馮歡歡 張一凡 任雪 徐彩紅

摘要：建立一種維生素D3（VD3）在大鼠體內(nèi)濃度的測(cè)定方法，為食品中營(yíng)養(yǎng)素的生物利用研究奠定基礎(chǔ)。采用RP-HPLC法進(jìn)行檢測(cè)分析；采用甲醇沉淀蛋白結(jié)合乙醚液液萃取法進(jìn)行血漿樣品處理。結(jié)果表明：低、中、高3個(gè)濃度VD3的提取回收率分別為87.8%±5.14%，85.4%±3.00%和89.6%±5.71%；日內(nèi)、日間的精密度分別小于5.12%和6.30%。該方法靈敏度高、穩(wěn)定性好，可作為食品、藥學(xué)研究中大鼠體內(nèi)吸收動(dòng)力學(xué)相關(guān)試驗(yàn)研究的檢測(cè)分析方法。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；25-羥基維生素D3；大鼠血漿

中圖分類號(hào)：R446.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-1161（2016）02-0047-03

維生素D（Vitamin D，VD）是一種脂溶性維生素，見(jiàn)光極易分解，其作用主要是調(diào)節(jié)人體內(nèi)鈣和磷的代謝，促進(jìn)其吸收利用，促進(jìn)骨骼成長(zhǎng)[1-2]。VD的主要活性形式有25-羥基維生素D3[25（OH）VD3]，1，25-二羥基維生素D3 [1，25（OH）2VD3]和24，25-二羥基維生素D3[24，25（OH）2VD3]3種。其中25（OH）VD3為血液中VD的主要循環(huán)形式，是顯示VD狀況的一個(gè)最佳指標(biāo)[3]，但其在血清中濃度相當(dāng)?shù)?，一般檢測(cè)方法無(wú)法檢出[4-5]。為此，本課題參考相關(guān)文獻(xiàn)，建立一種利用高效液相色譜法檢測(cè)維生素D3（VD3）的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

維生素D3（VD3，純度99.9%）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）：上海永日藥品貿(mào)易有限公司；甲醇（色譜純）：山東禹王化工制品有限公司；無(wú)水乙醚（分析純）：天津凱信化工制品有限公司；其他試劑均為分析純；水為自制二蒸水。

1.2 供試動(dòng)物

雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量220±30 g，由沈陽(yáng)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 儀器設(shè)備

1200系列高效液相色譜儀，包括1200泵系統(tǒng)和可調(diào)波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和工作站：美國(guó)Agilent公司；Avanti J-E離心機(jī)：BECKMAN COULTER公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ODS HYPERSIL C18色譜柱（200.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇—水（98∶2，V/V）；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；進(jìn)樣量：20 μL；儀器靈敏度：0.001 AUFS。

1.4.2 血漿樣品處理 精密量取大鼠血漿100 μL，置10 mL具塞離心試管中，加入甲醇200 μL，渦旋混合1 min，加入無(wú)水乙醚2.0 mL，渦旋3 min，6 000 r/min離心5 min，吸取有機(jī)層1.5 mL置另一5 mL試管中，殘液中再加入無(wú)水乙醚2.0 mL。重復(fù)上述提取過(guò)程，合并兩次提取液，于40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?。殘留物?00 μL流動(dòng)相溶解，渦旋振蕩3 min，將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP離心試管中，12 000 r/min離心10 min，取上清液20 μL進(jìn)樣，記錄藥物峰面積，并代入當(dāng)天制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算血漿中藥物濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜行為

在本試驗(yàn)所采用的色譜條件和血樣處理方法下，大鼠空白血漿色譜圖見(jiàn)圖1中A；一定濃度的VD3溶液加入空白血漿中的色譜圖見(jiàn)圖1中B，VD3的保留時(shí)間為8.165 min；大鼠給藥后某時(shí)間點(diǎn)的血漿樣品色譜圖見(jiàn)圖1中C。結(jié)果表明：血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾血漿中藥物濃度測(cè)定。藥物色譜峰的理論板數(shù)均不低于2 000，藥物與雜質(zhì)峰的分離度大于2.0。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性關(guān)系與最低定量濃度

在大鼠空白血漿中分別添加適量VD3使血藥濃度相當(dāng)于0.15，0.40，0.60，1.00，2.00和5.00 μg/mL，按血漿樣品處理方法操作，將所得數(shù)據(jù)回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=42.11 x-7.73，R=0.999 0。最低定量濃度為0.125 μg/mL（RSD=7.81%，n=3）。

2.3 精密度

配制低、中、高3個(gè)濃度的VD3大鼠血漿樣品溶液（0.40，1.00，2.00 μg/mL），每一濃度進(jìn)行6個(gè)樣本分析，考察日內(nèi)和日間精密度（見(jiàn)表1）。結(jié)果表明：日內(nèi)、日間精密度（RSD）均小于15%，準(zhǔn)確度（RE）在±10%范圍內(nèi)，均符合生物樣品分析測(cè)定的要求。

2.4 提取回收率

配制低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，按血漿樣品處理方法操作，每一濃度進(jìn)行6個(gè)樣本分析，評(píng)價(jià)該方法的提取回收率（見(jiàn)表2）。結(jié)果表明：大鼠血漿中VD3低、中、高3個(gè)濃度下的提取回收率均高于80%。

2.5 凍融穩(wěn)定性

取空白大鼠血漿100 μL，分別配制低、中、高3個(gè)濃度的QC樣品，每一濃度進(jìn)行3個(gè)樣本分析，反復(fù)凍融3次，每次復(fù)融后，按血漿樣品處理方法操作，殘留物以100 μL流動(dòng)相溶解，進(jìn)樣分析（見(jiàn)表3）。結(jié)果表明：100 μL血漿樣品中VD3反復(fù)凍融3次后穩(wěn)定。

3 結(jié)論與討論

維生素D是人體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，在維持機(jī)體代謝和預(yù)防疾病方面也發(fā)揮著重要作用。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)和免疫測(cè)定法來(lái)檢測(cè)循環(huán)中總的維生素D（D2和D3），而本試驗(yàn)選擇25（OH）VD3最強(qiáng)吸收波長(zhǎng)265 nm處HPLC檢測(cè)，采用沉淀蛋白結(jié)合乙醚液液萃取的血漿樣品處理方法，避免了血漿內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾，該方法靈敏度高、穩(wěn)定性好。

VD3在光照條件下不穩(wěn)定，會(huì)有一定程度的降解，因此，本試驗(yàn)操作全程避光。血漿樣品的處理中，提取劑的選擇尤為重要，不少研究曾用過(guò)不同比例的正己烷與二氯甲烷或正己烷與乙醚的混合溶劑提取[6-9]，但是本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：以二氯甲烷和正己烷（4∶1，V/V）作為提取劑，樣品濃縮吹干耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，色譜峰中雜質(zhì)較多；若以純正己烷提取，VD3的提取率較低。經(jīng)過(guò)多次嘗試，最終選用甲醇沉淀蛋白，而后采用無(wú)水乙醚液液萃取法來(lái)提取VD3，結(jié)果表明：VD3的提取率穩(wěn)定在85%以上，色譜圖顯示血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定。該檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、靈敏、穩(wěn)定、可靠，適用于大量樣本的分析，尤其適用于食物或藥品中VD3在大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究。

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