豐 安，周青山

武漢大學(xué)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 武漢 430060

其他論著

熊果酸通過下調(diào)COX-2表達(dá)降低人胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力研究

豐 安，周青山

武漢大學(xué)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 武漢 430060

目的 觀察熊果酸對(duì)人胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力的影響，并探討可能的作用機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)HGC-27細(xì)胞，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組用不同濃度(15、30、60 μmol/L)熊果酸處理HGC-27細(xì)胞24 h，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力；Western blotting 檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)及 p-NF-κB的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組比較，熊果酸可顯著降低HGC-27細(xì)胞侵襲能力；經(jīng)熊果酸處理后，MMP-9表達(dá)下調(diào)；熊果酸可抑制COX-2及其上游調(diào)控基因p-NF-κB的表達(dá)。結(jié)論 熊果酸可降低人胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力，其機(jī)制可能與抑制p-NF-κB、下調(diào)COX-2表達(dá)、降低MMP-9表達(dá)有關(guān)。

熊果酸；HGC-27細(xì)胞；侵襲；環(huán)氧化酶-2；NF-κB

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤，且起病隱匿、發(fā)展迅速，死亡率居腫瘤相關(guān)死亡率前列[1]。我國胃癌的發(fā)病率和死亡率居各種惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅著我國人民群眾的生命健康。侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌臨床治療失敗和患者死亡的主要原因。盡管腫瘤治療方法不斷發(fā)展與更新，新的抗腫瘤藥物層出不窮，但胃癌患者長期生存率并沒有明顯提高。因此，迫切需要找到抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的新方法和策略。

熊果酸(Ursolic acid)，又稱烏索酸，廣泛存在于包括白花蛇舌草、女貞子、烏梅、夏枯草等在內(nèi)的天然植物中，藥理學(xué)研究證實(shí)，熊果酸具有抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜、護(hù)肝等多種藥理學(xué)作用[2]。此外，熊果酸還具有抗腫瘤作用。研究[3-6]已經(jīng)證實(shí)，熊果酸可抵抗包括苯并芘、黃曲霉素在內(nèi)的多種致癌物質(zhì)的致癌效應(yīng)，且在體內(nèi)外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用。然而，熊果酸抗腫瘤的具體機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步探討。本研究以胃癌HGC-27為研究對(duì)象，觀察熊果酸對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力的影響，并探討分析熊果酸可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 細(xì)胞株：胃癌HGC-27細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室凍存；主要試劑：熊果酸購自Sigma公司；胎牛血清購自GIBCO公司，RPMI1640培養(yǎng)液、蛋白提取試劑盒購自武漢谷歌生物科技有限公司；Transwell小室購自Corning公司；Matrigel膠購自BD公司；COX-2、MMP-9、p-NF-κB(p65)及β-actin抗體購自Cell Signaling Technology公司。辣根酶標(biāo)記山羊抗兔或山羊抗鼠IgG購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中后置于37 ℃ 5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2～3 d后觀察培養(yǎng)基顏色及培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞長勢，若培養(yǎng)基顏色變淡而細(xì)胞未長滿則將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，在無菌操作臺(tái)上操作，棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2～3遍，加入適量新培養(yǎng)基，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。該實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組、15 μmol/L熊果酸組、30 μmol/L熊果酸組和60 μmol/L熊果酸組，作用時(shí)間均為24 h。

1.2.2 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力：將Matrigel膠放置于4 ℃冰箱中過夜，用4 ℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋融化后的Matrigel膠至終濃度為1 mg/ml；將100 μl稀釋后的Matrigel膠加入Transwell小室底部中間區(qū)域，讓膠體自由向四周擴(kuò)散，使其均勻地鋪在小室底部，37 ℃培育5 h使其干成膠狀；實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞培養(yǎng)試劑和Transwell小室放在37 ℃條件下預(yù)熱；將生長期的各組血清細(xì)胞饑餓12 h，收集細(xì)胞，用PBS和無血清培養(yǎng)基先后各洗滌1次，1 500 r/min離心5 min后，用無血清培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度約2×105/ml；將600 μl 含10%血清培養(yǎng)基加入24孔板底部，150 μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室內(nèi)，用鑷子將小室轉(zhuǎn)移至含10%血清培養(yǎng)基的24孔板中，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；24 h后，用鑷子小心取出小室，吸干小室內(nèi)培養(yǎng)基，用經(jīng)PBS濕潤的棉簽輕拭小室內(nèi)的細(xì)胞后將小室移到含800 μl甲醇的孔中，室溫下放置固定30 min；30 min后取出小室并吸干室內(nèi)固定液，移到含結(jié)晶紫染液的孔中，室溫下放置染色15 min；15 min后用清水浸泡并輕輕沖洗數(shù)次，然后取出小室，吸去上室液體，用鑷子小心揭下膜，底面朝上晾干；顯微鏡下取5個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.3 Western blotting檢測COX-2、MMP-9、p-NF-κB蛋白表達(dá)：細(xì)胞接種及分組同上，收集細(xì)胞，用冷的PBS洗滌3遍，棄去PBS，加入三去污蛋白裂解液，置于冰上裂解30 min，用雙蒸水泡過的細(xì)胞刮收集瓶中液體于EP管中，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，吸取上清，置于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存。聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定蛋白質(zhì)濃度，加入5×上樣緩沖液至提取的細(xì)胞蛋白樣品中，沸水煮沸5 min使蛋白變性。將膠板固定在電泳架上，加入電泳緩沖液，每孔加入40 μg蛋白樣品，同時(shí)在兩側(cè)的上樣孔中加入5 μl蛋白Marker作為分子量參照。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5%脫脂奶粉封閉1 h，根據(jù)條帶蛋白分布不同加入1∶1 000稀釋的兔抗人COX-2、MMP-9、p-NF-κB(p65)抗體，放入4 ℃冰箱內(nèi)搖床上孵育過夜，其中β-actin為內(nèi)參，次日洗滌緩沖液(TBST)洗膜后，根據(jù)一抗來源不同分別加入1∶1 000稀釋的辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫放置2 h，再次TBST洗膜，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在室溫下孵育PVDF膜后放入暗盒中，暗室紅燈下曝光1 min，然后顯影，定影，對(duì)膠片進(jìn)行拍照分析。

2 結(jié)果

2.1 熊果酸對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力的影響 如圖1所示，15、30、60 μmol/L熊果酸處理HGC-27細(xì)胞24 h后，隨著藥物濃度的增加，穿過Trasnwell小室基底膜的細(xì)胞數(shù)逐漸減少，與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

圖1 熊果酸對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力的影響(100×) A：對(duì)照組；B：15 μmol/L熊果酸組；C：30 μmol/L熊果酸組；D：60 μmol/L熊果酸組；E：各組細(xì)胞數(shù)比較
Fig 1 Effect of Ursolic acid on the invasive ability in HGC-27 cells (100×) A：control group；B：Ursolic acid 15 μmol/L group；C：Ursolic acid 30 μmol/L group；D：Ursolic acid 60 μmol/L group；E：comparison of HGC-27 cells among each group

2.2 熊果酸對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞MMP-9表達(dá)的影響 0、15、30、60 μmol/L熊果酸處理HGC-27細(xì)胞24 h后，Western blotting檢測結(jié)果顯示,隨著藥物濃度的升高,MMP-9表達(dá)逐漸降低(見圖2)。

圖2 熊果酸對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞MMP-9表達(dá)的影響
Fig 2 Effect of Ursolic acid on the expression of MMP-9 in HGC-27 cells

2.3 熊果酸對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞COX-2表達(dá)的影響 不同濃度熊果酸(0、15、30、60 μmol/L)處理HGC-27細(xì)胞24 h后，隨著藥物濃度的升高，COX-2表達(dá)逐漸降低(見圖3)。

圖3 熊果酸對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞COX-2表達(dá)的影響
Fig 3 Effect of Ursolic acid on the expression of COX-2 in HGC-27 cells

2.4 熊果酸對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響 HGC-27細(xì)胞經(jīng)不同濃度熊果酸(0、15、30、60 μmol/L)處理24 h后，隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞核內(nèi)p-NF-κB(p65)表達(dá)量減少，呈濃度依賴性(見圖4)。

圖4 熊果酸對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞核內(nèi)p-NF-κB表達(dá)的影響
Fig 4 Effect of Ursolic acid on the expression of NF-κB in HGC-27 cells

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌臨床治療失敗和患者死亡的主要原因。胃癌早期無特異性表現(xiàn)，盡管胃鏡檢查能發(fā)現(xiàn)早期胃癌，但因其是一項(xiàng)侵入性檢查，多數(shù)患者不能接受，導(dǎo)致就診時(shí)已是中晚期。因此，長期以來，人們一直在尋找抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的新方法和策略。

細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的降解破壞在腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離穿過組織屏障、導(dǎo)致細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPS)是一類鋅離子依賴的細(xì)胞外蛋白水解酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)、破壞基底膜，促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移。MMP-9是MMPs中明膠酶的一種，在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原，參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移[7-8]。本實(shí)驗(yàn)采用Tanswell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力，其原理是將Matrigel膠鋪在人工膜表面，模擬體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)，腫瘤細(xì)胞必須借助自身分泌的一些蛋白酶破壞細(xì)胞外基質(zhì)后才可通過人工膜，繼而反映腫瘤細(xì)胞侵襲力的強(qiáng)弱。結(jié)果提示，熊果酸可通過下調(diào)MMP-9表達(dá)降低HGC-27細(xì)胞侵襲能力。

研究[9]證實(shí)，COX-2在許多上皮性質(zhì)腫瘤包括結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌及頭頸部腫瘤中過表達(dá)，且與不良預(yù)后密切相關(guān)[10-11]。過表達(dá)的COX-2又可產(chǎn)生大量的PGE2，共同參與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤血管新生、抑制抗腫瘤免疫等機(jī)制調(diào)控多種腫瘤發(fā)生、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移等[12]。因此，COX-2可能是抗腫瘤作用的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熊果酸處理后細(xì)胞COX-2表達(dá)顯著降低。

NF-κB作為炎癥反應(yīng)的調(diào)控基因，參與了COX-2的催化反應(yīng)，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測熊果酸對(duì)NF-κB/p65表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，熊果酸處理后，細(xì)胞核內(nèi)p-NF-κB(p65)表達(dá)量減少，呈濃度依賴性。提示熊果酸能抑制HGC-27細(xì)胞NF-κB由胞漿向核內(nèi)移位。

綜上所述，本研究結(jié)果提示熊果酸在體外可抑制胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力，其作用機(jī)制可能是通過抑制p-NF-κB(p65)表達(dá)進(jìn)而下調(diào)COX-2表達(dá)，降低MMP-9水平。其對(duì)其他腫瘤細(xì)胞作用及其抗腫瘤機(jī)制尚需進(jìn)一步探索和研究。

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(責(zé)任編輯：李 健)

Research of Ursolic acid inhibits cell invasiveness by suppressing the COX-2 expression in HGC-27 gastric cancer cells

FENG An,ZHOU Qingshan

Department of Intensive Care Unit,People’s Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China

Objective To investigate the effect of Ursolic acid on the cell invasiveness in HGC-27 gastric cancer cells and explore the possible mechanisms. Methods HGC-27 cells were cultured in vitro. The experiments were divided into two groups,including control group and experiment group. The control group received only the culture medium. After treatment by Ursolic acid in different concentrations (15 μmol/L,30 μmol/L and 60 μmol/L) respectively for 24 hours,the invasion of HGC-27 cells were tested by Transwell assay. Western blotting was used for MMP-9,COX-2 and p-NF-κB protein analysis. Results Compared with control group,the invasion of HGC-27 cells was significantly decreased in experiment group. The data of Western blotting showed that Ursolic acid decreased the expression of MMP-9,COX-2 and upstream effector of p-NF-κB in a dose-dependent manner. Conclusion Ursolic acid inhibits the cell invasion in HGC-27 cells,and the effects of antitumor may be associated with inhibition of the expression of p-NF-κB,down-regulating the expression of COX-2 and MMP-9.

Ursolic acid; HGC-27 cells; Invasiveness; Cyclouxygenase-2; NF-κB

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.02.019

豐安，碩士，研究方向：重癥監(jiān)護(hù)及治療。E-mail: fenganjzk@163.com

周青山，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：重癥監(jiān)護(hù)及治療。E-mail: zhougingshanzz@126.com

R735.2

A

1006-5709(2016)02-0184-04

2015-07-20