哈志瑞，馬文有，沈春娟，沈　泉，馬吉銀（.寧夏伊品生物科技股份有限公司，寧夏銀川750000；.法國諾華賽分離技術上海有限公司，上海00000）

?

L-色氨酸色譜分離樹脂的篩選

哈志瑞1，馬文有1，沈春娟2，沈泉2，馬吉銀1
（1.寧夏伊品生物科技股份有限公司，寧夏銀川750000；2.法國諾華賽分離技術上海有限公司，上海200000）

摘要：通過L-色氨酸料液的成分分析，選定YP-001、YP-002、YP-003、YP-004四種樹脂對色氨酸微濾清液進行色譜分離。樹脂篩選結果顯示：樹脂YP-004對料液中色氨酸、無機鹽、糖的分離度最大，分離效果最為顯著。收集液分析結果表明：色譜處理后色氨酸占干基比重的90%以上，比處理前提高了近1倍左右。

關鍵詞：L-色氨酸；色譜分離樹脂；篩選

L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，廣泛存在于天然蛋白質(zhì)中，是人和各種動物生長發(fā)育不可缺少的必需氨基酸之一［1］，對人和動物的生長發(fā)育、新陳代謝起著重要的作用，被稱為第二必需氨基酸。L-色氨酸除在營養(yǎng)代謝中起重要作用外，還廣泛用于醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)。和其他生物工程產(chǎn)品一樣，L-色氨酸工業(yè)生產(chǎn)也常常會受到生產(chǎn)成本的制約，而在生產(chǎn)成本的構成中，分離純化等下游工程的成本占相當?shù)谋壤?］。目前國內(nèi)規(guī)模化生產(chǎn)L-色氨酸的企業(yè)主要采用三膜法+離交工藝提取色氨酸［3-7］，有的廠家仍使用傳統(tǒng)的活性炭脫色工藝，此提取工藝最大的問題是產(chǎn)品收率低、廢水排放量大、各項單耗高、設備一次性投資大，導致國內(nèi)L-色氨酸的生產(chǎn)成本高、利潤低。因此，采取有效措施提高L-色氨酸的收率是目前亟待解決的問題。

色譜分離技術通過混合物中各組分在色譜分離柱兩相間不斷進行著的分配過程實現(xiàn)分離，是目前最有效的混合物分離、分析方法［8］。眾所周知，色譜分離技術已被廣泛應用于實驗室分析，隨著色譜技術的不斷進步和行業(yè)發(fā)展，使得大規(guī)模的色譜分離技術被廣泛應用于石油化工、淀粉糖等產(chǎn)品的分離純化。通過不斷探索和工藝革新，色譜工藝已經(jīng)具備節(jié)省樹脂用量、節(jié)省再生劑和洗滌水用量、工藝靈活性高、操作簡單、投資費用低等優(yōu)點，正被更多的行業(yè)所關注［9］。

在不同產(chǎn)品的色譜分離工藝中，如何找到適合目標產(chǎn)物的分離樹脂非常關鍵。根據(jù)傳統(tǒng)離子交換工藝分離提取氨基酸工藝過程中樹脂的篩選經(jīng)驗［10～16］，找到適合色氨酸的色譜分離樹脂，使色氨酸與雜質(zhì)達到最大的分離度，并且保證色氨酸高純度和高收率是我們研究的重點。

本實驗與法國諾華賽分離技術有限公司合作，從YP-001（利用各種組分在色譜柱中的遷移速率不同來實現(xiàn)分離的層析色譜）、YP-002（利用固定相的結合專一性來分離分子的層析色譜）、YP-003（利用溶質(zhì)在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同而分離的分配色譜）及YP-004（依據(jù)料液中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的離子交換色譜）等四種功能性色譜樹脂入手，通過單柱色譜分離實驗探索色譜分離工藝在L-色氨酸分離純化中的可行性，期望尋求到適合色氨酸高效分離的色譜樹脂。進而應用到工業(yè)生產(chǎn)中，達到縮短L-色氨酸分離純化工藝路線，提高產(chǎn)品純度及結晶收率，降低L-色氨酸提取成本的最終目的。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

2.5 cm×40 cm中壓特制層析柱（上海五相儀器儀表有限公司），BSZ-30自動部分收集器（上海青浦滬西儀器廠），Agilent LC-1260 HPLC（安捷倫科技有限公司），Atago PAL-3糖度儀（ATAGO（愛拓）中國分公司），754紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司），pH 6.00顯色液，1%色氨酸標準液（天津科密歐化學試劑有限公司），YP-001樹脂（江蘇蘇青水處理工程集團有限公司），YP-002樹脂（漂萊特中國有限公司），YP-003、YP-004（陶氏化學公司）等。

1.2方法

1.2.1色氨酸發(fā)酵液的制備

色氨酸發(fā)酵液通過三級發(fā)酵獲得，其工藝流程如下：凍管→斜面→一級搖瓶→二級種子罐→發(fā)酵罐發(fā)酵→色氨酸發(fā)酵液。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂粉20 g/L。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉7.5 g/L，KH2PO41.5 g/L，（NH4）2SO44 g/L，MgSO4·7H2O 3.15 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 75.6 mg/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母浸粉1 g/L，KH2PO41.5 g/L，（NH4）2SO44 g/L，MgSO4·7H2O 3.15 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 75.6 mg/L。

發(fā)酵條件為：35℃，250～550 r/min，通風比為1～1.5 vvm，二級種子罐培養(yǎng)14 h左右，發(fā)酵罐培養(yǎng)32 h。

1.2.2色氨酸發(fā)酵液預處理

將色氨酸發(fā)酵液用截留分子量為150 kD的陶瓷膜進行除菌處理，陶瓷膜清液再經(jīng)0.2 μm膜過濾并脫氣處理后可進入色譜系統(tǒng)。

1.2.3色氨酸色譜分離樹脂篩選

將樹脂裝入單柱中，定量注入10 mL色氨酸預處理液。然后用2 g/L的氨水作為洗脫劑，按0.625 mL/min的流速將樹脂柱中的料液洗脫出來；按10 mL/管的收集量依次收集樹脂柱的出料，直到洗脫結束為止。試驗結束后，將收集到的樣品，按編號依次檢測電導率、還原糖、色氨酸濃度等參數(shù)。

1.2.4色氨酸濃度測定方法

HPLC法：高效液相色譜分離工作條件Agilent C18（3.5 μm，150 mm×4.6 mm）為分離柱，檢測波長：278 nm；柱溫為：39℃；流動相：V（0.03%KH2PO4溶液）：V（甲醇）= 90：10；流動相流速：1 mL/min。

1.2.5還原糖濃度測定方法

利用Atago PAL-3糖度儀測定發(fā)酵液中的還原糖濃度。

1.2.6電導率測定方法

使用雷磁DDSJ-308A電導率儀進行電導率測定。

2　結果與分析

2.1進料數(shù)據(jù)分析

對色氨酸陶瓷膜清液進行指標分析，其中色氨酸濃度測定基于HPLC分析后的外標法所得。結果如圖1，表1所示。

圖1　進料L-色氨酸HPLC圖譜

表1　進料L-色氨酸數(shù)據(jù)分析

通過進料分析，可以看出色氨酸陶瓷膜清液中其他雜質(zhì)含量達60%，嚴重影響色氨酸的一次結晶率。這些雜質(zhì)中糖、無機鹽占較大比例。因此選用合適的色譜樹脂將清液中的色氨酸與糖、無機鹽等雜質(zhì)分離開來，對提高產(chǎn)品收率將起到關鍵作用。

2.2各色譜樹脂對L-色氨酸的分離效果

針對色氨酸的料液分析，選用YP-001、YP-002、YP-003、YP-004四種有利于分離糖、鹽的不同類型的色譜樹脂對色氨酸微濾清液進行單柱分離試驗，結果參見圖2～5。由圖2～5可以看出：在單柱色譜分離條件下，各色譜樹脂對色氨酸清液中的主要雜質(zhì)分離效果差異明顯。YP-001分離效果最差，雜質(zhì)和色氨酸不能得到有效分離，YP-002和YP-003可以將色氨酸和雜質(zhì)進行部分分離，但會影響其收率。YP-004對色氨酸的分離效果最好，分離度最大。在連續(xù)的收集液中，無機鹽和糖主要集中在0.3～0.5 BV時流出樹脂柱，色氨酸集中到0.6～0.8 BV時流出樹脂柱，完全可以實現(xiàn)雜質(zhì)和色氨酸的有效分離。

圖2　YP-001對色氨酸的分離效果

圖3　YP-002對色氨酸的分離效果

圖4　YP-003對色氨酸的分離效果

圖5　YP-004對色氨酸的分離效果

2.3 YP-004色譜分離收集液分析

對YP-004色譜分離樹脂進行連續(xù)5批次的色譜分離驗證，其分離效果與圖5顯示的分離結果相一致（圖6所示），可以看出其對色氨酸與其他雜質(zhì)的分離度較大，重復性較好。對分離過程中0.6～0.8 BV時的收集液進行分析，結果如表2所示。由表2可知：使用色譜樹脂YP-004對色氨酸微濾清液進行色譜分離，收集液中糖和鹽得到了有效去除，色氨酸占干基比重近90%，比處理前提高了1倍。

圖6　YP-004色譜樹脂重復性驗證

表2　YP-004色譜分離收集液分析

3　結論

通過對色氨酸陶瓷膜清液的檢測分析和色譜樹脂的篩選試驗，發(fā)現(xiàn)色氨酸體系下無機鹽和糖是影響色氨酸純度的主要雜質(zhì)，色譜樹脂YP-004可以對其實現(xiàn)較好的分離，色譜收集液中色氨酸占干基比重比處理前提高了近1倍左右。

參考文獻：

［1］蔣婕，陳福旺，孟秀娟，等. L-色氨酸的研究進展［J］.畜牧與獸醫(yī)，2012（S1）：66-70.

［2］聞亞紅，劉杰，黃建民.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸的研究進展［J］.科技風，2014（2）：10-11.

［3］蘇毅.發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸工藝優(yōu)化［D］.天津：天津科技大學，2013.

［4］梅叢笑. L-色氨酸提取工藝的研究［D］.天津：天津輕工業(yè)學院，2000.

［5］劉旭紅，賴新生.膜技術在色氨酸提取工藝的應用［J］.發(fā)酵科技通訊，2010，39（1）：28-29.

［6］周廷保.膜技術在色氨酸提取工藝中的應用探討［J］.生物技術世界，2014（2）：163-163.

［7］葛方昕. L-色氨酸提取工藝的研究［D］.天津：天津輕工業(yè)學院，1999.

［8］劉宗利，王乃強，王明珠，等.模擬移動床色譜分離技術在功能糖生產(chǎn)中的應用［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工（創(chuàng)新版），2012（3）：70-73.

［9］李兆星，蔡振國.淺述色譜分離樹脂在生化產(chǎn)品純化上的工業(yè)應用［J］.化學推進劑與高分子材料，2006，4（5）：61-63.

［10］劉菊湘，劉國棟，閻虎生，等.用低交換容量聚苯乙烯型強酸性陽離子交換樹脂柱色譜分離中性氨基酸［J］.高等學?；瘜W學報，2001，22（12）：2100-2103.

［11］張保林，盛芬玲，陶祖貽.氨基酸與離子交換樹脂相互作用的研究（Ⅱ）——高濃度下離子交換樹脂超當量吸附氨基酸的機理［J］.高等學校化學學報，1992（6）：840-66.

［12］李爽，沈亞領，遲莉麗. L-谷氨酰胺在強堿性離子交換樹脂上的穩(wěn)定性［J］.氨基酸和生物資源，2000，22（4）：39-42.

［13］湯家芳，張一竹.氨基酸制備色譜—Dpsc離子交換樹脂柱分離發(fā)酵L-纈氨酸［J］.氨基酸和生物資源，2005，27（3）：43-45.

［14］李欣，張寶珠，趙玉紅，等.離子交換色譜法分離氨基酸實驗方法的改進［J］.實驗技術與管理，2014（6）：51-53.

［15］黃毅，袁小紅.離子交換分離混合氨基酸實驗方法的改進［J］.實驗科學與技術，2013，11（4）：35-36.

［16］劉菊湘，劉國棟，閻虎生，等.用離子交換樹脂脫除氨基酸與鹽混合液中的鹽［J］.離子交換與吸附，2000，16（6）：521-527.

（責任編輯：朱小惠）

Screening of chromatographic resin for L-tryptophan separation

HA Zhirui1；MA Wenyou1；SHEN Chunjuan2；SHEN Quan2；MA Jiyin1
（1. Ningxia Eppen Biotech Co.，Ltd.，Yinchuan 750000，China；2. Novasep Separation Technology Co.，Ltd.，Shanghai 200000，China）

Abstract：Based on the analysis of the components of L -tryptophan fermentation broth after micro-filtrate，four resins named YP-001，YP-002，YP-003 and YP-004 were selected for L-tryptophan separation. The results showed that YP-004 possessed the best separation performance for L-tryptophan，inorganic salt and sugar. The purity of tryptophan reached more than 90%after chromatographic separation，which was nearly 1 fold higher than that before chromatography.

Keywords：L-tryptophan；chromatographic separation resin；screening

作者簡介：哈志瑞（1982—），男，寧夏銀川人，工程師，碩士，研究方向為生物化工，E-mail：hazhirui8201@163.com.通信作者：馬吉銀高級工程師，E-mail：majiyin@eppen.com.cn.

基金項目：國家國際科技合作專項項目（2014DFA31280）

收稿日期：2016-03-11

中圖分類號：TQ92

文獻標志碼：A

文章編號：1674-2214（2016）02-0106-04