柯丹霞，張　偉，李祥永，楊明影，于小瑞，朱涵雪，王曉菲

百脈根Rac1蛋白多克隆抗體的制備與應(yīng)用

柯丹霞，張偉，李祥永，楊明影，于小瑞，朱涵雪，王曉菲

(信陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用研究院，河南信陽(yáng) 464000)

摘要:Rop基因在豆科植物與根瘤菌共生互作過(guò)程中發(fā)揮重要作用。該研究以模式豆科植物百脈根根系cDNA為模板，擴(kuò)增得到百脈根的1個(gè)Rop基因(Rac1)，將其連接到原核表達(dá)載體pET28a，轉(zhuǎn)化獲得Rac1基因的大腸桿菌BL21(DE3)工程菌。優(yōu)化Rac1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件，親和吸附法純化蛋白，制備Rac1多克隆抗體，并應(yīng)用該抗體檢測(cè)Rac1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中Rac1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：(1)經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建pET28a-Rac1原核表達(dá)載體。(2)Rac1蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：IPTG濃度0.1 mmol/L、溫度20 ℃、時(shí)間6 h，重組蛋白以可溶形式高效表達(dá)；純化的Rac1蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，目的條帶大小為25 kD左右，且條帶清晰、單一無(wú)雜帶。(3)Western blotting顯示，制備的多克隆抗體能特異識(shí)別其對(duì)應(yīng)的抗原，且效價(jià)較高。(4)通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛根轉(zhuǎn)化法獲得Rac1過(guò)表達(dá)植株的陽(yáng)性毛根，提取陽(yáng)性毛根總蛋白，Western blotting分析顯示過(guò)表達(dá)植株中Rac1蛋白表達(dá)量顯著高于空載體對(duì)照，從翻譯水平證實(shí)過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建的有效性。該研究制備的Rac1多克隆抗體能夠高效特異地檢測(cè)來(lái)源于百脈根體內(nèi)的Rac1蛋白，這將為進(jìn)一步開(kāi)展Rac1在共生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的生物學(xué)功能研究提供有利工具。

關(guān)鍵詞:百脈根；Rac1；原核表達(dá)；多克隆抗體

Rop蛋白通過(guò)與各種調(diào)控因子的相互作用參與植物體內(nèi)多種生命活動(dòng)，包括調(diào)控細(xì)胞的極性生長(zhǎng)、發(fā)育與形態(tài)建成、內(nèi)膜運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程[1-5]。Rop還參與植物的生物與非生物脅迫以及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑[6-9]。Rop與上下游效應(yīng)蛋白之間的調(diào)節(jié)機(jī)制在植物中保守存在[10]。質(zhì)膜上的鳥(niǎo)苷酸交換因子(GEF)首先激活Rop小GTPase，處于活化態(tài)的Rop可以與下游特定的靶蛋白相結(jié)合，激活Rop依賴的信號(hào)途徑，進(jìn)而執(zhí)行不同的生理功能。最后，激活的Rop在鳥(niǎo)苷酸活化蛋白(GAP)和鳥(niǎo)苷酸抑制解離因子(GDI)的作用下，恢復(fù)非活化狀態(tài)，Rop蛋白又可以開(kāi)始新一周期的循環(huán)過(guò)程。

Rop蛋白的蹤跡首先從豌豆花粉管尖端質(zhì)膜中被發(fā)現(xiàn)，并且豌豆花粉管的伸長(zhǎng)受到Rop1抗體的抑制，表明Rop蛋白參與調(diào)控花粉管伸長(zhǎng)[11]。抗體雜交結(jié)果顯示擬南芥Rop4位于伸長(zhǎng)的根毛尖端[2]。GAP只在花粉管側(cè)翼加速Rop蛋白的 GTP水解，使Rop處于失活狀態(tài)，而GDI將非活化的Rop由側(cè)翼重新運(yùn)回到頂點(diǎn)，失活的Rop再次被GEF激活，研究人員從蛋白水平證實(shí)Rop及其上下游活性調(diào)節(jié)子通過(guò)復(fù)雜的調(diào)節(jié)方式共同維持細(xì)胞的極性生長(zhǎng)[12-14]。

近年來(lái)大量的證據(jù)表明，Rop基因在豆科植物與根瘤菌共生互作過(guò)程中發(fā)揮重要作用。苜蓿(Medicago)是另一種重要的模式豆科植物。在紫花苜蓿(Medicagosativa)接種根瘤菌的根系中檢測(cè)到Rop類基因的表達(dá)，這是Rop基因參與共生互作過(guò)程的第一個(gè)證據(jù)[15]。蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中的3個(gè)Rop基因，MtRop3、MtRop5和MtRac1受根瘤菌誘導(dǎo)表達(dá)量明顯增加[16]。大豆(Glycinemax)Rop類基因RabA2特異表達(dá)于接種根瘤菌的根毛中，接種后的基因沉默植株根毛變形、侵染線起始和根瘤形成都被完全抑制[17]。以上結(jié)果從轉(zhuǎn)錄水平對(duì)豆科植物中Rop基因的功能進(jìn)行了研究。Lei等[18]從翻譯水平證實(shí)蒺藜苜蓿MtRop10蛋白的定位及其在根毛頂端的活性受到根瘤菌結(jié)瘤因子的調(diào)控，這二者之間的相互作用是蒺藜苜蓿根毛變形和卷曲所必須的。

模式豆科植物百脈根(Lotusjaponicus)中也分離得到2個(gè)Rop基因，LjRop6和LjRac1基因受根瘤菌誘導(dǎo)，接種根瘤菌后基因表達(dá)量明顯升高，LjRop6的RNAi植株接種后根瘤菌的早期侵染被抑制，結(jié)瘤數(shù)目也相應(yīng)減少[19]。最新研究發(fā)現(xiàn)，LjRac1過(guò)表達(dá)植株能夠促進(jìn)百脈根結(jié)瘤[20]。因此，百脈根中的Rop基因在共生結(jié)瘤過(guò)程中也發(fā)揮著重要功能。目前，關(guān)于百脈根中Rop的研究主要集中于轉(zhuǎn)錄水平，而關(guān)于翻譯后Rop蛋白質(zhì)的研究報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體，分離純化Rac1重組蛋白，制備Rac1多克隆抗體，利用該抗體對(duì)Rac1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株陽(yáng)性毛根總蛋白中Rac1蛋白的含量進(jìn)行檢測(cè)，為從翻譯水平分析Rac1在百脈根與根瘤菌共生結(jié)瘤過(guò)程中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

百脈根MG-20種子、百脈根中生根瘤菌MAFF303099由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室根瘤菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。原核表達(dá)載體pET28a、大腸桿菌菌株DH5a和BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2方法

1.2.1百脈根總RNA提取及cDNA合成百脈根MG-20根部組織總RNA提取參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》所述方法進(jìn)行[21]，以提取所得總RNA為模板，按照Takara公司試劑盒操作說(shuō)明合成cDNA，得到的cDNA第一鏈，置-20 ℃保存，備用。

1.2.2原核表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的Rac1基因序列(GenBank登錄號(hào)Z73961.1)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)構(gòu)建Rac1原核表達(dá)載體的上游引物(5’-ACGCGTCGATGAGTGCTTCCA-3’)和下游引物(5’-GGAATTCACTCACAATATTGAG-3’)，下劃線分別為Sal1和EcoR1酶切位點(diǎn)。以合成的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為2.5 μL 10×PCR Buffer，4 μL 2.5 mmol/L dNTP，1 μL上游特異性引物(10 μmol/L)，1 μL下游特異性引物(10 μmol/L)，1 μL cDNA第一鏈模板，0.25 μL ExTaqDNA聚合酶，用ddH2O補(bǔ)足體積到25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖電泳檢測(cè)后，切膠回收PCR目的片段, 再經(jīng)雙酶切后，酶切產(chǎn)物連接到表達(dá)載體pET28a上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a，酶切和測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆。

1.2.3目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析將構(gòu)建好的pET28a-Rac1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21(DE3)中；挑取單菌落于Kana(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)；過(guò)夜培養(yǎng)物以1%的接種量轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)基中，以37 ℃、250 r/min培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.5～0.6時(shí)，分別加入IPTG至終濃度為0.1、0.25和0.5 mmol/L，置于20、28 和37 ℃搖床中培養(yǎng)，2、4 和6 h分別取樣5 mL；收集1.5 mL菌體，加入上樣緩沖液重懸菌體，沸水浴5～10 min；將制備好的全蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，未重組載體pET28a作為對(duì)照，所有條件保持一致。

融合蛋白成功誘導(dǎo)表達(dá)后，收集剩余菌體，每管加入600 μL PBS緩沖液，加ddH2O定容至1 L。緩沖液(pH 7.4)組成為140 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4和1.8 mmol/L KH2PO4。離心管置于冰水混合物中，超聲波破碎細(xì)胞4～6次，每次10 s，間隔1 min，靜置10 min；4 ℃、12 000 r/min 高速離心15 min，上清和沉淀等比例取樣，分別加入上樣緩沖液，沸水浴5 ～10 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.4融合蛋白的純化收集誘導(dǎo)菌體，PBS洗滌1次后，再用PBS重懸，置于冰浴中超聲波破碎至液體透明； 12 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清；加入經(jīng)1×PBS平衡的Ni柱，混合均勻；萬(wàn)向搖床上冰浴振蕩2 h；4 ℃離心后棄上清，用1×PBS洗滌Ni柱2～3次，洗脫雜蛋白；用含20～80 mmol/L咪唑的PBS洗脫液再次洗脫Ni柱上的雜蛋白；用含100～500 mmol/L咪唑的PBS洗脫目的蛋白，置萬(wàn)向搖床冰浴振蕩10 min；4 ℃離心后收集上清；重復(fù)洗脫2次，將3次收集的上清經(jīng)透析液(20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl)透析后，再通過(guò)蔗糖濃縮，樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，純化的融合蛋白樣品分裝后置-70 ℃貯存，備用。

1.2.5重組蛋白抗體的制備及檢測(cè)配制SDS-PAGE膠時(shí)，積層膠上方不插梳子，預(yù)留1 cm寬的空間點(diǎn)樣。制備好的蛋白樣品電泳、染色、脫色后，切下目標(biāo)蛋白凝膠條帶，用蒸餾水徹底清洗。在研缽中加入適量生理鹽水，充分研磨凝膠至無(wú)顆粒狀物質(zhì)，將制備好的抗原與弗氏完全佐劑等體積混合，制備成 “油包水”乳狀液。首次注射前，取未免疫新西蘭大白兔耳靜脈血3～5 mL，制成血清作為空白對(duì)照。第1次注射抗原1 mg，經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射免疫。初次免疫后2周，將抗原與弗氏不完全佐劑等體積充分混勻，進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫，抗原劑量增加到1.5 mg。之后每隔2周加強(qiáng)免疫1次，方法劑量同二免。3次加強(qiáng)免疫后，耳靜脈采血并分離血清，Western blotting檢測(cè)多克隆抗體效價(jià)。電泳后的蛋白膠先轉(zhuǎn)膜，4 ℃封閉過(guò)夜后， Rac1多克隆抗體作為一抗(1∶1000)室溫孵育2 h，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗(1∶2 000，碧云天)室溫孵育1 h；最后使用化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒BeyoECL Plus(碧云天)進(jìn)行顯色，并利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Protein Simple)記錄結(jié)果。

當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到要求時(shí)，兔心臟穿刺采血，收集血清，分裝于-70 ℃貯存?zhèn)溆?。若抗體效價(jià)不理想，可繼續(xù)加強(qiáng)免疫1次。

1.2.6轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性毛根Rac1蛋白的檢測(cè)利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛根轉(zhuǎn)化法獲得百脈根Rac1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性毛根，具體方法參照參考文獻(xiàn)[22]，將鑒定的陽(yáng)性毛根剪下3～5 cm，平鋪于含300 mg/mL羧卞霉素的MS固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行陽(yáng)性毛根的擴(kuò)繁培養(yǎng)，1周繼代1次，繼代3～5次，用于Rac1蛋白的檢測(cè)分析。

在10 mL蛋白抽提緩沖液中加入1片蛋白酶抑制劑藥片(Roche)，于冰上放置，待藥片溶解后充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。緩沖液(pH 8.0)組成為50 mmol/L Tris-MES、0.5 mol/L sucrose、1 mmol/L MgCl2、10 mmol/L EDTA和5 mmol/L DTT。收集擴(kuò)繁的Rac1過(guò)表達(dá)和空載體轉(zhuǎn)化植株陽(yáng)性毛根各0.1 g，于盛有液氮的研缽中研磨成粉狀，迅速轉(zhuǎn)移粉末至離心管中，粉末與抽提緩沖液等體積混合，于斡旋器上渦旋混勻，再于冰上放置10 min；4 ℃、12 000 r/min離心20 min收集上清，加入上樣緩沖液，沸水浴保溫5～10 min，樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳及Western blotting檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1重組表達(dá)載體的構(gòu)建

用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增百脈根Rac1基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為594 bp，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明，本研究擴(kuò)增獲得的百脈根Rac1基因全長(zhǎng)594 bp，編碼197個(gè)氨基酸，利用在線軟件預(yù)測(cè)該蛋白分子量為20 kD左右。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Sal1和EcoR1雙酶切，連入表達(dá)載體pET28a上。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切獲得大小約5.3 kb的載體片段和594 bp左右的插入片段(圖2)。由于重組蛋白含有組氨酸標(biāo)簽，利用在線軟件預(yù)測(cè)重組蛋白分子量為25 kD左右，較Rac1蛋白分子量大。進(jìn)一步的測(cè)序結(jié)果也證實(shí)Rac1基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

M. DL2000；1. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1　Rac1目的片段的PCR擴(kuò)增M. DL2000; 1. Product of PCR amplificationFig. 1　PCR amplification of Rac1 gene

M. 1kb DNA ladder；1. 重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物圖2　重組質(zhì)粒pET28a-Rac1酶切鑒定M. 1kb DNA ladder; 1. Product of recombinant plasmid digested with Sal1 and EcoR1Fig. 2　Identification of the recombinant pET28a-Rac1 plasmid digested with Sal1 and EcoR1

2.2重組蛋白的表達(dá)與純化

重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL21(DE3)中，誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE分析，在25kD左右有明顯的表達(dá)條帶，其大小與預(yù)測(cè)的重組蛋白分子量大小相符(圖3)，說(shuō)明重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。為了獲得最大可溶性目的蛋白產(chǎn)量，獲得pET28a-Rac1表達(dá)菌株最佳誘導(dǎo)條件，誘導(dǎo)溫度20 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間6 h，IPTG濃度0.1 mmol/L，SDS-PAGE電泳分析目的蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中以上清形式大量存在(圖3)。

目的蛋白含6×His純化標(biāo)簽，可以經(jīng)金屬螯合親和層析吸附于Ni-NTA樹(shù)脂層析柱，沖洗除去非特異吸附的雜蛋白后，將目的蛋白洗脫，透析濃縮。每一步驟分別取樣，SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果顯示透析濃縮后的目的蛋白在25 kD左右，條帶清晰且單一無(wú)雜帶，表明重組蛋白被高效純化(圖4)。

1～5. 誘導(dǎo)表達(dá)重組菌體蛋白；6. 誘導(dǎo)表達(dá)空載體菌體蛋白；M. 蛋白marker；7. 誘導(dǎo)菌株超聲波破碎后的上清；8. 誘導(dǎo)菌株超聲波破碎后的沉淀 圖3　Rac1重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析1-5.Induced cells containing pET28a-Rac1; 6.Induced cells containing pET28a; M.Protein marker; 7.Soluble protein from induced cells containing pET28a-Rac1; 8.Insoluble protein from induced cells containing pET28a-Rac1Fig. 3　SDS-PAGE analysis of the expression of Rac1 recombinant protein

1～3. 純化的目的重組蛋白；M. 蛋白marker；4. 透析濃縮后的目的蛋白圖4　Rac1純化蛋白的SDS-PAGE分析1-3.Purified Rac1 protein; M.Protein marker; 4.Target protein after dialyzed and concentratedFig. 4　SDS-PAGE analysis of purified Rac1 recombinant protein

2.3多克隆抗體的制備與檢測(cè)

將目的蛋白條帶切下，液氮研磨后加入佐劑免疫新西蘭大白兔，制備Rac1多克隆抗體。利用Western blotting檢測(cè)制備抗體的效價(jià)與特異性，結(jié)果顯示原核表達(dá)的融合蛋白與多克隆抗體雜交顯示單一條帶，與免疫前抗血清雜交沒(méi)有條帶出現(xiàn)，一抗均為1∶1 000稀釋，說(shuō)明制備的Rac1多克隆抗體達(dá)到理想效價(jià)，可以開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。未重組表達(dá)載體的菌體蛋白作為陰性對(duì)照，與多克隆抗體以及免疫前抗血清都沒(méi)有雜交出任何條帶，說(shuō)明該抗體具有較高的特異性(圖5)。

2.4轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性毛根Rac1蛋白的檢測(cè)

為了從蛋白水平檢測(cè)過(guò)表達(dá)植株中Rac1蛋白的表達(dá)量，本實(shí)驗(yàn)提取陽(yáng)性毛根總蛋白，利用制備的Rac1多克隆抗體進(jìn)行Western blotting雜交分析。由圖6可以看出，陽(yáng)性毛根過(guò)表達(dá)提取蛋白雜交條帶在20kD左右，與預(yù)測(cè)蛋白分子量大小一致，而陰性對(duì)照(未重組表達(dá)載體pET28a的菌體蛋白)沒(méi)有目的條帶出現(xiàn)；陽(yáng)性毛根中過(guò)表達(dá)植株毛根與空載體p1302G植株相比，Rac1蛋白的表達(dá)量明顯升高，由此說(shuō)明，目的基因已完整整合到百脈根根部基因組中，且Rac1蛋白也得到過(guò)量表達(dá)。

1. 未重組表達(dá)載體的菌體蛋白；2. 誘導(dǎo)后的目的蛋白圖5　Rac1多克隆抗體的Western blotting分析1. Induced cells containing pET28a; 2. Total protein from induced cells containing pET28a-Rac1Fig. 5　Western blotting analysis of Rac1 polyclonal antibody

1. 未重組表達(dá)載體的菌體蛋白；2. 對(duì)照植株陽(yáng)性毛根中的Rac1蛋白；3～8. 過(guò)表達(dá)植株陽(yáng)性毛根中的Rac1蛋白圖6　轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性毛根Rac1蛋白的Western blotting分析1. Induced cells containing pET28a; 2. Rac1 protein in transgenic positive hairy root of control plant;3-8. Rac1 protein in transgenic positive hairy root of over-expression plantFig. 6　Western blotting analysis of Rac1 protein in transgenic positive hairy root

3討論

近年來(lái)，研究人員已經(jīng)從多種豆科植物中分離并鑒定出Rop家族基因，并證實(shí)Rop基因參與豆科植物與根瘤菌共生結(jié)瘤信號(hào)傳遞途徑。目前，關(guān)于豆科植物中Rop基因功能的研究主要集中于轉(zhuǎn)錄水平，關(guān)于翻譯后Rop蛋白質(zhì)的相關(guān)研究報(bào)道較少。在前期工作中，筆者通過(guò)薄板層析和放射自顯影技術(shù)檢測(cè)了百脈根Rop6蛋白的GTP酶活，證實(shí)野生型的Rop6能夠水解GTP，自身具有微弱的GTP酶活，且Rop6的相互作用蛋白NFR5(結(jié)瘤因子受體蛋白) 并不影響其GTP酶活性[22]。隨后，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選到百脈根Rop6的相互作用蛋白Clathrin heavy chain(網(wǎng)格重鏈蛋白)，證實(shí)二者形成復(fù)合物參與根瘤菌的侵染過(guò)程[23]。而在水稻中也證實(shí)Rop同系物OsRac1能夠和MAPK6、Hsp90和RACK1等多個(gè)蛋白形成復(fù)合物，從而將天然免疫信號(hào)傳遞到下游[24]。因此在豆科植物中開(kāi)展這些方面的研究包括鑒定Rop蛋白的生化功能，明確Rop蛋白的生物學(xué)功能，尋找與之相互作用的新蛋白，建立并完善參與結(jié)瘤信號(hào)傳遞的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等是非常有意義的[25]。

百脈根中的另一個(gè)Rop家族基因Rac1被證實(shí)受根瘤菌誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)，基因過(guò)表達(dá)顯著增加植株結(jié)瘤數(shù)目[20]。該研究從轉(zhuǎn)錄水平初步證實(shí)Rac1基因可能正調(diào)控共生互作過(guò)程，但到目前為止關(guān)于其蛋白質(zhì)相關(guān)的研究還未有報(bào)道。本研究鑒于原核表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、基因操作容易、從構(gòu)建到產(chǎn)物純化周期短等優(yōu)點(diǎn)，構(gòu)建了Rac1原核重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，實(shí)現(xiàn)了該基因的原核表達(dá)。某些情況下，大腸桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì)不能有效正確折疊，部分蛋白會(huì)形成不溶性的包涵體。本研究通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)條件，獲得重組蛋白的最佳誘導(dǎo)條件，在誘導(dǎo)溫度20℃、誘導(dǎo)時(shí)間6 h、IPTG濃度0.1 mmol/L條件下，目的蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中以上清形式大量存在，由此獲得了大量可溶性蛋白。本研究使用鎳柱結(jié)合親和吸附His標(biāo)簽純化目的蛋白，適宜濃度咪唑洗脫，透析濃縮最終獲得高純度Rac1融合蛋白，為深入研究百脈根Rac1的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、催化特性等生化功能奠定了基礎(chǔ)。

揭示百脈根Rac1的生物學(xué)功能，從翻譯水平入手更具現(xiàn)實(shí)意義，免疫學(xué)技術(shù)是研究蛋白質(zhì)表達(dá)水平的有效方法，因此本研究以高純度目的蛋白作為抗原，免疫兔后獲得Rac1多克隆抗體，Western blotting顯示獲得的抗體特異性好，背景低。利用Rac1多克隆抗體檢測(cè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性毛根中Rac1的蛋白表達(dá)水平，從翻譯水平證實(shí)過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建的有效性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段證實(shí)Rac1蛋白的過(guò)量表達(dá)能夠增加轉(zhuǎn)基因植株的結(jié)瘤數(shù)目。因此，本研究中Rac1多克隆抗體的制備不僅將為今后開(kāi)展Rac1蛋白在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和不同組織內(nèi)的蛋白表達(dá)譜以及蛋白定位等方向的研究奠定基礎(chǔ)，也將為進(jìn)一步明確Rac1在豆科植物與根瘤菌共生結(jié)瘤信號(hào)傳遞途徑中的生物學(xué)功能提供有利的工具。

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(編輯:宋亞珍)

Polyclonal Antibody Preparation and Application ofLotusjaponicusRac1 Protein

KE Danxia, ZHANG Wei, LI Xiangyong, YANG Mingying, YU Xiaorui,ZHU Hanxue, WANG Xiaofei

(College of Life Sciences & Institute for Conservation and Utilization of Agro-bioresources in Dabie Mountains, Xinyang Normal University, Xinyang, Henan 464000, China)

Abstract:Rop gene plays an important role in the process of symbiotic interaction between legume and rhizobium. A Rop gene Rac1 was amplified from the root cDNA of model legume Lotus japonicus and ligated to the prokaryotic expression vector pET28a. The engineering bacterium carrying Rac1 gene in E. coli BL21 (DE3) was obtained. The expression conditions of Rac1 protein was optimized, and the protein was purified by affinity chromatography. Rac1 protein expression levels of overexpression plant were detected by using the prepared anti-Rac1 polyclonal antibody. The results showed: (1) the prokaryotic expression vector of pET28a-Rac1 was constructed successfully by double enzyme digestion and DNA sequencing. (2) The optimal expression condition was induction temperature at 20 ℃, time at 6 h, and IPTG concentration at 0.1 mmol/L. The recombinant protein was high-efficiency expressed in the form of soluble protein. The purified Rac1 protein was obtained by affinity chromatography and detected by SDS-PAGE. The band size was about 25 kD, and the bands were clear and single. (3) Western blotting analysis showed that the polyclonal antibody could specifically react with the corresponding antigen, and the titer was high. (4) Agrobacterium mediated transformation of hairy roots method was used to obtain the positive hairy roots of Rac1 overexpression plant. The total protein of positive hairy roots was extracted and detected by Western blotting. The results showed that the expression of Rac1 protein in the Rac1 overexpression plant was significantly higher than that in the empty vector control, which proved the construction of overexpression vector was effective from translation level. The results showed that the preparation of Rac1 polyclonal antibody could specificity detect the native Rac1 protein in Lotus japonicus, which will provide a powerful tool for the further study of the biological function of Rac1 in the symbiosis signal transduction pathway.

Key words:Lotus japonicas; Rac1; prokaryotic expression; polyclonal antibody

文章編號(hào):1000-4025(2016)04-0655-06

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.04.0655

收稿日期:2015-10-12;修改稿收到日期:2016-03-15

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(31400213)；信陽(yáng)師范學(xué)院青年科研基金(2014-QN-059)；信陽(yáng)師范學(xué)院青年骨干教師資助計(jì)劃(2015)；信陽(yáng)師范學(xué)院“南湖學(xué)者獎(jiǎng)勵(lì)計(jì)劃”青年項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介:柯丹霞(1983-)，女，博士，講師，主要從事豆科植物與根瘤菌共生固氮分子生物學(xué)研究。E-mail: kdx_029@163.com

中圖分類號(hào):Q781;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A