陳　婷，劉　平，王嘉翔，單　多，車　雯，張麗娟

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·實(shí)驗(yàn)論著·

表沒食子酸酯對(duì)高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

陳婷，劉平，王嘉翔，單多，車雯，張麗娟

Citation:Chen T, Liu P, Wang JX,etal. Effect of epigallocatechin-3-gallate against oxidative stress induced by high glucose in human lens epithelium cells.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(6):1029-1031

摘要

目的：探討表沒食子酸酯(EGCG)對(duì)高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cells，HLEC)氧化應(yīng)激的影響。

方法：建立高糖誘導(dǎo)的HLEC氧化損傷模型，用不同濃度的EGCG干預(yù)，MTT檢測(cè)細(xì)胞活力，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，Hoechst-PI染色觀察細(xì)胞凋亡，分光光度計(jì)檢測(cè)上清液中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)的含量。

結(jié)果：MTT結(jié)果顯示用10μmol/L EGCG和100μmol/L EGCG處理后，HLEC活性分別提高到50.33%±3.52%和63.33%±4.63%，與氧化損傷組(32.67%±3.10%)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EGCG干預(yù)的高糖條件下的HLEC較好地保持了細(xì)胞的形態(tài)，凋亡細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px水平升高，MDA水平下降。

結(jié)論：EGCG可能通過提高細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px含量，降低MDA含量發(fā)揮其較強(qiáng)的抗氧化作用，從而為尋求有效的防治白內(nèi)障藥物提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：EGCG；高糖；晶狀體上皮細(xì)胞；氧化應(yīng)激

引用：陳婷，劉平，王嘉翔，等.表沒食子酸酯對(duì)高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響.國(guó)際眼科雜志2016;16(6):1029-1031

0引言

糖尿病是一組由于胰島素作用障礙和/或胰島素分泌缺陷所致的、以高血糖為特征的代謝性疾病。長(zhǎng)期高血糖與持續(xù)代謝紊亂可導(dǎo)致全身組織器官，特別是心血管、腎、眼及神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙。高血糖導(dǎo)致晶狀體纖維腫脹變性，晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，引起晶狀體透明度改變，最后形成白內(nèi)障[1]。表沒食子酸酯(EGCG)是從茶葉中提取的主要的兒茶素之一，具有增強(qiáng)抗氧化物酶活性的作用，可有效清除自由基，延緩細(xì)胞及組織衰老[2-3]。本文通過體外實(shí)驗(yàn)初步研究了EGCG對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelium cells，HLEC)氧化損傷的影響，從而為其用于防治糖尿病性白內(nèi)障提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料HLEC(美國(guó)ATCC公司)，EGCG(美國(guó)Sigma公司，純度為>98%)，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，MTT試劑盒(中國(guó)上海伯奧生物制品公司)，Hoechst-PI雙染試劑盒(美國(guó)BD公司)，過氧化物歧化酶(SOD)、GSH-Px(谷胱甘肽過氧化物酶)及丙二醛(MDA)活力測(cè)定試劑盒(中國(guó)南京建成生物工程研究所)。

1.2方法

1.2.1 HLEC的培養(yǎng)HLEC培養(yǎng)在內(nèi)含鏈霉素100μg/mL、青霉素100U/mL的DMEM培養(yǎng)基中，胎牛血清濃度為10%，培養(yǎng)箱內(nèi)CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，溫度為37℃，細(xì)胞接種密度為5×105/mL。

1.2.2細(xì)胞分組共分4組：(1)陰性對(duì)照組：以正常培養(yǎng)液培養(yǎng)。(2)氧化損傷組：30mmol/L葡萄糖溶液作用12h。(3)EGCG組：加入EGCG作用24h之后，加入30mmol/L葡萄糖溶液作用12h，依EGCG濃度不同分為2個(gè)亞組(10μmol/L和100μmol/L)。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力細(xì)胞接種于96孔板(細(xì)胞密度5×104/L，每孔120μL)培養(yǎng)24h使細(xì)胞同步化，向各孔細(xì)胞中加入20μL MTT(5g/L)，培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)液，加入150μL DMSO溶液，微量振蕩器室溫下振蕩10min后用酶標(biāo)儀測(cè)定492nm的光密度值。HLEC的存活率=(各組細(xì)胞光密度值/正常組細(xì)胞光密度值)×100%。

1.2.4 Hoechst-PI染色觀察細(xì)胞凋亡細(xì)胞接種于96孔板中，經(jīng)相應(yīng)處理后用PBS洗滌細(xì)胞兩次，在150μL的Binding Buffer中加入2μL Hoechst及5μL PI混勻，避光、室溫反應(yīng)5min后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)相應(yīng)干預(yù)后取各組細(xì)胞，裂解后1200g離心15min取上清液，按試劑盒說明書，使用721D分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px及MDA含量。

2結(jié)果

2.1 EGCG對(duì)高糖致HLEC氧化損傷后細(xì)胞活性的影響氧化損傷組HLEC經(jīng)氧化損傷處理后，細(xì)胞活性明顯下降(32.67%±3.10%)，與陰性對(duì)照組(96.07%±3.32%)比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=19.08，P<0.01)。用10μmol/L和100μmol/L EGCG處理后，HLEC活性分別提高到50.33%±3.52%和63.33%±4.63%，兩組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.42，P>0.05)，與氧化損傷組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.35、5.98，P<0.05，圖1)。

2.2倒置顯微鏡觀察HLEC的形態(tài)學(xué)改變正常HLEC貼壁生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形，胞膜完整，細(xì)胞間界限清晰；氧化損傷組細(xì)胞體積縮小，呈球形改變，出現(xiàn)懸浮細(xì)胞(提示壞死細(xì)胞的出現(xiàn))。經(jīng)EGCG干預(yù)的高糖條件下HLEC保持了上皮細(xì)胞的形態(tài)，較少出現(xiàn)細(xì)胞腫脹，EGCG高濃度組細(xì)胞形態(tài)改善明顯(圖2)。

圖1MTT法檢測(cè)EGCG對(duì)高糖誘導(dǎo)的HLE細(xì)胞活力的影響bP<0.01vs氧化損傷組。

2.3 EGCG對(duì)HLEC凋亡的影響陰性對(duì)照組細(xì)胞核呈均勻致密的暗藍(lán)色低熒光，細(xì)胞凋亡率為3.00%±0.71%，氧化損傷組細(xì)胞凋亡率為35.75%±3.90%，與陰性對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.26，P<0.05)；圖3可見氧化損傷組細(xì)胞出現(xiàn)了亮藍(lán)色高熒光，說明部分細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生凋亡反應(yīng)，其中紅色點(diǎn)狀高熒光為PI染色陽性，代表壞死細(xì)胞。給予不同濃度EGCG干預(yù)后，凋亡及壞死細(xì)胞數(shù)逐漸減少，EGCG低濃度組和EGCG高濃度組細(xì)胞凋亡率分別為22.33%±2.32%和6.75%±1.05%，兩組之間比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.03，P<0.01)，與氧化損傷組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.47、 7.26，P<0.05，圖3、4)。

2.4 EGCG對(duì)HLEC內(nèi)MDA、SOD和GSH-PX含量變化的影響從表1中可知，氧化損傷組HLEC中SOD及GSH-Px含量與陰性對(duì)照組比較明顯下降，MDA含量明顯升高，兩者比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-59.48，P<0.01)，給予EGCG后，隨著作用劑量的升高，MDA含量有下降的趨勢(shì)，EGCG低、高濃度組與氧化損傷組比差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；同時(shí)EGCG促進(jìn)了SOD及GSH-Px含量的升高，EGCG高劑量組與氧化損傷組比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1562.63，P<0.01)。

3討論

抗氧化劑EGCG是一種活性氧、自由基的強(qiáng)力清除劑，具有抗突變、抗炎、抗衰老、抗癌、改善肝功能的作用[4-5]。EGCG的保護(hù)作用機(jī)制包括抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的氧化損傷、抑制能量代謝、細(xì)胞凋亡和壞死，保護(hù)細(xì)胞膜[6]。有報(bào)道顯示，EGCG的抗氧化活性是SOD的6倍，維生素E的20倍[7]。劉湘萍等[8]通過體外實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了EGCG能夠抑制地塞米松誘導(dǎo)的兔晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，但是對(duì)于糖尿病性白內(nèi)障的保護(hù)作用鮮有報(bào)道。

晶狀體的能量來自房水中葡萄糖。糖尿病患者晶狀體內(nèi)葡萄糖增多，經(jīng)醛糖還原酶的作用活化，葡萄糖轉(zhuǎn)化為山梨醇。山梨醇不能透過晶狀體囊膜，在晶狀體內(nèi)大量積聚，使晶狀體內(nèi)滲透壓增加，吸收水分，上皮細(xì)胞及纖維腫脹變性，導(dǎo)致混濁[9]。細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果也顯示高糖處理的細(xì)胞其活力明顯降低，細(xì)胞正常形態(tài)受到損傷，但是經(jīng)過EGCG預(yù)處理的細(xì)胞其活力得到不同程度的改善，細(xì)胞形態(tài)亦逐漸改善，并且說明該藥物在一定程度上能夠抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，而且這種藥物對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用呈劑量依賴性。

糖尿病引起的晶狀體混濁與長(zhǎng)時(shí)間的積累性氧化損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡有關(guān)，HLEC對(duì)氧化應(yīng)激較為敏感[10]。

圖2各組晶狀體上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變(×400)A：陰性對(duì)照組；B：氧化損傷組；C：EGCG低濃度組；D：EGCG高濃度組。

圖3Hoechst-PI染色觀察細(xì)胞凋亡(×400)A：陰性對(duì)照組；B：氧化損傷組；C：EGCG低濃度組；D：EGCG高濃度組。

表1EGCG對(duì)HLEC細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD及GSH-PX含量變化的影響

注：bP<0.01vs正常組；dP<0.01vs氧化損傷組。

圖4EGCG對(duì)高糖誘導(dǎo)HLEC凋亡的抑制作用aP<0.05，bP<0.01vs氧化損傷組；dP<0.01vsEGCG低濃度組。

我們利用30mmol/L葡萄糖建立細(xì)胞氧化損傷模型，觀察EGCG對(duì)該細(xì)胞的保護(hù)作用。生理狀態(tài)下，機(jī)體抗自由基損傷的酶如SOD、GSH-Px能有效地清除活性氧和自由基，使自由基的產(chǎn)生和清除處于平衡，因此清除活性氧和修復(fù)氧化損傷被認(rèn)為是預(yù)防和治療白內(nèi)障行之有效的方法[11]。本實(shí)驗(yàn)中，用EGCG干預(yù)后HLEC中SOD、GSH-Px活性較氧化損傷組顯著升高，MDA含量顯著降低，提示EGCG可能通過提高細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px含量，降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量發(fā)揮其較強(qiáng)的抗氧化作用。

綜上所述，EGCG對(duì)高糖誘導(dǎo)的HLEC凋亡具有一定的抑制作用，抑制效應(yīng)與藥物濃度正相關(guān)，從而可能減少HLEC凋亡及由此引起的病理損害，為尋求有效的防治糖尿病性白內(nèi)障藥物提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of epigallocatechin-3-gallate against oxidative stress induced by high glucose in human lens epithelium cells

Ting Chen, Ping Liu, Jia-Xiang Wang, Duo Shan, Wen Che, Li-Juan Zhang

Foundation item:National Natural Science Foundation of China (No.30973275)

The Third Ward of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China

Correspondence to:Li-Juan Zhang. The Third Ward of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University. zhanglijuan715@163.com

Received：2016-03-03Accepted：2016-05-18

Abstract

?AIM: To investigate the effect of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) against oxidative stress induced by high glucose in human lens epithelium (HLE) cells.

?METHODS: The HLE cell oxidative damage model induced by high concentration glucose was established, and was intervented with different concentrations of EGCG. Cell viability was determined by MTT assay, cell morphology was investigated by convert microscope, cells apoptosis was assayed by flow cytometry with Hoechst-PI staining. Moreover, the levels of super oxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and malondialdehyde (MDA) in supernatant were also tested after different treatment either with high concentration glucose or with different concentrations of EGCG.

?RESULTS: MTT results showed that HLE cells activity increased to 50.33%±3.52% and 63.33%±4.63% after treated with 10 μmol/L and 100 μmol/L EGCG respectively, the difference was statistically significant compared with oxidative injury group(32.67%±3.10%)(P<0.05); HLE cells maintained better morphology intervented with EGCG under high glucose conditions, the number of apoptotic cells reduced, SOD and GSH-Px level within HLE cells increased and MDA levels decreased.

?CONCLUSION: EGCG plays its strong antioxidant effect by increasing SOD, GSH-Px content and decreasing MDA content in cells, therefore provides a reliable experimental basis for the search for effective prevention and treatment of cataract drug.

KEYWORDS:?epigallocatechin-3-gallate; high glucose; human lens epithelium cells; oxidative stress

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.30973275)
作者單位：(150001)中國(guó)黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科三病房

作者簡(jiǎn)介：陳婷，護(hù)師，研究方向：白內(nèi)障。

通訊作者：張麗娟，副主任護(hù)師，研究方向：白內(nèi)障.zhanglijuan715@163.com

收稿日期：2016-03-03 修回日期： 2016-05-18

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.6.06