李銀英　張濤志

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院　鄭州　450014

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ABCC2-24C>T基因多態(tài)性對(duì)中國(guó)癲癇患者卡馬西平劑量和血藥濃度的影響

李銀英張濤志

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院鄭州450014

【摘要】目的觀察ABCC2-24C>T基因多態(tài)性對(duì)中國(guó)漢族癲癇患者卡馬西平維持劑量和血藥濃度的影響。方法以179例卡馬西平單藥治療3月以上的中國(guó)漢族癲癇患者為研究對(duì)象，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP )方法分析患者的-24C>T多態(tài)性；同時(shí)應(yīng)用HPLC法測(cè)定卡馬西平的穩(wěn)態(tài)血藥濃度。結(jié)果ABCC2-24C>T 三種基因型卡馬西平的維持劑量有顯著性差異，CC基因型攜帶者明顯高于TT基因型攜帶者(P<0.05)。-24C>T變異后血藥濃度有增加的趨勢(shì)，即CCT多態(tài)性影響卡馬西平的維持劑量，與其血藥濃度無(wú)相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】卡馬西平；癲癇；ABCC2；單核苷酸多態(tài)性

卡馬西平(carbamazepine，CBZ)是臨床上常用的一線抗癲癇藥物，應(yīng)用廣泛。但其治療窗窄且機(jī)體對(duì)該藥物的反應(yīng)個(gè)體差異大?；蚨鄳B(tài)性可導(dǎo)致藥物療效產(chǎn)生個(gè)體差異，是實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療的基礎(chǔ)核心要素。目前，公認(rèn)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp和MRP2在抗癲癇藥物的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用，能夠組成血腦屏障，限制藥物或異物通過(guò)血腦屏障[1]。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大鼠體內(nèi)MRP2被抑制后，其腦內(nèi)卡馬西平血藥濃度顯著增加，而MRP2編碼基因ABCC2的多態(tài)性亦可影響MRP2的表達(dá)和功能[2-3]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，ABCC2基因存在眾多單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，其中，C-24T(啟動(dòng)子區(qū))在中國(guó)人群中的變異頻率較高，且與MRP2的轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān)[4]。目前，尚未見(jiàn)C-24T多態(tài)性對(duì)卡馬西平血藥濃度和療效相關(guān)性的研究報(bào)道。本研究探討ABCC2-24C>T基因多態(tài)性對(duì)中國(guó)癲癇患者卡馬西平血藥濃度的影響，以期為臨床個(gè)體化用藥提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象179例患者均來(lái)自2010-11—2014-12鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門(mén)診，男97例，女82例；平均年齡(32.2±15.7)歲；平均體質(zhì)量(56.04±11.39)kg；平均病程(3.65±7.31)a。入組標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床醫(yī)生結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)、腦電圖和影像學(xué)檢查(MRI或CT)確診為癲癇，并按照1981年國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟(International League Against Epilepsy，ILAE)關(guān)于發(fā)作分類(lèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)確定發(fā)作類(lèi)型；正規(guī)、單用抗癲癇藥物卡馬西平，并使用該劑量維持3個(gè)月以上；自愿參加實(shí)驗(yàn)并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重不良反應(yīng)；藥物依從性差；患進(jìn)行性或退行性全身性疾病或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾??；患器質(zhì)性腦病，如腦部腫瘤；服用以下任何藥物之一：抗腫瘤藥物、細(xì)胞毒性藥物、類(lèi)固醇化合物、鈣離子拮抗劑、酚噻嗪類(lèi)藥物、抗生素等；有酒精或藥物濫用史；嚴(yán)重肝、腎功能不全患者。

1.2方法

1.2.1血樣采集：所有患者早上服藥前采集外周靜脈血2份，每份2 mL，1份檢測(cè)血藥濃度，另1份EDTA抗凝，用于基因組DNA提取。

1.2.2卡馬西平血藥濃度的測(cè)定：血樣離心后取上層血漿，采用HPLC法測(cè)定卡馬西平血藥濃度。為消除劑量、體質(zhì)量對(duì)血藥濃度的影響，將測(cè)定的穩(wěn)態(tài)血藥濃度除以患者每日每公斤體質(zhì)量的藥量(血藥濃度/體質(zhì)量劑量)使血藥濃度標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.3基因組DNA 提?。簯?yīng)用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根科技有限公司)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟提取血液基因組DNA，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4ABCC2-24C>T多態(tài)性分析:該位點(diǎn)多態(tài)性的分析采用限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)引物序列：上游引物5′- CTG TTC CAC TTT CTT TGA TGA -3′，下游引物 5′- TCT TGT TGG TGA CCA CCC TAA-3′。PCR反應(yīng)體系：DNA模板2 μL，2×Taq PCR Master Mix 聚合酶12.5 μL，上下游引物各加入2 μL(10 pmol)，最后加超純水至25 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性12 min，然后93 ℃變性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為211 bp。PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BpiI進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系：1 μL內(nèi)切酶BpiI，2 μL 10×Buffer，7 μL PCR產(chǎn)物和10 μL超純水，置37 ℃水浴4～16 h。

1.2.5瓊脂糖凝膠電泳：取7 μL酶切產(chǎn)物加入4%的瓊脂糖凝膠負(fù)極加樣孔，以gene finder為染色劑， 0.5×TBE液為電泳液，在100 V電壓下電泳30 min，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察條帶。

1.3統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較前先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)。2組計(jì)量資料間比較采用t檢驗(yàn)，3組計(jì)量資料間比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD法。以χ2檢驗(yàn)檢測(cè)等位基因和基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1基因型分析采用DNA 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析基因型，其中，ABCC2 -24C/C基因型樣本應(yīng)該觀察到56 bp和155 bp 2個(gè)條帶；而T/C基因型樣本則應(yīng)該觀察到211 bp、56 bp和155 bp 3條帶；T/T基因型樣本只能觀察到211 bp 1個(gè)條帶。判斷基因型的電泳圖見(jiàn)圖1。此外，通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序驗(yàn)證分析方法的可靠性，測(cè)序圖見(jiàn)圖2。

條帶L為DNA maker，條帶1.2表示T/T基因型，條帶3.4表示C/C基因型，條帶5.6表示T/C基因型

圖1ABCC2-24C>T基因多態(tài)性分型結(jié)果

圖Ⅰ：C/C基因型測(cè)序圖圖Ⅱ：T/C基因型測(cè)序圖圖Ⅲ：T/T基因型測(cè)序圖

圖2ABCC2基因-24C>T多態(tài)性位點(diǎn)測(cè)序圖

2.2等位基因和基因型分布ABCC2-24C>T分型成功的179例，C/C型108例，C/T型65例，T/T型6例，T等位基因的頻率為21.5%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，ABCC2-24C>T等位基因和基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)

2.3血藥濃度與基因型的關(guān)系179例患者卡馬西平的平均服藥劑量為(551±171)mg/d，平均血藥濃度為(5.94±1.61)mg·L-1。校正后的平均標(biāo)準(zhǔn)化濃度為(0.24±0.056) kg/L。血藥濃度和維持劑量/體質(zhì)量(Dose/Weight)無(wú)相關(guān)性(r=0.583，P>0.05)。

ABCC2-24C>T 三種基因型卡馬西平的維持劑量有顯著性差異(P<0.05)，TT>CT> CC，且CC基因型攜帶者明顯高于TT基因型攜帶者(P<0.05)。-24C>T變異后血藥濃度有增加的趨勢(shì)，即CC

表1　ABCC2-24C>T各基因型癲癇患者間卡馬西平的維持劑量、血藥濃度比較±s)

3討論

癲癇是一種常見(jiàn)的多病因引起的反復(fù)發(fā)作性的慢性腦部疾患，在神經(jīng)科的發(fā)病率僅次于腦血管疾病，既是常見(jiàn)病，更是我國(guó)目前的重大疾病之一。臨床上主要通過(guò)規(guī)范服用抗癲癇藥物控制發(fā)作。其中卡馬西平是目前使用率最高的抗癲癇藥物，可作為首選藥物用于多種癲癇發(fā)作類(lèi)型。雖然卡馬西平療效肯定、應(yīng)用廣泛，但其治療窗窄且血藥濃度、療效存在明顯的個(gè)體化差異。遺傳藥理學(xué)研究表明，藥物代謝酶或轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼基因的變異可能是造成藥物療效產(chǎn)生個(gè)體差異的原因之一。

國(guó)外研究表明，卡馬西平為MRP2的轉(zhuǎn)運(yùn)底物，而MRP2編碼基因ABCC2單核苷酸多態(tài)性能夠影響卡馬西平在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)[5-7]。研究顯示，ABCC2 c.1249G>A (417V>I)突變能夠減少CBZ在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)，最終導(dǎo)致CBZ中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)發(fā)生增多[6]。另一項(xiàng)研究也證實(shí)，417I攜帶者卡馬西平的轉(zhuǎn)運(yùn)能力低于野生型攜帶者[7]。而ABCC2 c.-24C>T(rs717620) 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在中國(guó)人群中變異頻率較高的位點(diǎn)。研究表明，ABCC2-24C>T變異后MRP2的轉(zhuǎn)運(yùn)活性降低，CT或TT型基因攜帶者依立替康的AUC0-∞略高于野生型基因攜帶者[8]。最近的研究顯示，ABCC2-24C>T能顯著增加甲氨喋呤的血藥濃度，T 等位基因攜帶者甲氨喋呤的血藥濃度明顯高于是CC型基因攜帶者，甚至引起患者出現(xiàn)毒性反應(yīng)[9]。本研究顯示，-24C>T變異后血藥濃度有增加的趨勢(shì)，即CCT多態(tài)性使MRP2的轉(zhuǎn)運(yùn)活性降低，細(xì)胞內(nèi)泵出的藥量減少，卡馬西平的清除率降低，因此，給藥量也相應(yīng)的有所降低，導(dǎo)致不同基因型患者維持給藥劑量有顯著差異。然而，不同基因型間血藥濃度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為減小服藥劑量及體質(zhì)量對(duì)血藥濃度的影響，用校正后的血藥濃度觀察基因型對(duì)血藥濃度的影響，結(jié)果三基因型間仍無(wú)顯著性差異。這可能與本研究的入選患者未經(jīng)過(guò)基因篩選，突變型患者樣本量太少，影響統(tǒng)計(jì)效能有關(guān)。此外，藥物的體內(nèi)處置是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，卡馬西平的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)經(jīng)MRP2，P-gp和MRP1等多個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體的介導(dǎo)，MRP2在這一過(guò)程中也可能并不起主要作用，正如本研究所示ABCC2-24C>T單核苷酸多態(tài)性不影響卡馬西平的血藥濃度。Soobitha等[10]研究也表明，ABCC2 1249G>A和-24C>T多態(tài)性對(duì)卡馬西平的體內(nèi)處置影響有限，與其療效無(wú)相關(guān)性。與此相反，Ufer等[11]研究顯示，在癲癇患者中，T等位基因攜帶者抗癲癇藥物的療效較差，但其認(rèn)為-24C>T多態(tài)性通過(guò)上調(diào)MDR1的表達(dá)從而加速卡馬西平的體內(nèi)清除。

總之，本研究首次在中國(guó)漢族癲癇患者中研究了ABCC2-24C>T單核苷酸多態(tài)性對(duì)卡馬西平維持劑量和藥物濃度的影響，為卡馬西平治療方案優(yōu)化和癲癇患者個(gè)體化給藥提供了有價(jià)值的信息。但如其他藥物基因組學(xué)的研究一樣，由于不同研究者入選患者和樣本量的不同，研究結(jié)果常常不一致，因此本研究需要更大的樣本量驗(yàn)證研究結(jié)果。

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(收稿 2015-07-14)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R742.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673-5110(2016)08-0075-03