王　帥,邵芬娟,李　論,蘆　強,邱德有*

穗花杉中不存在紫杉醇的化學及分子生物學證據(jù)

王帥1,邵芬娟1,李論2,蘆強1,邱德有1*

(1. 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，北京100091；2. 廣西桂林小廬山生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，廣西桂林541205)

摘要:穗花杉(Amentotaxus argotaenia (Hance) Pilger)是紅豆杉科穗花杉屬的一個種。由于穗花杉與紅豆杉屬植物具有較近的親緣關(guān)系，有研究者認為穗花杉也可以合成紫杉醇，并利用HPLC法測到其含有紫杉醇。但這僅僅是依靠HPLC中出峰時間來判斷，并沒有質(zhì)譜結(jié)果。該研究利用LC-MS對穗花杉莖葉的化學提取物分析結(jié)果顯示，穗花杉的莖葉中均未發(fā)現(xiàn)紫杉醇。為了進一步證明穗花杉不能合成紫杉醇，該研究利用歐洲紅豆杉(Taxus baccata L.)紫杉醇生物合成關(guān)鍵基因-紫杉二烯合成酶基因(Taxadiene synthase gene, TbTS)的序列TBLASTN比對穗花杉本地轉(zhuǎn)錄組，從中找出并克隆得到與TbTS同源性最高的AarTSL1基因；利用原核表達分析AarTSL1基因的編碼蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因不具有紫杉二烯合成酶編碼基因的功能。該研究從化學和生物學兩個方面均證明穗花杉無法合成紫杉醇，為以后通過植物學和化學分類學等研究穗花杉的分類學地位提供了新的有用信息。

關(guān)鍵詞:穗花杉；紫杉醇；紫杉二烯合成酶；LC-MS；原核表達

紫杉醇是一種重要的具有抗癌活性的萜類化合物。紫杉醇最早是在紫杉樹皮提取物中發(fā)現(xiàn)的[1]。1994年，羅士德等利用高效液相色譜法分析發(fā)現(xiàn)除紅豆杉屬植物具有紫杉醇及其同系物之外，同時發(fā)現(xiàn)香榧莖葉中有微量的紫杉醇，大理羅漢松莖葉有巴卡亭Ⅲ[2]。1996年，周榮漢等[3]在白豆杉中發(fā)現(xiàn)了紫杉醇及短葉醇。根據(jù)植物化學系統(tǒng)學概念，在紅豆杉科中的穗花杉屬植物中也可能具有紫杉醇。2014年，牟利輝等[4]利用紫外掃描和HPLC相結(jié)合的方法測定了穗花杉中紫杉醇的含量。

穗花杉(Amentotaxusargotaenia(Hance) Pilger)，屬于穗花杉屬，而穗花杉屬是紅豆杉科中的一個屬，也是六大古老孑遺家系之一[5,6]。穗花杉是常綠小喬木或灌木，有“冰川元老”的美稱，主要分布于中國南方地區(qū)，以福建、江西、廣東等省為主，也是中國三級重點保護的珍稀瀕危植物。紅豆杉科的分類學問題一直存有爭議，何關(guān)福等[7]從化學分類學角度，對紅豆杉科各屬有關(guān)植物成分進行了研究。穗花杉中是否含有紫杉醇，對其分類學地位也有一定的參考意義。

紫杉二烯合酶(Taxadiene synthease, TS)是紫杉醇合成代謝過程中最重要的一個酶，它存在于紅豆杉細胞內(nèi)的質(zhì)體中[8]，催化GGPP環(huán)化形成紫杉二烯，是紫杉醇生物合成途徑中的一個限速酶[9]。只要穗花杉中存在紫杉二烯合酶(TS)基因，那么就為證明穗花杉可以合成紫杉醇提供了重要的證據(jù)。

盡管牟利輝在穗花杉中檢測到有微量的紫杉醇存在，但是他只是根據(jù)HPLC觀察到在與紫杉醇標準品相同(近)時間處有峰出現(xiàn)，就確定這個化合物就是紫杉醇，并沒有利用質(zhì)譜技術(shù)進行進一步分析。僅僅根據(jù)HPLC結(jié)果不足以證明穗花杉中是否有紫杉醇。在化學方面，本研究利用LC-MS技術(shù)對穗花杉枝葉化學抽提物進行分析。在基因方面，我們利用體外表達技術(shù)對穗花杉中紫杉醇合成的關(guān)鍵限速酶紫杉二烯合成酶(TS)基因的同源基因進行功能驗證。通過這兩個方面的研究對穗花杉是否能合成紫杉醇提供證據(jù)，同時也對穗花杉的分類地位研究提供有用的信息。

1材料與方法

1.1實驗材料

穗花杉材料由桂林小廬山生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供，5年生盆栽實生苗培養(yǎng)在中國林業(yè)科學研究院溫室中，于8月底取當年生帶葉的枝條，采集后立即放入液氮中，之后存于-80 ℃冰箱中待用。用于LC-MS分析的10年生穗花杉的莖葉也是由桂林小廬山生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司在其本地收集并提供，將其烘干，磨成粉，干燥保存待用。

1.2紫杉醇的抽提

紫杉醇提取方法是根據(jù)Bala的方法修改后的[10]。稱取2 g用于LC-MS分析的穗花杉的莖葉粉末，用30 mL甲醇抽提，超聲30 min后過夜抽提。過濾抽提甲醇，沉淀繼續(xù)用30 mL甲醇超聲30 min抽提，收取甲醇抽提液。將2次抽提的甲醇溶液旋蒸濃縮。旋蒸濃縮得到的膏狀物用10%的甲醇水溶液溶解。用10 mL正己烷萃取2次，去掉正己烷層。水層再用10 mL氯仿萃取抽提2次，收集氯仿層。氯仿層旋蒸濃縮，得到膏狀物。用2 mL甲醇溶解膏狀物，過Oasis HLB柱子，得到的甲醇溶液濃縮定容到1 mL，待LC-MS分析。

1.3GC-MS和LC-MS分析

用Thermo Finnigantrace DSQ 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀完成GC-MS分析。檢測所用的色譜柱為DP-5MS (30 m × 250 μm ID × 0.25 μm)，驗證所用的色譜柱為HP-5MS (30 m × 250 μm ID × 0.25 μm)。進樣條件相同如下：進樣方式為不分流，每次進樣 1μL。載氣為氦氣，流速為 1 mL/min。進樣口溫度為250 ℃。分離程序為：80 ℃，2 min；10 ℃/min 的速度升溫到 210 ℃；以 3 ℃/min 的速度升溫至 240 ℃；240 ℃保持 3 min。離子源溫度為 230 ℃，質(zhì)譜四級桿檢測器溫度為150 ℃。掃描模式為全掃描，溶劑延遲設(shè)定為 3 min。

用Thermo Scientific LTQ FTLC-MS完成LC-MS分析。檢測用的色譜柱是SunFire TM(4.6 mm ID × 150 mm,顆粒大小5 μm, C18)，柱溫是40 ℃，流動相是5%的乙腈水溶液以1 mL/min的流速流動。在50 min時，流動相由5%的乙腈水溶液變?yōu)?00%的乙腈，并持續(xù)到55 min。然后在10 s內(nèi)，流動相又變?yōu)?%的乙腈水溶液，并且持續(xù)到75 min。注入的樣品體積是10 μL，紫外檢測器的檢測波長是21 nm。質(zhì)譜參數(shù)為默認參數(shù)。

所有LC-MS和GC-MS的數(shù)據(jù)都是利用儀器配套的Xcalibur 2.0軟件進行采集和分析。

1.4穗花杉TSL基因的預(yù)測、克隆及原核表達載體構(gòu)建

利用歐洲紅豆杉(TaxusbaccataL.)紫杉醇生物合成關(guān)鍵酶-紫杉二烯合成酶基因 (Taxadiene synthase gene,TbTS)的氨基酸序列對本地穗花杉轉(zhuǎn)錄組(未發(fā)表)進行TBLASTN分析,預(yù)測到的unigene是C40284，將其命名為AarTSL1基因[11]。據(jù)此設(shè)計RACE引物：AarTSL1-5’-NEST: CAGGCACCCTTGCAACCCAGGCA和AarTSL1-5’:CGAACCGTCGCCCAACTGGTTTTGT。利用RACE技術(shù)獲得該基因全長cDNA。原核表達載體pET30a(+)的酶切位點選用Nde Ⅰ和Xho Ⅰ兩個酶切位點，根據(jù)中美泰和公司的Seamless Assemble Cloning Kit的說明書設(shè)計出引物的重組臂(引物中下劃線部分)。利用AarTSL1-F： TTTAAGAAGGAGATATACATATGGCCAGCGCTGCTCGGCT和AarTSL1-R：CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTACACTGCAACAGGCTCGAAAAGGCA將AarTSL1基因的ORF克隆出來，并通過同源重組將AarTSL1基因重組到pET30a(+)載體中，構(gòu)建pET30a/AarTSL1原核表達載體。

1.5AarTSL1的原核表達及酶活實驗

大腸桿菌中雖然有MEP途徑，但是IPP和DMPP的合成很少，Morrone等[12]將MEP途徑中的兩個限速酶基因DXS和DXR，以及IDI基因剪切信號肽后，重組到pCDFDuet載體中，得到的pIRS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌能夠增加IPP和DMPP的產(chǎn)量。他們同時將GGPP合成酶基因重組到pACYCDuet質(zhì)粒中得到pGG重組質(zhì)粒，可以用來在大腸桿菌中合成GGPP。其中，pGG、pIRS質(zhì)粒是由四川農(nóng)業(yè)大學王強老師提供。

將質(zhì)粒pGG、pIRS[13]和重組質(zhì)粒pET30a/AarTSL1三個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化原核表達菌株大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，獲得陽性菌株。挑取陽性克隆菌落，接種到3 mL含氯霉素、壯觀霉素和卡納霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。取500 μL活化的菌液加入到裝有50 mL TB培養(yǎng)基的玻璃三角瓶中，在37 ℃、200 r/min培養(yǎng)約3 h到OD550約0.6～0.8。加入550 μL 50%的無菌甘油和5 mL的10×磷酸緩沖液，在18 ℃、200 r/min培養(yǎng)1 h使菌液冷卻。加IPTG至終濃度為0.2 mol/L，將三角瓶轉(zhuǎn)移到18 ℃培養(yǎng)箱中設(shè)置轉(zhuǎn)速為200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)72 h。50 mL培養(yǎng)液用等體積的正己烷抽提8 h，超聲10 min后，4 ℃下過夜。將正己烷層分離出來，并濃縮定容到1 mL待GC-MS檢測。GC-MS檢測方法同上。

2結(jié)果與分析

2.1穗花杉中莖葉提取物的LC-MS分析

為了驗證穗花杉是否能夠合成紫杉醇，我們利用LC-MS技術(shù)分析穗花杉莖葉的化學提取物。LC-MS結(jié)果表明紫杉醇標準品出峰時間是32.54 min，而穗花杉莖葉提取物在32.54 min處沒有明顯的峰,而在32.80 min處有一個小峰(圖1)。通過對32.80 min處峰的質(zhì)譜圖分析發(fā)現(xiàn)該峰所對應(yīng)的化合物并不是紫杉醇(圖2)。

圖1　穗花杉抽提物的TIC分析Fig. 1　The TIC diagram of the extraction of A. argotaenia

A. 紫杉醇標準品; B. 樣品32.80min峰圖2　紫杉醇標準品峰及樣品對應(yīng)峰質(zhì)譜的分析A. The taxol standard at 32.54 min; B. The peak at 32.80 min of the sampleFig. 2　Mass spectra analysis about the peak of the taxol standard and corresponding peak of sample

M. Marker; A. 特異引物AarTSL1-5’-NEST;B. 特異引物AarTSL1-5’圖3　AarTSL1基因的5’RACEM. Marker; A. The special primer AarTSL1-5’-NEST;B. The special primer AarTSL1-5’Fig. 3　The 5’ RACE of AarTSL1 gene

2.2穗花杉中TSL基因的預(yù)測及克隆

利用歐洲紅豆杉TbTS基因完整的氨基酸序列對本地穗花杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行TBLASTN分析，預(yù)測到13個unigene。其中,C40284的e-value值最小，Score值最高，所以我們選擇它為驗證基因。經(jīng)過對C40284的結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)其具有與TbTS基因相同的結(jié)構(gòu)域，故將其命名為AarTSL1基因。穗花杉轉(zhuǎn)錄組組裝得到的C40284沒有完整的開放閱讀框(ORF)，在5’端缺少約300bp。我們利用5’-RACE技術(shù)及巢式PCR克隆得到C40284的5’端片段分別約為460 bp和730 bp(圖3)。載體構(gòu)建擴增的AarTSL1基因的ORF為2 565 bp(圖4)。

M. Marker;圖4　AarTSL1基因的克隆 M. Marker;Fig. 4　The clone of AarTSL1 gene

2.3穗花杉中TSL基因的功能驗證

將pGG、pIRS和pET30a/AarTSL1三個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)菌株，并進行發(fā)酵，使用正己烷萃取發(fā)酵產(chǎn)物，使用GC-MS進行產(chǎn)物檢測分析。以pGG、pIRS和pET30a為陰性對照；以pGG、pIRS和pET30a/TchTS為陽性對照。陽性對照的離子流圖中紫杉二烯的出峰時間為18.77 min。然而，樣品的離子流圖中18.77 min處則沒有出峰(圖5)。這說明，AarTSL1蛋白并不具有紫杉二烯合成酶的功能。

A. 南方紅豆杉紫杉二烯合成酶基因TchTS(陽性對照)；B. 穗花杉AarTSL1(樣品)；C. pET30a(+)載體(陰性對照)圖5　AarTSL1原核表達產(chǎn)物的TIC分析A. TchTS of Taxus chinensis (positive control); B. AarTSL1 of A. argotaenia (sample); C. pET30a(+) vector (negative control).Fig. 5　TIC diagram of the prokaryotic expression of AarTSL1

3討論

穗花杉是紅豆杉科穗花杉屬的一個種。因為它從被發(fā)現(xiàn)以來在分類學地位上存在較大爭論，所以穗花杉具有很高的學術(shù)研究價值。中國植物學者在過去70多年里先后從植物形態(tài)學、胚胎學、解剖學、孢粉學、植物化學等方面對穗花杉的系統(tǒng)分類地位進行了廣泛的研究[14]。其中，1985年馬忠武發(fā)現(xiàn)紅豆杉科中的紅豆杉屬和榧樹屬都含有雙黃酮類成分，而穗花杉屬未檢測到此類成分[15]。因此，他對穗花杉屬是否歸于紅豆杉科提出懷疑。牟利輝2014年在穗花杉中發(fā)現(xiàn)紫杉醇。如果這個研究結(jié)果是正確的，將對穗花杉屬的分類地位提供很有力的證據(jù)。但是他只根據(jù)HPLC出峰時間來判斷是否含有紫杉醇，這樣不足以證明這個結(jié)論。本研究利用HPLC對穗花杉的莖葉化學提取物進行分析，發(fā)現(xiàn)在紫杉醇的標準品出峰時間32.54 min處并沒有明顯的峰出現(xiàn)，而在32.80 min處有一個小峰。通過對32.80 min處峰的質(zhì)譜圖的分析發(fā)現(xiàn)其并不是紫杉醇。因此，從化學分析方面來說，穗花杉并不能合成紫杉醇。

為了進一步證明穗花杉無法合成紫杉醇，我們從基因表達和酶的層面對其進一步分析。紫杉二烯合成酶是紫杉醇生物合成途徑中最重要的一個限速酶。我們利用歐洲紅豆杉中的紫杉二烯合成酶的氨基酸序列BLAST本地穗花杉轉(zhuǎn)錄組，得到同源性最高的AarTSL1基因，通過原核表達驗證其功能，發(fā)現(xiàn)所表達的酶并不具備合成紫杉二烯的功能，這進一步從分子水平說明了穗花杉并不能合成紫杉醇。本研究的結(jié)果也為今后穗花杉分類地位的深入研究提供了一些有用的信息。

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(編輯:潘新社)

Chemical and Molecular Biological Evidence Reveals That There Is No Taxol inAmentotaxusargotaenia(Hance) Pilger

WANG Shuai1, SHAO Fenjuan1, LI Lun2, LU Qiang1, QIU Deyou1*

(1. The Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091 China；2. Guangxi Guilin Xiaolushan Ecological Agriculture Co.Lit, Guilin, Guangxi 541205, China;)

Abstract:Amentotaxus argotaenia (Hance) Pilger is one member of Amentotaxus in Taxaceae. Due to the close genetic relationship between A. argotaenia and Taxus sp., some researchers thought that taxol could be synthesized in A. argotaenia and testified this hypothesis using HPLC method. This conclusion was just reached based on the retention time of the peak in the extract of A. argotaenia corresponding to that of the taxol standard, but not from any mass spectra data. In this study, we analyzed the extraction of the stems and leaves of A. argotaenia with LC-MS, and found that there was no taxol in the extraction. In order to prove our hypothesis, AarTSL1 gene was isolated and cloned by using the taxadiene synthase of Taxus baccata to TBLASTN the transcriptome of A. argotaenia. Functional analysis of AarTSL1 with prokaryotic expression showed that the AarTSL1 protein cannot catalyze GGPP (geranylgeranyl pyrophosphate) to taxadiene, key intermedia in taxol biosynthesis pathway. Taking together, our chemical and molecular biology evidence proved that A. argotaenia cannot product taxol. Our results will be helpful to the research work on the taxonomic study of A. argotaenia.

Key words:Amentotaxus argotaenia; taxol; taxadiene synthase; LC-MS; prokaryotic expression

文章編號:1000-4025(2016)04-0661-06

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.04.0661

收稿日期:2016-03-07;修改稿收到日期:2016-04-14

基金項目:中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項(RIF2014-01)

作者簡介:王帥(1988-),男,在讀博士研究生,主要從事次生代謝途徑相關(guān)基因研究。E-mail: hotboyshuai@126.com *通信作者:邱德有,男,博士生導師,研究員,主要從事次生代謝研究。E-mail：qiudy@caf.ac.cn

中圖分類號:Q785;Q789

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