常對照組相比，陰性對照組胃黏膜上皮細(xì)胞中Ghrelin基因mRNA的表達(dá)量未發(fā)生顯著變化（P>0.05，下同），但shGhrelin轉(zhuǎn)染組胃黏膜上皮細(xì)胞中Ghrelin基因mRNA的表達(dá)顯著降低（P<0.05，下同）（圖3）。

2. 4 shGrelin轉(zhuǎn)染對胃黏膜上皮細(xì)胞中H+-K+-ATPase活性的影響

如圖4所示，shGhrelin轉(zhuǎn)染胃黏膜上皮細(xì)胞后，細(xì)胞中H+-K+-ATPase活性與正常對照組和陰性對照組相比顯著下降，而正常對照組與陰性對照組間無顯著差異。

3 討論

目前，隨著RNA干擾技術(shù)的不斷發(fā)展，采用基因沉默闡明相關(guān)基因的功能作用已成為研究熱點(diǎn)，但通過RNA干擾沉默Ghrelin基因表達(dá)來研究其對胃酸分泌的調(diào)控作用尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果表明，構(gòu)建的shGhrelin表達(dá)載體能高效阻斷胃黏膜上皮細(xì)胞中Ghrelin基因的表達(dá)，并顯著降低胃黏膜上皮細(xì)胞中H+-K+-ATPase活性，揭示Ghrelin對胃酸分泌具有重要的促進(jìn)作用。

已有諸多研究表明，Ghrelin與胃酸分泌具有密切關(guān)系。如Masuda等（2000）、Date等（2001）研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin通過中樞神經(jīng)和迷走神經(jīng)通路可提高胃酸分泌；Sibilia等（2002）研究表明，Ghrelin可抑制胃酸分泌；Dornonville等（2004）研究表明，Ghrelin對胃酸分泌既無促進(jìn)作用也無抑制作用?？梢?，Ghrelin是否參與對胃酸分泌的調(diào)節(jié)，可能與劑量、評價(jià)胃酸分泌能力的指標(biāo)及處理方法等有關(guān)。本課題組的前期研究結(jié)果表明，仔豬斷奶前后Ghrelin基因表達(dá)的發(fā)育性變化與胃H+-K+-ATPase mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)，同時(shí)揭示外源Ghrelin作用于胃黏膜上皮細(xì)胞，可促進(jìn)黏膜上皮細(xì)胞中H+-K+-ATPase活性（Du et al.，2007）；通過肌肉注射重組Ghrelin也可促進(jìn)仔豬胃酸分泌（Du et al.，2013）。本研究通過構(gòu)建shGhrelin表達(dá)載體抑制Ghrelin基因mRNA表達(dá)來觀測其對胃H+-K+-ATPase活性的影響，其結(jié)果與本課題組的前期研究結(jié)果一致。因此，本研究建立的Ghrelin基因阻斷胃黏膜上皮細(xì)胞模型為進(jìn)一步研究Ghrelin調(diào)節(jié)胃酸分泌的機(jī)制及其他生物學(xué)功能提供了重要的方法和途徑。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，采用RNA干擾技術(shù)能沉默胃黏膜上皮細(xì)胞Ghrelin基因表達(dá)和抑制H+-K+-ATPase活性，表明Ghrelin對胃酸分泌具有重要的調(diào)節(jié)作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）