張義馨，張楊平，周錦敏，鄧　鋒（福建和泉生物科技有限公司，福建南平354200）

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接種量對(duì)螺旋霉素發(fā)酵生產(chǎn)的影響

張義馨，張楊平，周錦敏，鄧鋒
（福建和泉生物科技有限公司，福建南平354200）

摘要：在2 m3中試發(fā)酵罐上探討不同接種量對(duì)生二素鏈霉菌螺旋霉素發(fā)酵單位和發(fā)酵周期的影響，以最優(yōu)的接種量在60 m3發(fā)酵罐中進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化驗(yàn)證。結(jié)果表明：在2 m3發(fā)酵罐試驗(yàn)中接種量為16%（體積比）且發(fā)酵周期120 h時(shí)，發(fā)酵單位達(dá)到最高即4.72 g/L。在60 m3發(fā)酵罐上接種16%的二級(jí)種子液進(jìn)行20批放大驗(yàn)證，平均發(fā)酵單位達(dá)4.85 g/L。

關(guān)鍵詞：螺旋霉素；接種量；發(fā)酵單位；驗(yàn)證

螺旋霉素（spiramycin，SPM）是一種十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌具有較大的抑制作用。其生產(chǎn)方法是在液態(tài)培養(yǎng)基中接入生二素鏈霉菌（Streptomyces ambofaciens），發(fā)酵120～160 h獲得螺旋霉素含量為4.0～4.3 g/L的發(fā)酵液，然后通過溶媒萃取進(jìn)行分離純化［1-2］。在實(shí)際生產(chǎn)中存在發(fā)酵單位低、發(fā)酵周期長和設(shè)備利用率低的缺點(diǎn)，導(dǎo)致生產(chǎn)成本高。本研究通過考察不同接種量對(duì)發(fā)酵單位和發(fā)酵周期的影響，達(dá)到提高發(fā)酵單位且縮短發(fā)酵周期的目的。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌種

生二素鏈霉菌（S.ambofaciens）由福建和泉生物科技公司提供。

1.1.2培養(yǎng)基組成［3-5］

一級(jí)和二級(jí)種子培養(yǎng)基：葡萄糖15 g/L，玉米漿18 g/L，氯化鈉12 g/L，玉米蛋白粉8 g/L，硫酸銨2 g/L，泡敵2.5 g/L，碳酸鈣8 g/L，黃豆餅粉18 g/L，磷酸二氫鉀0.1 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：豆油13 g/L，玉米漿6 g/L，酵母浸粉2.5 g/L，氯化鈉10 g/L，磷酸氫二鉀1.8 g/L，泡敵0.33 g/L，碳酸鈣5 g/L，葡萄糖60 g/L，黃豆餅粉25 g/L，氯化銨5 g/L，磷酸二氫鉀0.8 g/L。

1.1.3主要設(shè)備與儀器

2 m3不銹鋼發(fā)酵罐、200 L不銹鋼二級(jí)種子罐、30 L不銹鋼一級(jí)種子罐、60 m3不銹鋼發(fā)酵罐、5 m3不銹鋼二級(jí)種子罐、120 L一級(jí)種子罐均為福建省輕安工程建設(shè)有限公司設(shè)備；實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（梅特勒FE20）；多功能微生物自動(dòng)測量分析儀（北京先驅(qū)ZY-300Ⅳ）；生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)HH-B11.420BS）；搖床（常州高德）；離心機(jī)（湖南湘儀L600）；生物顯微鏡（上海光學(xué)XSP-2CA）；在線溶氧電極（梅特勒）。

1.2培養(yǎng)條件［6-7］

一級(jí)種子培養(yǎng)：1）培養(yǎng)條件（溫度28℃，攪拌速度200 r/min，通風(fēng)比1：0.8 vvm，罐壓0.03 MPa）；2）移種條件（pH上升到6.2～6.3，菌絲濃度18%～20%，鏡檢呈密網(wǎng)狀）。

二級(jí)種子培養(yǎng)：1）培養(yǎng)條件（溫度28℃，攪拌速度180 r/min，通風(fēng)比1：0.8 vvm，罐壓0.03 MPa）；2）移種條件（pH下降至5.6～5.7，菌絲濃度18%～20%，鏡檢呈密網(wǎng)狀）。

發(fā)酵通風(fēng)比：0～5 h控制0.3 vvm，6～10 h控制0.45，11 h至pH回升至6.00控制0.55 vvm，當(dāng)pH回升至6.15控制0.45 vvm，pH回升至6.25控制0.35 vvm。

罐壓：0 MPa；溫度：28℃，pH回升至6.0控制25℃；攪拌：0～5 h控制35 Hz，6～80 h控制50 Hz，100 h控制35 Hz，130 h停止攪拌；放罐：pH上升至6.4且氨基氮開始回升即可放罐。

1.3方法

1.3.1測定方法

生物效價(jià)測定采用杯碟法［8］，鑒定菌為藤黃八碟球菌；總糖含量測定采用菲林滴定法；菌絲濃度的測定方法：取10 mL種子液或發(fā)酵液，3 500 r/ min離心10 min測量上清液體積，計(jì)算得出菌絲濃度（%）=（10-上清液體積）/10×100%；顯微鏡倍數(shù)：16×100；溶氧電極校正：發(fā)酵0 h時(shí)校正溶氧至100%。

1.3.2實(shí)驗(yàn)方法

將達(dá)到移種條件的二級(jí)種子液接入2 m3中試發(fā)酵罐中，裝料體積為1.2 m3，接種量梯度分別為12%、14%、16%、18%、20%（接種量%=二級(jí)種子液體積/0 h發(fā)酵液體積×100）。在發(fā)酵72 h之前每隔12 h取樣，72 h之后每隔24 h取樣離線測定菌濃、總糖及生物效價(jià)，整個(gè)發(fā)酵周期溶氧采用在線測定。考察不同接種量對(duì)微生物生長速度、發(fā)酵單位及發(fā)酵周期的影響，綜合考慮發(fā)酵單位和發(fā)酵周期從而確定最佳的接種量。最后將最佳接種量應(yīng)用于60 m3發(fā)酵罐中進(jìn)行20批次產(chǎn)業(yè)化驗(yàn)證。

2　結(jié)果與討論

2.1發(fā)酵過程理化指標(biāo)的變化

溶氧是微生物代謝重要的指標(biāo)之一，溶氧的變化直接或間接反應(yīng)了菌體的生長速度和基質(zhì)的消耗。從表1可以看出：接種量越大溶氧下降越快，并且達(dá)到最低溶氧的周期也短。

從整個(gè)發(fā)酵周期來看，最低溶氧在3.9%～6.3%之間，接種量為12%、14%、16%、18%、20%時(shí)達(dá)到最低溶氧周期分別為25、25、22、19和16 h，說明接種量越大微生物生長越快。

表1　發(fā)酵過程中溶氧的變化

葡萄糖、飴糖和豆油是生二素鏈霉菌的碳源，而葡萄糖和飴糖屬于速效碳源，豆油屬于遲效碳源。發(fā)酵前期總糖消耗的快慢直接反應(yīng)了微生物生長的快慢，當(dāng)速效碳源利用結(jié)束后，微生物利用遲效碳源進(jìn)入次級(jí)代謝。因此可以通過測定前期發(fā)酵液中總糖的含量判斷微生物的生長速度。由表2可以看出：在相同發(fā)酵周期的前提下，發(fā)酵前期接種量越大發(fā)酵液中的總糖含量越低；當(dāng)接種量達(dá)到20%時(shí)，36 h的總糖質(zhì)量濃度已經(jīng)達(dá)到了5.3 g/L；而接種量為12%時(shí)同期的總糖質(zhì)量濃度為12.5 g/L。

菌體濃度是抗生素發(fā)酵生產(chǎn)的一個(gè)重要指標(biāo)，菌體濃度的數(shù)值越大說明發(fā)酵液中菌體含量越多。從表3可以看出：螺旋霉素發(fā)酵的最高菌體濃度可達(dá)到40%，接種量為12%、14%、16%、18%、20%時(shí)達(dá)到最高菌體濃度的周期分別為60、 48、36、24和24 h，說明接種量越大微生物的生長速度越快，縮短了微生物生長適應(yīng)期，能在較短的時(shí)間里進(jìn)入生長對(duì)數(shù)期。

表2　發(fā)酵過程中總糖質(zhì)量濃度的變化

表3　發(fā)酵過程中菌體濃度的變化

2.2發(fā)酵過程中生物效價(jià)的變化

發(fā)酵水平和發(fā)酵周期直接影響到生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)成本。因此，在提高發(fā)酵水平的同時(shí)，應(yīng)重視發(fā)酵周期。發(fā)酵周期越短，發(fā)酵罐的利用率就越高，企業(yè)的產(chǎn)能就越大。從表4可以看出：1）接種量越大起步效價(jià)越高，這與接種量越大微生物的生長速度越快有關(guān)。2）接種量為18%、20%時(shí)，120 h后生物效價(jià)不增長或有所下降。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：在110 h時(shí)菌絲出現(xiàn)大量的“空泡”，這可能是因?yàn)橛捎诮臃N量太大導(dǎo)致前期微生物“瘋長”后期菌體提早老化，最后導(dǎo)致發(fā)酵至120 h后生物效價(jià)不增長甚至下降。3）接種量為16%時(shí)，120 h發(fā)酵單位達(dá)到4.72 g/L，144 h放罐時(shí)發(fā)酵單位為4.64 g/L。接種量過大或者過小，均會(huì)影響發(fā)酵單位和周期。過大會(huì)引起后期菌體提早老化，影響產(chǎn)物合成；過小會(huì)延長培養(yǎng)時(shí)間，降低發(fā)酵罐的使用率。因此，綜合考慮發(fā)酵水平和周期，接種量為16%且周期為120 h時(shí)發(fā)酵單位達(dá)到最高即4.72 g/L。

表4　發(fā)酵過程中生物效價(jià)的變化

2.3 60 m3發(fā)酵罐產(chǎn)業(yè)化驗(yàn)證

將2 m3中試發(fā)酵罐的最佳接種量應(yīng)用于60 m3罐中進(jìn)行20批次產(chǎn)業(yè)化驗(yàn)證，由表5可以看出這20批的發(fā)酵單位比較穩(wěn)定。最低發(fā)酵單位4.71 g/L，最高發(fā)酵單位5.12 g/L，平均發(fā)酵單位4.85 g/L。因此，通過優(yōu)化接種量，可以認(rèn)為接種量為16%且120 h左右放罐的發(fā)酵工藝產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)是可行的。

表5　60 m3罐發(fā)酵單位

3　結(jié)　論

本研究首先在2 m3中試發(fā)酵罐上考察不同接種量對(duì)發(fā)酵單位的影響，確定16%為最佳接種量，且發(fā)酵周期120 h時(shí)發(fā)酵單位最高達(dá)到4.72 g/L；其次，將中試的結(jié)果在60 m3發(fā)酵罐中進(jìn)行20批產(chǎn)業(yè)化驗(yàn)證，其平均發(fā)酵單位為4.85 g/L。通過優(yōu)化螺旋霉素發(fā)酵的接種量后，發(fā)酵單位比原來提高了8%且發(fā)酵周期縮短了20 h。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

The effects of inoculum volume on spiram ycin fermentation

ZHANG Yixing，ZHANG Yangpin，ZHOU Jinmin，DENG Feng
（Fujian Hequan Biological Technology Co.，Ltd.，Nanpin 354200，China）

Abstract：In this study，the effects of inoculum volume on spiramycin titer and fermentation period of Streptomyces ambofaciens were investigated in 2 m3pilot fermenters，and then industrial verification was carried out in 60 m3fermenters with optimized inoculum volume. The results showed that spiramycin titer reached 4.72 g/L with inoculum volume of 16%（V/V）after 120 h fermentation in 2 m3fermenters. Twenty batches of scale-up verifications were performed in 60 m3fermenters by inoculating 16%of seed broth and the average titer reached up to 4.85 g/L.

Keywords：spiramycin；inoculum volume；titer；verification

作者簡介：張義馨（1974—），男，福建建陽人，高級(jí)技師，主要從事抗生素發(fā)酵生產(chǎn)管理，E-mail：171067554@qq.com.

收稿日期：2016-01-05

中圖分類號(hào)：TQ92

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-2214（2016）02-0110-04