于秀敏，張燕娜，岳文冉，楊　杞，萬永青，李國婧，王瑞剛

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

轉(zhuǎn)CkLEA4基因擬南芥種子萌發(fā)期的抗逆性分析

于秀敏，張燕娜，岳文冉，楊杞，萬永青，李國婧，王瑞剛*

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

摘要：該研究在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，將受脫水、鹽脅迫和ABA誘導(dǎo)的檸條錦雞兒CkLEA4基因轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，并利用實(shí)時熒光定量PCR從8株純合體中篩選出3個表達(dá)量不同的株系，比較野生型和轉(zhuǎn)CkLEA4基因過表達(dá)擬南芥種子在不同脅迫處理下的萌發(fā)率，以探討CkLEA4基因在植物抵抗逆境脅迫中的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)在不同濃度NaCl、甘露醇及ABA處理下，轉(zhuǎn)CkLEA4基因過表達(dá)擬南芥種子的萌發(fā)率均高于野生型，隨著NaCl、甘露醇及ABA濃度增加，各株系萌發(fā)率均降低，但野生型的萌發(fā)率下降幅度均高于3個過表達(dá)株系，并且在200 mmol/L NaCl和400 mmol/L甘露醇處理下，過表達(dá)株系子葉綠化率均顯著高于野生型。(2)在低濃度ABA處理下，CkLEA4過表達(dá)植株子葉的綠化率也高于野生型。研究表明，檸條錦雞兒CkLEA4基因提高了擬南芥種子萌發(fā)階段對鹽、ABA及滲透脅迫的耐受性。

關(guān)鍵詞：檸條錦雞兒；胚胎晚期豐富蛋白基因；非生物脅迫；轉(zhuǎn)基因擬南芥

胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundant proteins，LEA蛋白)因在胚胎發(fā)育晚期大量積累而得名，廣泛存在于高等植物的種子中，在種子成熟脫水過程中起到保護(hù)組織細(xì)胞免受脫水傷害的作用，由Dure等[1]最早在胚胎發(fā)育后期的棉花子葉中發(fā)現(xiàn)。LEA蛋白是一類低分子量蛋白，分子量大多在10～30kD之間，富含甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等親水性氨基酸，疏水性氨基酸含量較少，具有高度親水性和熱穩(wěn)定性[2]。LEA蛋白并非植物所特有，在昆蟲[3]、線蟲[4]、細(xì)菌[5-6]等體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了LEA蛋白的存在。

研究表明，LEA蛋白的表達(dá)無組織特異性，除了在種子中大量表達(dá)，在根、莖、葉、花等器官中也有表達(dá)，并且植物在受到干早、高鹽、低溫等脅迫以及植物激素脫落酸(ABA)誘導(dǎo)時，也會大量積累[2,7]。研究發(fā)現(xiàn)，在植物抵抗非生物脅迫過程中，LEA具有維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性、清除活性氧自由基、結(jié)合金屬離子、保護(hù)細(xì)胞內(nèi)酶等生物大分子的活性、防止蛋白聚集、穩(wěn)定和保護(hù)蛋白質(zhì)等功能[8-9]。

檸條錦雞兒(Caraganakorshinskii)屬于豆科錦雞兒屬植物，具有極強(qiáng)的生態(tài)抗逆性和廣適性，對生態(tài)環(huán)境的維持起到重要的作用，同時檸條錦雞兒的枝葉繁茂，營養(yǎng)豐富，適口性強(qiáng)，具有較高的飼用價值，是中國西北荒漠和半荒漠地區(qū)重要的栽培和飼用樹種[10-11]，也是研究林木抗逆機(jī)制的理想材料之一。

本實(shí)驗(yàn)室前期從檸條錦雞兒干旱脅迫下抑制性削減雜交文庫(SSH)中篩選得到CkLEA4基因序列[12]，通過熒光定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)CkLEA4受脫水、鹽脅迫和ABA處理的誘導(dǎo)[13]，推測其與檸條錦雞兒逆境脅迫響應(yīng)機(jī)制有關(guān)。本研究在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了CkLEA4基因過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，分析了CkLEA4基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同脅迫處理下的萌發(fā)狀況，以期了解CkLEA4基因在植物抵抗逆境脅迫中的功能，為進(jìn)一步深入研究檸條錦雞兒LEA基因的功能及利用其進(jìn)行植物抗逆育種奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1植物材料

檸條錦雞兒(CaraganakorshinskiiKom.)種子采自內(nèi)蒙古赤峰市，野生型擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)Columbia-0生態(tài)型(Col-0)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2植物表達(dá)載體構(gòu)建

設(shè)計特異引物CkLEA4-F1(5′-GCgtcgacATGCAGGGAGCAAAGAAAGC-3′，下劃線為SalⅠ酶切位點(diǎn))和CkLEA4-R1(5′-GCgagctcCTTAACTGTAAGTACCGCCAGTCC-3′，下劃線為SacⅠ酶切位點(diǎn))，以1月苗齡檸條錦雞兒莖和葉片cDNA為模板擴(kuò)增CkLEA4基因編碼區(qū)。利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生物公司)回收目的片段，插入克隆載體pEASY-Blunt-Simple(北京全式金生物公司)，測序驗(yàn)證后提質(zhì)粒，經(jīng)內(nèi)切酶SalⅠ和SacⅠ(Thermo公司)酶切后，插入到由CaMV35S啟動子驅(qū)動的植物表達(dá)載體pCanG-HA中，酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，挑取陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定。PCR引物合成及產(chǎn)物測序由上海生工生物公司完成。

1.3擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及純合體篩選

采用浸花法將重組表達(dá)載體pCanG-CkLEA4轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，用25 mg/L卡那霉素篩選陽性植株。提取轉(zhuǎn)基因植株總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過實(shí)時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因株系中的基因表達(dá)量。按照SYBRPremixExTaq試劑盒(Takara生物公司)說明書操作，利用LightCycler 480實(shí)時熒光定量PCR儀(Roche公司)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:SYBRPremixExTaq10 μL，稀釋的cDNA模板5 μL，上、下游引物各0.4 μL(10 μmol/L)，滅菌水4.2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。所用引物為CkLEA4-F2(5′-ACCCTGCTGAGGCATTTGGA-3′)和CkLEA4-R2(5′-CCTATTGGGACGAATAGAGGCAC-3′)，內(nèi)參引物為AtEF1α-F(5′-AGAAGGGTGCCAAATGATGAG-3′)和AtEF1α-R(5′-GGAGGGAGAGAGA- AAGTCACAGA-3′)?；虮磉_(dá)量以2-ΔCT計算，選取3株表達(dá)水平較高的株系進(jìn)行后續(xù)表型實(shí)驗(yàn)。

1.4不同脅迫處理萌發(fā)率分析

本實(shí)驗(yàn)室前期通過熒光定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)CkLEA4受脫水、鹽脅迫和ABA處理的誘導(dǎo)[13]，推測其與檸條錦雞兒逆境脅迫響應(yīng)機(jī)制有關(guān)，在此基礎(chǔ)上，檢測了CkLEA4基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在NaCl、甘露醇(mannitol)和ABA處理下的萌發(fā)狀況。野生型和過表達(dá)擬南芥種子經(jīng)75%乙醇滅菌10 min后，用含有0.05% Tween-20的100%乙醇滅菌10 min，待種子晾干后分別種在含有不同濃度NaCl(0、100、150和200 mmol/L)、ABA(0、1、2和3 μmol/L)和mannitol(0、200、300和400 mmol/L)的1/2 MS培養(yǎng)基上，每個株系各55顆種子，4℃同步化處理3 d，將平板取出置于22℃，16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)。以胚根突破種皮為萌發(fā)標(biāo)志，統(tǒng)計每天的種子萌發(fā)率，以子葉展開并呈現(xiàn)綠色為標(biāo)志，統(tǒng)計子葉綠化率，檢測擬南芥中過表達(dá)CkLEA4對脅迫處理下種子萌發(fā)和幼苗生長的影響。

2結(jié)果與分析

2.1pCanG-CkLEA4植物表達(dá)載體的構(gòu)建

用特異引物CkLEA4-F1和CkLEA4-R1擴(kuò)增獲得長度為510 bpCkLEA4編碼區(qū)(圖1，A)，連接到克隆載體pEASY-Blunt-Simple中測序，測序驗(yàn)證后用SalⅠ和SacⅠ酶切并連接到線性化的表達(dá)載體pCanG-HA中。構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pCanG-CkLEA4用SalⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定，能夠切出目的片段，說明表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖1，B)。

2.2轉(zhuǎn)基因純合體植株鑒定

通過浸花法將重組植物表達(dá)載體pCanG-CkLEA4轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，卡那霉素篩選得到T3代陽性植株8株，通過熒光定量PCR對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行純合體鑒定，并檢測了目的基因CkLEA4在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量(圖2)，選取表達(dá)量較高的3個株系OE-12、OE-15和OE-19進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽脅迫耐受性檢測

為檢測野生型擬南芥和CkLEA4過表達(dá)株系在種子萌發(fā)階段對鹽脅迫的耐受性，將野生型和3個過表達(dá)株系OE-12、OE-15和OE-19，種在含有不同濃度NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基中，4 ℃同步化處理3 d后，每天同一時間統(tǒng)計種子萌發(fā)率。結(jié)果(圖3，A)顯示，在1/2 MS培養(yǎng)基中，過表達(dá)株系和野生型的萌發(fā)率相近，沒有明顯區(qū)別；而在含有不同濃度NaCl的培養(yǎng)基中，3個過表達(dá)株系的萌發(fā)率均高于野生型；隨著NaCl濃度增加，各株系萌發(fā)均受到抑制，但野生型萌發(fā)率下降幅度要高于過表達(dá)株系。以第4天時種子萌發(fā)率為標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)NaCl濃度從100 mmol/L增加到200 mmol/L時，野生型萌發(fā)率下降了63.6%，而3個過表達(dá)株系平均萌發(fā)率只下降了26.1%。統(tǒng)計200 mmol/L NaCl處理下萌發(fā)第5天時子葉綠化率，3個過表達(dá)株系子葉綠化率顯著高于野生型(圖3，B)。以上結(jié)果說明CkLEA4過表達(dá)后提高了擬南芥種子萌發(fā)階段對鹽脅迫的耐受能力。

2.4轉(zhuǎn)基因擬南芥滲透脅迫耐受性檢測

A.CkLEA4；B.pCanG-CkLEA4；M.DL5000；

圖2　過表達(dá)CkLEA4株系表達(dá)水平的實(shí)時熒光定量PCR檢測

將野生型和過表達(dá)株系種在含有不同濃度mannitol的1/2 MS培養(yǎng)基中，統(tǒng)計種子萌發(fā)率。在0和200 mmol/L mannitol處理下，過表達(dá)株系和野生型萌發(fā)率相近；而當(dāng)mannitol濃度增加至300和400 mmol/L時，過表達(dá)株系萌發(fā)率均明顯高于野生型(圖4，A)。隨著mannitol濃度增加，各株系萌發(fā)率均下降，但野生型萌發(fā)率下降幅度要高于過表達(dá)株系。以第3天時種子萌發(fā)率為標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)mannitol濃度從200 mmol/L增加到400 mmol/L時，野生型萌發(fā)率下降了66.1%，而3個過表達(dá)株系平均萌發(fā)率只下降了23.2%。并且400 mmol/L mannitol處理下萌發(fā)第5天時，過表達(dá)株系子葉綠化率也顯著高于野生型(圖4，B)。說明CkLEA4過表達(dá)后增強(qiáng)了擬南芥種子萌發(fā)階段對滲透脅迫的耐受性。

A.不同濃度NaCl處理下野生型和過表達(dá)株系的萌發(fā)率統(tǒng)計；B.200 mmol/L NaCl處理下各株系子葉綠化率統(tǒng)計；**表示P < 0.01

2.5轉(zhuǎn)基因擬南芥ABA敏感性檢測

脫落酸(Abscisic acid，ABA)是一種重要的植物激素，參與種子休眠與萌發(fā)、植株生長、葉片脫落及氣孔運(yùn)動等多個植物生長發(fā)育過程，同時ABA在植物抵抗非生物脅迫過程中也發(fā)揮著重要的作用[14-15]。前期研究中發(fā)現(xiàn)，CkLEA4受ABA誘導(dǎo)[13]。為研究CkLEA4過表達(dá)后是否影響了擬南芥對ABA的敏感性，本研究檢測了含有不同濃度ABA的1/2MS培養(yǎng)基上過表達(dá)株系的萌發(fā)情況。在不含ABA的1/2MS培養(yǎng)基中，過表達(dá)株系的萌發(fā)率與野生型相近；在1、2和3 μmol/L ABA處理下，過表達(dá)株系萌發(fā)率高于野生型(圖5，A)。同時，低濃度ABA處理后各株系的子葉綠化率檢測結(jié)果顯示，在0.2和0.3 μmol/L ABA處理下，過表達(dá)株系的子葉綠化率均高于野生型(圖5，B)。以上結(jié)果表明，CkLEA4過表達(dá)后降低了擬南芥對ABA的敏感性。

3討論

干旱、鹽堿、高溫和寒冷等環(huán)境脅迫嚴(yán)重影響著植物的生長發(fā)育，從而極大地降低作物的產(chǎn)量。在長期的進(jìn)化過程中，植物形成了一系列的代謝響應(yīng)及防御機(jī)制來適應(yīng)或應(yīng)對這些非生物脅迫。LEA蛋白就是在逆境脅迫下誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有保護(hù)細(xì)胞免受傷害、維持植物體基本生命活動的一類重要蛋白。

在實(shí)驗(yàn)室前期研究中，張燕娜等[13]根據(jù)Blast結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化分析將CkLEA4基因歸為第4組LEA基因家族成員。大量研究表明，LEA4家族基因在植物抵抗非生物脅迫中起著重要的作用。Olvera-Carrillo等[16]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)擬南芥AtLEA4-1、AtLEA4-2和AtLEA4-5能夠增強(qiáng)植物對干旱脅迫的抵抗力；Liu等[17]將旋蒴苣苔(Boeahygrometrica)的2個LEA4基因BhLEA1和BhLEA2在煙草中過表達(dá)后，提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性，減少了葉片失水率和電解質(zhì)滲漏率，并且增加了SOD和POD的酶活性。大豆的2個LEA4蛋白GmPM1和GmPM9能夠結(jié)合Fe3+、Ni2+、Cu2+和Zn2+等，減輕金屬離子對植物的傷害[18]。Dalal等[19]分別利用35S和rd29S啟動子將油菜(Brassicanapus)的LEA4-1基因插入到擬南芥基因組中，結(jié)果顯示以這2種方式轉(zhuǎn)入的擬南芥對鹽和干旱脅迫均有很強(qiáng)的耐受性。

A.不同濃度mannitol處理下野生型和過表達(dá)株系的萌發(fā)率統(tǒng)計；B.400 mmol/L mannitol處理下子葉綠化率統(tǒng)計；*和**分別表示P<0.05和P<0.01

CkLEA4能夠受到脫水、鹽和ABA的誘導(dǎo)，因此推測其可能與植物抗逆功能相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，CkLEA4過表達(dá)擬南芥在NaCl、mannitol處理下的萌發(fā)率均高于野生型，說明CkLEA4增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥在萌發(fā)階段對鹽和滲透脅迫的耐受性。這一結(jié)論與過表達(dá)AtLEA3-3基因擬南芥在NaCl和mannitol處理下的種子萌發(fā)率結(jié)果一致[20]。玉米Rab28基因過表達(dá)后在15% PEG處理下的種子萌發(fā)率也高于野生型[21]。

A.不同濃度ABA處理下野生型和過表達(dá)株系的萌發(fā)率統(tǒng)計；B.0.2和0.3 μmol/L ABA處理下子葉綠化率統(tǒng)計

ABA在植物生長發(fā)育以及抵抗逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用，其主要功能之一是抑制種子萌發(fā)[14]。本研究中，在不同濃度的ABA處理下，CkLEA4過表達(dá)擬南芥萌發(fā)率均高于野生型，在0.2和0.3μmol/L ABA處理下，子葉綠化率也高于野生型，說明CkLEA4降低了擬南芥對ABA的敏感性，從而提高了萌發(fā)率。而與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，Zhao等[20]將擬南芥AtLEA3-3過表達(dá)后，在ABA處理下，過表達(dá)擬南芥與野生型相比萌發(fā)率無明顯區(qū)別，但子葉綠化率明顯高于野生型。我們推測可能的原因是，LEA蛋白基因是一類大的基因家族，擬南芥中有51個成員[7]，大豆中至少有36個[22]，不同的家族成員在植物抵抗非生物脅迫中可能具不同的功能，CkLEA4屬于第4組LEA基因，AtLEA3-3屬于第3組LEA基因，且CkLEA4與AtLEA3-3氨基酸序列相似度僅為16.2%，二者在ABA處理下種子萌發(fā)過程中可能起著不同的作用，其具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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(編輯:宋亞珍)

Stress Tolerance of TransgenicArabidopsisExpressingCkLEA4 Gene during Seed Germination Stage

YU Xiumin,ZHANG Yanna,YUE Wenran,YANG Qi,WAN Yongqing,LI Guojing,WANG Ruigang*

(College of Life Sciences,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018，China)

Abstract:Based on our previous study,CkLEA4,a Caragana korshinskii LEA gene induced by dehydration,salt and ABA treatments,was transferred into Arabidopsis. The transgene expression of eight T3 transgenic plants was detected by quantitative real-time PCR and three independent overexpression lines with different transgene expression level were selected for further analysis.For the germination assays,CkLEA4 overexpression lines germinated more quickly than that of wild-type on medium containing different concentrations of NaCl,mannitol or ABA.The germination rate of wild-type and CkLEA4 overexpression lines were all decreased with the increased concentrations of NaCl,mannitol or ABA,while the germination rate of wild-type decreased more dramatically than that of the overexpression lines.The cotyledon greening rates of CkLEA4 overexpression lines were also higher than those of wild-type under 200 mmol/L NaCl,400 mmol/L mannitol or low concentrations of ABA.Altogether,our results suggested that CkLEA4 improved Arabidopsis tolerance to salt,ABA and osmotic stress during seed germination stage.

Key words:Caragana korshinskii;late embryogenesis abundant (LEA) proteins;abiotic stress;transgenic Arabidopsis

文章編號:1000-4025(2016)04-0648-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.04.0648

收稿日期：2016-01-05；修改稿收到日期：2016-03-09

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31560199)；內(nèi)蒙古自治區(qū)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才團(tuán)隊(2015-2016)；內(nèi)蒙古自治區(qū)草原英才工程(2014-2016)

作者簡介：于秀敏(1989-)，女，在讀博士研究生，主要從事植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail:yuxiumin565@126.com *通信作者：王瑞剛，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail:wangruigang@ imau.edu.cn

中圖分類號：Q785;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A