姚 琳，余麗麗，梁 飛，尤 靜，張雋榮，寧梓任

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

兩親性聚合物是一種高分子表面活性劑，將兩種不同性質(zhì)的嵌段鏈接在一起而形成，既有親水性又含有親脂性[1]，在水溶液中其疏水部分形成內(nèi)核，親水部分形成外殼[2]，內(nèi)核可以將疏水性藥物增容在核心，降低藥物的毒副作用，外殼可對(duì)藥物起保護(hù)作用，提高藥物穩(wěn)定性，同時(shí)通過對(duì)外殼進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾可以達(dá)到靶向作用[3]。而刺激響應(yīng)型聚合物膠束體系可依靠不同pH[4]、溫度[5]、氧化還原電位[6]、光照[7]、磁場[8]等達(dá)到靶向釋放藥物的目的。近年來，二硫鍵能夠?qū)入赘孰?GSH)作出氧化還原響應(yīng)的這種能力被用作了細(xì)胞內(nèi)可觸發(fā)釋放的藥物載體的構(gòu)建，如MuhammadEjaz等[9]設(shè)計(jì)合成了一種含二硫鍵交聯(lián)結(jié)構(gòu)的聚甲基丙烯酸羥乙酯水凝膠，并驗(yàn)證了其GSH響應(yīng)能力。Wang等[10]通過聚ε-己內(nèi)酯(PCL)末端巰基與聚乙基乙烯磷酸(PEEP)末端吡啶基間的偶聯(lián)反應(yīng)，在PCL與PEEP之間引入單二硫鍵橋，并將此作為還原環(huán)境敏感性鏈接臂，合成了二嵌段聚合物PCL-SS-PEEP，其在水溶液中能夠自組裝成還原環(huán)境敏感型納米顆粒。

為此，作者以ε-己內(nèi)酯、聚乙二醇單甲醚(mPEG)為原料，通過偶聯(lián)反應(yīng)在聚乙二醇單元與聚己內(nèi)酯單元之間引入二硫鍵合成一種新型的兩親性嵌段共聚物mPEG-SS-PCL，在對(duì)PCL進(jìn)行改性的基礎(chǔ)上增加刺激響應(yīng)能力，使其有可能成為一種有效的藥物載體。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

聚乙二醇單甲醚-2000(mPEG-2000)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，AlfaAesar；對(duì)硝基苯基氯甲酸酯(p-NPC)、2,2′-二硫二吡啶(Py-SS-Py)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；二硫蘇糖醇(DTT)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%、辛酸亞錫[Sn(Oct2)]：質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%、ε-己內(nèi)酯：質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%、甲醇鈉：質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%、2-巰基吡啶(Py-SH)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，均為阿拉丁試劑；胱胺二鹽酸鹽：質(zhì)量分?jǐn)?shù)96%，百靈威科技有限公司；2,2′-二硫二乙醇(HES)：Sigma-Aldrich；吡啶(pyridine)：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

核磁共振波譜儀：AVANCEⅢ400MHz、傅里葉變換紅外光譜儀：TENSOR27，德國BRUKER公司；紫外可見分光光度計(jì)：UV-2102pcs，尤尼柯(上海)儀器有限公司；馬爾文激光粒度儀：ZEN3600，真空干燥箱：MalvernZetamasterUK；DZF-6050，上海旋軒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-2000A，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；三用紫外儀：ZF-Z、臺(tái)式高速離心機(jī)：TGL-16C，上海亭安電子儀器廠。

1.2 聚合物mPEG-SS-PCL的合成

1.2.1 親水端——mPEG-SS-Py的合成

mPEG-SS-Py的合成路線見圖1。

圖1 mPEG-SS-Py的合成路線

具體合成步驟如下：將干燥的mPEG-2000(4g，2mmol))和吡啶(0.806mL，10mmol)溶于25mL二氯甲烷(DCM)，通N2，將p-NPC(1.614g，8mmol)溶于15mLDCM，0 ℃下逐滴滴加至反應(yīng)體系，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，冰浴沉降于乙醚中，抽濾真空干燥得到白色粉末狀產(chǎn)物mPEG-NPC3.07g，轉(zhuǎn)化率72.4%。

將mPEG-NPC(2.12g，約1mmol)溶于10mL二甲基亞砜(DMSO)，胱胺二鹽酸鹽(0.9g，4mmol)溶于25mLDMSO，加入2mL三乙胺，混勻后加入上述反應(yīng)體系中，室溫反應(yīng)24h，通過薄層色譜(TLC)法檢測產(chǎn)物生成情況。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入截留分子量為1 000的透析袋中，透析24h，收集濃縮液，真空干燥得白色粉末狀產(chǎn)物mPEG-Cy1.60g，轉(zhuǎn)化率73.5%。

將mPEG-Cy(1.31g，約0.6mmol)、DTT(0.37g，2.4mmol)溶于30mL水中，用鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%)調(diào)節(jié)pH至1.5，室溫反應(yīng)36h。待反應(yīng)結(jié)束后，用NaOH(1.0mol/L)將pH調(diào)至中性，轉(zhuǎn)入截留分子量為1 000的透析袋中，透析24h，收集濃縮液，真空干燥得淡黃色固體粉末mPEG-SH0.95g，轉(zhuǎn)化率75.3%。

將mPEG-SH(0.66g，約0.3mmol)、Py-SS-Py(6.6mg，0.03mmol)、Py-SH(3.3mg，0.03mmol)溶于25mL水中，用鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%)調(diào)節(jié)pH至1.5，氮?dú)獗Ｗo(hù)下30 ℃水浴反應(yīng)24h，期間可通過TLC法檢測產(chǎn)物生成情況。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入截留分子量為1 000的透析袋中，透析24h，收集濃縮液，冷凍干燥重得到白色粉末狀產(chǎn)物mPEG-SS-Py0.411 3g，轉(zhuǎn)化率62.0%。

1.2.2 酯端——巰基聚己內(nèi)酯PCL-SH的合成

巰基聚己內(nèi)酯PCL-SH的合成路線見圖2。

圖2 PCL-SH的合成路線

具體合成步驟如下：以Sn(Oct)2為催化劑，HES為引發(fā)劑，發(fā)生開環(huán)聚合反應(yīng)生成PCL-SS-PCL，具體步驟如下：將干燥后的HES(0.308g，2mmol)、ε-己內(nèi)酯(4.566g，40mmol)單體，Sn(Oct)2(4.6mg)混勻后通氮?dú)?10 ℃反應(yīng)5h。反應(yīng)結(jié)束后用少量THF溶解，冰浴沉降于乙醚中，離心分離，真空干燥得白色粉末狀產(chǎn)物PCL-SS-PCL3.02g，轉(zhuǎn)化率62.9%。

將PCL-SS-PCL(1.414g，約0.3mmol)和DTT(0.308g，2mmol)溶于18mLTHF，通N2，加入2mL甲醇鈉，25 ℃氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)30h。反應(yīng)結(jié)束后，用少量THF溶解，冰浴沉降于乙醚中，離心分離，真空干燥得白色粉末狀產(chǎn)物PCL-SH1.10g，轉(zhuǎn)化率77.8%。

1.2.3 聚合物mPEG-SS-PCL的合成

mPEG-SS-PCL的合成路線見圖3。

圖3 mPEG-SS-PCL的合成路線

具體合成步驟如下：將0.300gmPEG-SS-Py溶于5mLDCM，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3.0，將0.320gPCL-SH溶于5mLDCM，滴加至反應(yīng)體系30 ℃氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后，冰浴沉降于乙醚中，離心分離，冷凍干燥得白色固體粉末mPEG-SS-PCL0.3524g。

1.2.4 200μL5mol/L的鹽酸

采用Ellman法[5]測定聚合物中的二硫鍵含量。分別取不同濃度胱胺二鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.020 8，0.025 0，0.031 3，0.035 7，0.041 7，0.062 5mg/mL)1mL，加1.0mL去離子水、1.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的NaBH4，37 ℃恒溫震蕩(100r/min)反應(yīng)1h，加200μL濃度為5mol/L的 鹽酸，用1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至8，加3mL0.08mg/mL的5,5′-二硫代雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)顯色30min，在λ= 412nm處測吸光度Abs值。以吸光度A對(duì)胱胺鹽酸鹽濃度ρ作圖，將二硫鍵折算成胱胺鹽酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=21.005 8ρ-0.212 98，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 6，線性關(guān)系良好，可作為定量分析的依據(jù)。

取mPEG-SS-PCL2mg用上述方法測定412nm處的吸光度A，計(jì)算樣品的二硫鍵接入率。

1.3 聚合物的膠束化研究

1.3.1 阿霉素(DOX)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以去離子水(娃哈哈)為溶劑，配制ρ(DOX)=5、10、15、20、30、40μg/L梯度的水溶液，分別在DOX最大吸收波長485nm處測其吸光度值，以ρ(DOX)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.021 62ρ-0.004 92，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 29，說明在5～40μg/L，線性良好，可以進(jìn)行定量分析。

1.3.2 空白膠束的制備

在避光條件下，精密稱取聚合物1.0mg，溶解于1mLTHF中，攪拌使聚合物在溶劑中充分舒展后(30min)，向體系中緩慢加入234.6μL(質(zhì)量分?jǐn)?shù)19%)水，攪拌2h，緩慢加入4mL水，40 ℃真空干燥至無THF，定容至10mL。

1.3.3 載藥膠束的制備

采用透析法將10mg聚合物溶于750μLTHF和250μLDMF的混合溶液中，分別稱取不同量(1、2、3、4、5mg)的DOX·HCl溶于250μL的DMF中，向體系中滴入1滴三乙胺(TEA)，使得DOX·HCl轉(zhuǎn)變?yōu)镈OX，加入聚合物溶液中，磁力攪拌30min，使得聚合物結(jié)構(gòu)充分舒展，DOX充分分散。緩慢的滴加入5mL水中，繼續(xù)攪拌1h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去體系中的THF，得到紫紅色溶液。裝入截留分子量1 000的透析袋，以超純水為透析液除去未包載的DOX，每2h換一次透析液，透析12h后，將樣品定容至10mL，即為載藥膠束樣品，將五組樣品將分別標(biāo)記為Z1、Z2、Z3、Z4、Z5待測。

1.3.4 空白膠束和載藥膠束粒徑的測定

采用動(dòng)態(tài)光散射粒徑測定儀(DLS)對(duì)空白膠束和載藥膠束在溶液中的粒徑進(jìn)行測定。在進(jìn)行膠束粒徑測定前，分別取空白膠束和載藥膠束各1mL用蒸餾水定容至50mL，超聲10min，用0.45μm微孔濾膜過濾，再進(jìn)行測定。

1.3.5 載藥膠束的藥物包封率和載藥量的測定

取0.2mL的載藥膠束樣品置于棕色瓶內(nèi)，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35 ℃旋干，加入2mL[V(DMSO)∶V(DCM)=1∶1]的混合溶劑溶解，超聲溶解10min后，用臺(tái)式高速離心機(jī)離心10min，取上清液，在485nm波長處測其吸光度值。根據(jù)DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及公式1、2計(jì)算出載藥膠束的載藥量及包封率。

(1)

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合物的結(jié)構(gòu)表征

mPEG-SS-PCL的紅外圖譜見圖4。

σ/cm-1圖4 mPEG-SS-PCL的紅外圖譜

PCL-SH(400MHZ,DMSO-d6的1HNMR圖譜見圖5。

其中：δ=4.45～4.48為端基和羥基相連的CH2峰(—CH2OH)，δ3.37為聚己內(nèi)酯與酯基氧相連的CH2峰(—CH2—O—CO—)，δ=2.08為聚合部分與酯羰基相連的CH2峰(—COCH2—)，δ=1.82～1.86為與巰基間隔一位的CH2峰(—CH2CH2SH)，δ=1.37～δ1.44為聚合部分碳鏈CH2峰(—COCH2CH2CH2CH2CH2O—)，δ=1.21～1.25為聚合部分碳鏈最中間CH2峰(—COCH2CH2CH2CH2CH2O—)，因離酯基較遠(yuǎn)，所以更靠近高場。

δ圖5 PCL-SH的核磁氫譜

mPEG-SS-PCL(400MHZ,DMSO-d6的1HNMR見圖6。

δ圖6 mPEG-SS-PCL的氫譜

其中：δ=3.51～3.52為mPEG中CH2特征峰(—CH2CH2O—)，δ=3.17為端基CH3O—信號(hào)峰，δ=2.09為疏水部分PCL與羰基相連CH2峰(—CH2CO—)，δ=1.92為—SS—右側(cè)CH2—的信號(hào)峰，δ=1.67為PCL碳鏈CH2峰(—COCH2CH2CH2CH2CH2CH2O—)，δ=1.47為PCL碳鏈最中間CH2信號(hào)峰(—COCH2CH2CH2CH2CH2O—)。

為了進(jìn)一步確定該聚合物結(jié)構(gòu)，采用Ellman法對(duì)二硫鍵的含量進(jìn)行了測定，實(shí)驗(yàn)測得該聚合物在412nm處測的吸光度為0.655，折算后2mg聚合物中二硫鍵的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為56.8%，說明聚合物結(jié)構(gòu)中成功接入二硫鍵。

2.2 兩親性二嵌段聚合物的膠束化研究

2.2.1 空白膠束和載藥膠束的粒徑

結(jié)果測得空白膠束的平均粒徑為117.7nm，粒徑分布(PdI)為0.162，載藥膠束的平均粒徑為146.1nm，粒徑分布(PdI)為0.220；載藥后聚合物的粒徑及分布都相應(yīng)增加，可證明阿霉素已經(jīng)載入膠束內(nèi)。

2.2.2 載藥膠束包封率和載藥量的測定

不同ρ(DOX)聚合物的載藥量和包封率見表1。

表1 聚合物膠束的載藥量和包封率

結(jié)果表明隨著聚合物中ρ(DOX)的增加，載藥量和包封率逐漸增加，最高載藥量和包封率分別為16.28%、54.26%，說明脂溶性內(nèi)核對(duì)阿霉素的增溶作用良好，促進(jìn)了其藥物包載能力。

3 結(jié) 論

通過七步反應(yīng)在聚乙二醇單元與聚己內(nèi)酯單元之間合成了一種新型的二硫鍵鏈接的兩親性嵌段聚合物mPEG-SS-PCL，該聚合物能通過自組裝形成膠束，并且對(duì)脂溶性藥物DOX具有良好的載藥能力，最高載藥量為16.28%，包封率為54.26%。由于二硫鍵的引入，預(yù)測其具有氧化還原敏感性，可作為有效的藥物載體進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

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