樓志堅(jiān)，戴利偉，張艷麗（.浙江星野集團(tuán)有限責(zé)任公司，浙江杭州3000）（.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州3004）

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固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)活性干酵母的研究

樓志堅(jiān)1，戴利偉2，張艷麗2
（1.浙江星野集團(tuán)有限責(zé)任公司，浙江杭州310010）
（2.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

摘要：以釀酒活性干酵母為對(duì)象，以麩皮、玉米粉、米糠為基本原料，經(jīng)固態(tài)培養(yǎng)基選擇優(yōu)化，酵母細(xì)胞數(shù)高于4.47×109CFU/g。在此基礎(chǔ)上加入一定量糖化酶、酸性蛋白酶，并對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，酵母細(xì)胞數(shù)高達(dá)6.0×109CFU/g。另外，在載體培養(yǎng)初步研究中，把玉米水解液加到多孔性材料中進(jìn)行酵母培養(yǎng)，酵母細(xì)胞數(shù)高于5.0×108CFU/mL。

關(guān)鍵詞：活性干酵母；固體培養(yǎng)；多孔性材料；糖化酶；酸性蛋白酶

活性干酵母主要應(yīng)用于面包、釀酒、酒精、調(diào)味料、飼料等方面，國外在40年代就開始進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)，尤以面包等發(fā)酵類食品為主食的國家，酵母的生產(chǎn)和研究極為重要［1］。早在1847年，奧地利有1.4×107磅的面包酵母用于面包制作［2］。一方面，隨著社會(huì)的發(fā)展，酵母及酵母生產(chǎn)工藝的改進(jìn)，酵母的需求量逐年遞增，同時(shí)酵母也用于家庭手工藝生產(chǎn)與日常發(fā)酵食品的制作；另一方面，酵母發(fā)酵對(duì)工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的副產(chǎn)物（糖蜜及其他形式的糖類和淀粉類物質(zhì)）的綜合利用有重要意義［3］。

目前，國內(nèi)以液體培養(yǎng)酵母為主，固體培養(yǎng)較少。固體發(fā)酵可節(jié)約大量生產(chǎn)用水，減少環(huán)境污染，同時(shí)固體發(fā)酵還減少了液體發(fā)酵中所必需的設(shè)備，如通風(fēng)設(shè)備、攪拌設(shè)備等，能耗低，降低了生產(chǎn)成本。但固體發(fā)酵不易得到純凈的產(chǎn)物。國外報(bào)道了利用多孔性物質(zhì)為載體培養(yǎng)酵母，為酵母提供一個(gè)較優(yōu)的培養(yǎng)環(huán)境，生產(chǎn)效率較高，同時(shí)提取產(chǎn)物方便，設(shè)備投資相對(duì)較少［4］。本論文對(duì)如何提高固態(tài)發(fā)酵酵母的產(chǎn)量進(jìn)行了研究，對(duì)培養(yǎng)條件作了初步的優(yōu)化，并對(duì)固態(tài)培養(yǎng)和載體培養(yǎng)兩種培養(yǎng)方式進(jìn)行了比較。

1　材料與方法

1.1菌種

釀酒活性干酵母（4.09×1010CFU/g），產(chǎn)于宜昌食用酵母基地。

取一定量的活性干酵母，用30℃左右溫水進(jìn)行活化（使整個(gè)物料體系水分控制在40%左右），在攪拌狀態(tài)下活化2 h左右。活化結(jié)束后，將一定配比的混合物料與菌液混合均勻，裝入塑料袋，置于30℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行自然發(fā)酵。

1.2原料

麩皮（自然狀態(tài)）、小麥（顆粒）、早秈米（顆粒）、玉米粉（粉碎過60目篩）、米糠粉（粉碎過60目篩），均來自杭州良圓糧食制品廠；玉米水解液、麥芽汁、大米水解液為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3酶制劑

糖化酶（50 000 U/g）、高溫淀粉酶（20 000 U/ mL）、中溫淀粉酶（6 000 U/g）均來自無錫酶制劑廠；酸性蛋白酶（3 000 U/g）為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.4酵母計(jì)數(shù)方法

酵母計(jì)數(shù)采用血球計(jì)數(shù)板法（計(jì)數(shù)板規(guī)格：0.1 mm，1/400 mm2，XB-K-25）。稱取10 g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，加90 mL無菌生理鹽水，充分混勻，1 000 r/min離心10 min，取上清稀釋適當(dāng)倍數(shù)，顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5葡萄糖含量測(cè)定

蘭-埃農(nóng)法［5］。稱取10 g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，加90 mL無菌水，充分混勻，3 000 r/min離心10 min，取上清，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，滴加到一定量沸騰的裴林試液中，用亞甲基蘭為指示劑，滴至剛好褪色。

1.6氨基氮測(cè)定

甲醛法測(cè)定［6］。

1.7二氧化碳排放量測(cè)定

氨吸收法［7］。

2　結(jié)果與討論

2.1固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1不同原料對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

酵母這類兼性微生物，在利用等量的能源物質(zhì)過程中，有氧環(huán)境生長(zhǎng)所得到的細(xì)胞產(chǎn)量比缺氧時(shí)高得多。由圖1可看出：?jiǎn)斡妙w粒狀小麥或早秈米進(jìn)行酵母培養(yǎng)，因其黏性大，通氣性不足，不能為酵母提供良好的有氧環(huán)境，因而酵母數(shù)較少。而麩皮材料結(jié)構(gòu)疏松，通氣性良好，再加入小麥、早秈米和玉米粉補(bǔ)充一定的碳源，在滿足通氣的前提下，同時(shí)彌補(bǔ)麩皮本身淀粉含量不足的缺陷，故而選擇玉米粉與麩皮組合。

圖1　不同原料對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

2.1.2米糠添加量對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

以米糠添加量進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：適當(dāng)比例的米糠與麩皮對(duì)提高酵母菌活菌數(shù)有一定的促進(jìn)作用，米糠在麩皮中的比例以5%最佳。米糠中含有少量淀粉和磷酸鹽物質(zhì)，具有補(bǔ)充碳源和無機(jī)鹽類的雙重作用。由圖2可知：米糠添加量對(duì)酵母菌活菌數(shù)的影響很明顯，但米糠粉（過60目）添加量不宜過大，否則會(huì)降低體系的通氣性，在一定程度上抑制酵母菌的增值。

圖2　米糠在麩皮中的比例對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

2.1.3固體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)

以酒精活性干酵母為生產(chǎn)菌，在三角瓶中進(jìn)行固體發(fā)酵，以麩皮、玉米粉、米糠粉為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

表1　正交因素水平表

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2的正交結(jié)果及極差分析可知：A，B，C三因素對(duì)酵母菌活菌數(shù)影響顯著性大小依次為B（麩皮）＞A（玉米粉）＞C（米糠粉）。分析結(jié)果表明A1B1C2為最佳組合，即酒精活性干酵母培養(yǎng)基優(yōu)化的最佳物料組合為：玉米粉3 g，麩皮4 g，米糠0.4 g。經(jīng)正交試驗(yàn)驗(yàn)證，物料組成為3 g玉米粉、4 g麩皮、0.4 g米糠時(shí)，酵母活菌數(shù)可達(dá)3.7×109CFU/g。

2.1.5糖化酶添加量對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

在上述優(yōu)化的物料配比的基礎(chǔ)上，將一定量的糖化酶液與活化好的酵母種子液一起拌入固定配比的物料中，進(jìn)行發(fā)酵。由圖3可知：隨著加酶量的增加，酵母活菌數(shù)逐漸增加，當(dāng)加酶量高于150 U/g時(shí)，酵母細(xì)胞數(shù)并無明顯增長(zhǎng)。結(jié)合經(jīng)濟(jì)效益，糖化酶添加量為150 U/g。

圖3　糖化酶添加量對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

2.1.6蛋白酶添加量對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

在上述優(yōu)化的物料配比的基礎(chǔ)上，將一定量的蛋白酶液（每克原料中分別添加5，10，15，20，25，30，40 U/g的酸性蛋白酶）與活化好的酵母種子液一起拌入固定配比的物料中，進(jìn)行發(fā)酵。由圖4可知：加酶量在20 U/g以上時(shí)，酵母活菌數(shù)并沒有多大變化，因此蛋白酶最佳添加量為20 U/g。

圖4　蛋白酶添加量對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

2.1.7酵母菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在因素的最佳指標(biāo)下進(jìn)行酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，即玉米粉3 g，麩皮4 g，米糠粉0.4 g，并添加150 U/g糖化酶和20 U/g蛋白酶。由圖5可知：酵母在0～32 h為延滯期，氨基氮利用量滯后于分解量，因而氨基氮量在增加，32～39 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，氨基氮用量迅速增加，氨基氮含量迅速下降，50 h以后酵母進(jìn)入衰退期。在整個(gè)變化過程中，水分蒸發(fā)量逐漸增加，進(jìn)入衰退期后，基本保持不變。二氧化碳排放量在進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)有較大增加，衰退期幾乎保持不變。酸度在整個(gè)生長(zhǎng)過程中保持pH 5.5不變。

圖5　酵母菌生長(zhǎng)曲線

2.2載體發(fā)酵初步研究

2.2.1載體顆粒大小對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

取玉米粉200 g，加水100 mL，調(diào)pH至5.5左右，添加3 U/g的中溫淀粉酶，1 000 U/g高溫淀粉酶，80～85℃加熱50 min，繼續(xù)加熱至100℃滅酶。調(diào)pH至4.5，添加150 U/g的糖化酶，60℃下放置20 h［8］。最終玉米水解液糖度為15.5，DE 值94.52。以玉米水解液為培養(yǎng)基，調(diào)整糖度為10度，植入0.5 g不同顆粒大小的多孔性PVC泡沫中，培養(yǎng)酵母菌。取一定量發(fā)酵結(jié)束的PVC泡沫浸泡到生理鹽水中一定時(shí)間，進(jìn)行血球板計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：PVC泡沫顆粒大小在2 mm左右時(shí)酵母的增值效果最佳。從最大表面積角度來說，球形是最佳的，在實(shí)際應(yīng)用中，以不阻礙該多孔性物質(zhì)運(yùn)動(dòng)為準(zhǔn)。

圖6　載體顆粒大小對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

2.2.2玉米水解液添加量對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

分別添加不同量的玉米水解液培養(yǎng)基，糖度為10度，植入0.5 g顆粒大小2 mm左右的多孔性PVC泡沫中，培養(yǎng)結(jié)果如圖7所示。經(jīng)分析，每克多孔性物質(zhì)添加15 mL玉米水解液最佳。當(dāng)液體過量，覆蓋整個(gè)物體的表面，會(huì)阻礙氧氣與菌體細(xì)胞的接觸，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，不利于菌體生長(zhǎng)。

圖7　玉米水解液添加量對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

2.2.3玉米水解液糖度對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

以15 mL不同糖度的玉米水解液為培養(yǎng)基，植入顆粒大小2 mm左右的多孔性PVC泡沫中，測(cè)定酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的情況，結(jié)果見圖8。由圖8可知：在低糖度的玉米水解液培養(yǎng)基中，由于養(yǎng)料不足，酵母細(xì)胞數(shù)較少。隨著糖度的增加，酵母數(shù)迅速增加，糖度大于10度時(shí)，酵母活菌數(shù)基本保持不變，所以最佳濃度為10度。

圖8　玉米水解液糖度對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

2.2.4載體培養(yǎng)酵母菌生長(zhǎng)曲線

以糖度為10度的玉米水解液為培養(yǎng)基，每克多孔性物質(zhì)添加15 mL玉米水解液，PVC泡沫顆粒大小2 mm左右，測(cè)定酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。由圖9可知：酵母在0～24 h為延滯期，細(xì)胞數(shù)增長(zhǎng)較慢，在20～32 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞增殖很快，同時(shí)糖的利用量大，二氧化碳排放增加；在32～38 h為穩(wěn)定期，糖量變化減慢，二氧化碳排放速度基本不變；38 h后進(jìn)入衰退期，糖量幾乎無消耗，二氧化碳排放量基本不變。在整個(gè)生長(zhǎng)過程中，水分蒸發(fā)量先逐漸增加，后略微減少。

圖9　載體培養(yǎng)酵母菌生長(zhǎng)曲線

3　結(jié)　論

本研究通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化固態(tài)培養(yǎng)釀酒活性干酵母，活菌數(shù)高達(dá)4.47×109CFU/g。添加一定量的麩皮、玉米粉、米糠、糖化酶和酸性蛋白酶后，活菌數(shù)提高了34.2%，高達(dá)6.0×109CFU/g。把玉米水解液植入到多孔性材料中進(jìn)行載體培養(yǎng)，酵母細(xì)胞數(shù)高于5.0×108CFU/mL，且后期酵母菌體的收集更方便，只需用緩沖液將菌體從PVC多孔性材料中沖洗下來。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Study on the production of active dry yeast by solid fermentation

LOU Zhijian1，DAI Liwei2，ZHANG Yanli2
（College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Abstract：The solid state fermentation medium of active dry Saccharomyces cerevisiae was optimized with bran，corn powder and rice bran as raw material. The number of yeast cells was higher than 4.47×109CFU/g. After further optimization of the culture medium with addition of certain amount of glucoamylase and acid protease，the number of yeast cells reached 6.0×109CFU/ g. Furthermore，the corn hydrolysate was added to the porous material during the carrier culture and the number of yeast cells was higher than 5.0×108CFU/mL.

Keywords：active dry yeast；solid fermentation；porous material；glucoamylase；acid proteinase

作者簡(jiǎn)介：樓志堅(jiān)（1965—），男，浙江義烏人，工程師，主要從事生物化工、安全生產(chǎn)方面的研究，E-mail：2488415594@qq. com.

收稿日期：2015-10-14

中圖分類號(hào)：TQ92

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-2214（2016）02-0098-05