唐　明， 汪　超， 譚韻雅， 李　群

( 四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 成都 610101 )

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不同種類無(wú)機(jī)鹽對(duì)灰氈毛忍冬“渝蕾1號(hào)”懸浮培養(yǎng)體系中細(xì)胞生長(zhǎng)和綠原酸含量的影響

唐明， 汪超， 譚韻雅， 李群*

( 四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 成都 610101 )

摘要：為提高灰氈毛忍冬“渝蕾1號(hào)”懸浮培養(yǎng)體系中綠原酸的含量，該研究探討了B5培養(yǎng)基中不同濃度的無(wú)機(jī)鹽對(duì)灰氈毛忍冬“渝蕾1號(hào)”懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生物量及綠原酸含量的影響，通過(guò)在懸浮培養(yǎng)體系中添加不同濃度的無(wú)機(jī)鹽，采用重量法測(cè)定灰氈毛忍冬“渝蕾1號(hào)”懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生物量及采用高效液相色譜法測(cè)定綠原酸的含量。結(jié)果表明：當(dāng)硝態(tài)氮和銨態(tài)氮配比與B5培養(yǎng)基中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮配比一致時(shí)，即NO3-/NH4+摩爾比值為13∶1時(shí)，培養(yǎng)體系有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和綠原酸的積累。當(dāng)KNO3濃度為3.5 g·L-1時(shí)，細(xì)胞生物量達(dá)到最大，為19.26 g·L-1；當(dāng)KNO3在較低濃度(0.5 g·L-1和1.5 g·L-1)時(shí)，積累較多的綠原酸。NO3-的兩項(xiàng)研究結(jié)果均與對(duì)照濃度(2.5g·L-1)有一定的差異。另外，對(duì) (NH4)2SO4來(lái)說(shuō)，在高于對(duì)照濃度0.134 g·L-1，即濃度為0.268 g·L-1時(shí)，生物量和綠原酸含量都達(dá)到了最大。P、Ca、Mg三種礦質(zhì)元素的研究結(jié)果表明，當(dāng)NaH2PO4·2H2O濃度為0.10 g·L-1、CaCl2的濃度為0.20 g·L-1時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)和綠原酸的積累均可達(dá)到最大值；而對(duì)Mg2+來(lái)說(shuō)，低濃度促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，高濃度促進(jìn)綠原酸的積累。兼顧細(xì)胞生物量和綠原酸含量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)，需選擇適中的濃度。這些結(jié)果均與對(duì)照濃度有一定的差異。這說(shuō)明灰氈毛忍冬“渝蕾1號(hào)”懸浮細(xì)胞所需無(wú)機(jī)鹽的濃度與B5培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽的濃度有一定的差異，選擇適宜的濃度可促進(jìn)其懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物綠原酸的積累。該研究結(jié)果為綠原酸的工業(yè)化生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：灰氈毛忍冬“渝蕾1號(hào)”， 懸浮培養(yǎng)， 綠原酸， 高效液相色譜， 無(wú)機(jī)鹽

金銀花(FlosLonicerajaponicae) 為忍冬科植物忍冬的花蕾以及它們初開(kāi)的花(徐曉蘭等，2013)。金銀花為中醫(yī)臨床使用的傳統(tǒng)中藥材，藥用歷史悠久(倪付勇等，2015)?；覛置潭坝謇?號(hào)”(LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.‘Yulei 1’)是以灰氈毛忍冬為砧木嫁接而成，經(jīng)重慶市有關(guān)專家審定的重慶首個(gè)藥用植物新品種(黃昌銀，2009)。同時(shí)，該品種具有高產(chǎn)量、高品質(zhì)、整個(gè)花期不開(kāi)花等優(yōu)點(diǎn)(姜法強(qiáng)，2013)，同時(shí)，該品種的主要次生代謝產(chǎn)物綠原酸含量較高。因此，自從該品種被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，得到了重慶市政府的足夠重視。眾所周知，綠原酸具有清除自由基、抗菌(王世寬等，2010)等多種功能，且綠原酸在醫(yī)藥和食品方面也有著廣泛的應(yīng)用(Ilaiyaraja et al, 2015; 馬烽等，2010；王利等，2009)，加之我國(guó)目前對(duì)于綠原酸的開(kāi)發(fā)利用水平遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國(guó)家(鄧良等，2005)，因此綠原酸供需缺口會(huì)持續(xù)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。

工業(yè)化生產(chǎn)中，要獲得大量植物次生代謝產(chǎn)物，植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是繼微生物發(fā)展技術(shù)之后的重要發(fā)展領(lǐng)域(李冬杰等，2003)。本研究希望通過(guò)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法，優(yōu)化培養(yǎng)條件以獲得灰氈毛忍冬“渝蕾1號(hào)”的主要次生代謝產(chǎn)物綠原酸。在優(yōu)化培養(yǎng)條件過(guò)程中，大多研究均是報(bào)道優(yōu)化培養(yǎng)過(guò)程中的基礎(chǔ)條件如pH、接種量、糖的種類或濃度、培養(yǎng)中激素組合等(Nagella et al,2010；李蕤等，2011)，也有不少的文章研究培養(yǎng)基的成分對(duì)代謝產(chǎn)物的影響。對(duì)灰氈毛忍冬“渝蕾1號(hào)”來(lái)說(shuō)，基礎(chǔ)條件方面的優(yōu)化已經(jīng)研究過(guò)，本研究旨在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究培養(yǎng)基成分，探究培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽成分對(duì)灰氈毛忍冬“渝蕾1號(hào)”懸浮培養(yǎng)體系中細(xì)胞生長(zhǎng)和綠原酸積累的影響，為進(jìn)一步提高綠原酸的含量提供相關(guān)的理論依據(jù)。由于灰氈毛忍冬“渝蕾1號(hào)”為新品種，以上研究沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

1材料與方法

1.1 材料

采自原產(chǎn)地重慶秀山縣苗圃園，經(jīng)宜賓學(xué)院魏琴教授鑒定為灰氈毛忍冬“渝蕾1號(hào)” (LoniceramacranthoidesHand.-Mazz. ‘Yulei 1’)。

1.2方法

1.2.1 懸浮培養(yǎng)體系的建立取灰氈毛忍冬“渝蕾1號(hào)”的幼嫩葉片為外植體，先將外植體用自來(lái)水連續(xù)沖洗1 h后，移至超凈工作臺(tái)，然后將外植體用75%酒精浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗2次，再用0.1%升汞溶液浸泡4 min，無(wú)菌水清洗4次，最后放置超凈工作臺(tái)上備用。接下來(lái)將材料用自來(lái)水連續(xù)接種到添加有2.0 mg·L-16-BA和0.5 mg·L-1NAA，pH為5.8的B5培養(yǎng)基中，25 ℃條件下自然光照培養(yǎng)。1月左右，將誘導(dǎo)出的愈傷組織進(jìn)行多次繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)，直至愈傷組織比較松散。選取松散的愈傷組織作為懸浮培養(yǎng)的起始材料。經(jīng)過(guò)幾次懸浮培養(yǎng)后，建立了合適的懸浮培養(yǎng)體系。在培養(yǎng)體系中，準(zhǔn)確稱取2.00 g懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，接種于40 mL B5培養(yǎng)基中，最后轉(zhuǎn)移至(25±1)℃，16 h光周期，110 r·min-1搖床中震蕩培養(yǎng)。

1.2.2 B5培養(yǎng)基中主要礦質(zhì)元素對(duì)“渝蕾1號(hào)”懸浮培養(yǎng)體系中細(xì)胞生長(zhǎng)和綠原酸含量的影響首先考察不同NO3-/NH4+摩爾比值對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和綠原酸含量的影響。設(shè)計(jì)如下：保持總N量不變(27 mmol·L-1)，在去除無(wú)機(jī)氮源的B5+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA的懸浮培養(yǎng)體系中添加不同NO3-/NH4+摩爾比值(14∶0、13∶1、10∶4、5∶9、0∶14)，其中13∶1為B5培養(yǎng)基中的NO3-/NH4+摩爾比值，也為本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。在2.1建立的懸浮培養(yǎng)體系中培養(yǎng)25 d后，檢測(cè)其生物量和綠原酸的含量。其次，考察單一添加NO3-或NH4+氮源對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和綠原酸含量的影響。設(shè)計(jì)如下：分別各自在去除無(wú)機(jī)氮源的B5+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA的懸浮培養(yǎng)基中添加不同濃度的(NH4)2SO4(0.033 5 g·L-1，0.067 g·L-1，0.134 g·L-1，0.268 g·L-1和0.536 g·L-1)和KNO3(0.5 g·L-1，1.5 g·L-1，2.5 g·L-1，5.0 g·L-1和8.0 g·L-1)，其中0.134 g·L-1(NH4)2SO4與2.5 g·L-1KNO3為B5培養(yǎng)基中各自的濃度，為本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照，在2.1建立的懸浮培養(yǎng)體系中培養(yǎng)25 d后檢測(cè)其生物量和綠原酸的含量。

1.2.3 H2PO4-、Ca2+、Mg2+分別在去除H2PO4-、Ca2+、Mg2+的B5+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA的懸浮培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaH2PO4·2H2O(0.05 g·L-1，0.10 g·L-1，0.15 g·L-1，0.20 g·L-1和0.25 g·L-1)、CaCl2(0.05 g·L-1，0.10 g·L-1，0.15 g·L-1，0.20 g·L-1和0.25 g·L-1)和MgSO4·7H2O(0.05 g·L-1，0.15 g·L-1，0.25 g·L-1，0.35 g·L-1和0.50 g·L-1)，值得指出的是，本實(shí)驗(yàn)是以B5培養(yǎng)基中各自的濃度為對(duì)照(即0.15 g·L-1NaH2PO4·2H2O、0.15 g·L-1CaCl2以及0.25 g·L-1MgSO4·7H2O)，再分別在2.1建立的懸浮培養(yǎng)體系中培養(yǎng)25 d后檢測(cè)其生物量和綠原酸的含量。

1.3 生物量測(cè)定和綠原酸提取

25 d后將收獲的鮮重細(xì)胞于50 ℃烘箱中烘干至恒重，稱重并計(jì)算其生物量。將烘干的愈傷細(xì)胞粉碎過(guò)60目篩，精密稱取其中0.10 g于10 mL 60%的甲醇試管中并稱重，放入超聲波清洗儀中超聲萃取30 min，再用60%的甲醇補(bǔ)足其重量，取其上清液用于HPLC檢測(cè)綠原酸的含量。

1.4 HPLC檢測(cè)

HPLC檢測(cè)：Alltech C18色譜柱(4.6 mm × 150 mm)；流動(dòng)相甲醇∶醋酸水=22∶78(pH=2.6)；檢測(cè)波長(zhǎng)328 nm；柱溫35 ℃；流速1 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL。

1.5 數(shù)據(jù)分析

以上試驗(yàn)3次平行，2次重復(fù)，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差Duncan分析(P≤0.05)

2結(jié)果與分析

2.1 “渝蕾1號(hào)”愈傷組織和懸浮培養(yǎng)體系的建立

圖1:a為成功誘導(dǎo)的愈傷組織，從圖1:a可以看出，愈傷組織呈翠綠淡黃色，其長(zhǎng)勢(shì)旺盛，比較松散，適宜作為懸浮的材料。圖1:b為在添加有2.0 mg·L-16-BA和0.5 mg·L-1NAA的 B5培養(yǎng)基中建立的懸浮體系，從圖1：b可以看出細(xì)胞呈淡黃色，且生長(zhǎng)旺盛。

2.2 HPLC條件的建立

圖2表示HPLC檢測(cè)所獲得的色譜圖，圖2：a為樣品色譜圖；圖2：b為綠原酸標(biāo)品色譜圖。從圖2：b可看出，主峰保留時(shí)間為6.29 min，標(biāo)記為CA。通過(guò)比較，圖2：a和圖2：b主峰出峰時(shí)間是一致的，表明樣品中的主峰即為CA綠原酸。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出樣品中綠原酸的含量。Wu(2007)曾報(bào)道過(guò)用高效液相色譜對(duì)杜仲懸浮體系中綠原酸含量定性以及定量， 測(cè)得的保留時(shí)間為13.97 min，這與我們的結(jié)果不太一致，可能是植物材料、不同的流動(dòng)相和色譜柱長(zhǎng)度不一致有關(guān)。

圖 1　“渝雷1號(hào)”愈傷組織與懸浮培養(yǎng)體系　a. 誘導(dǎo)出的愈傷組織； b. 建立的懸浮培養(yǎng)體系。Fig. 1　Induced callus and cell suspension cultures of “Yulei 1”　a. Induced callus; b. Established cell suspension cultures.

圖 2　綠原酸HPLC分析　a. 樣品HPLC色譜分析圖； b. 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜分析圖。Fig. 2　 HPLC analysis of chlorogenic acid　a. Representative HPLC chromatogram of chlorogenic acid extracted from Lonicera macranthoides Hand.-Mazz. “Yulei1” cell suspension culture； b. Representative HPLC chromatogram of chlorogenic acid standard.

2.3 NO3-/NH4+對(duì)“渝蕾1號(hào)”懸浮培養(yǎng)體系中細(xì)胞的生長(zhǎng)和綠原酸含量的影響

從圖3可以看出，對(duì)生物量來(lái)說(shuō)，當(dāng)NO3-/NH4+低于13∶1時(shí)，細(xì)胞生物量呈現(xiàn)出逐漸遞增的趨勢(shì)，且各梯度之間差異性顯著；當(dāng)NO3-/NH4+為13∶1(對(duì)照)時(shí)，其細(xì)胞生物量達(dá)到最大值，為17.93 g·L-1；而當(dāng)NO3-/NH4+高于13∶1時(shí)，細(xì)胞生物量呈現(xiàn)出逐漸遞減的趨勢(shì)，差異性同樣顯著。這表明NO3-/NH4+的比值為13∶1時(shí)最適合懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)，這也正是B5培養(yǎng)基中NO3-/NH4+的比值。對(duì)于綠原酸含量來(lái)說(shuō)，總體看來(lái)，隨著NO3-/NH4+比值的增加，綠原酸含量逐漸增加。當(dāng)NO3-/NH4+達(dá)到14∶0時(shí)，綠原酸的含量達(dá)最大，為13.51 mg·g-1DW。當(dāng)比值超過(guò)10∶4以后，綠原酸含量增加較為明顯，保持了較高的綠原酸含量。綜合細(xì)胞生物量和綠原酸含量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)，得出NO3-/NH4+為13∶1時(shí)有利于積累，這和B5培養(yǎng)基中的含量是一致的。

圖 3　不同NO3- /NH4+比值對(duì)細(xì)胞生物量和綠原酸含量的影響　數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示，DW. 細(xì)胞生物量; CA. 綠原酸含量。下同。Fig. 3　Effects of different NO3-/ NH4+ ratios on cell biomass and chlorogenic acid production in cell suspension cultures　Data represents means ± SE, DW. Biomass accumulation; CA. Chlorogenic acid production. The same below.

2.4 NO3-對(duì)“渝蕾1號(hào)”懸浮體系中細(xì)胞生長(zhǎng)和綠原酸含量的影響

由圖4可知，當(dāng)KNO3濃度在1.5～5.0 g·L-1時(shí)，細(xì)胞生物量都維持了較高的生長(zhǎng)量，且差異不顯著。當(dāng)KNO3濃度在3.5 g·L-1時(shí)，細(xì)胞生物量達(dá)到最大值，為19.26 g·L-1。對(duì)于綠原酸的含量來(lái)說(shuō)，在KNO3較低濃度(0.5 g·L-1和1.5 g·L-1)時(shí)，維持了較高的綠原酸含量，且當(dāng)KNO3濃度在1.5 g·L-1時(shí)，綠原酸的含量達(dá)到最大值(18.48 mg·g-1DW)；當(dāng)KNO3濃度高于1.5 g·L-1時(shí)，綠原酸的含量呈現(xiàn)出隨著KNO3濃度的增加而減少的趨勢(shì)，但各梯度之間差異性不顯著。可以得出，稍高于對(duì)照組濃度(2.5 g·L-1)的NO3-濃度有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，稍低于對(duì)照組濃度的NO3-濃度有利于綠原酸的合成。

圖 4　不同濃度的KNO3對(duì)細(xì)胞生物量和綠原酸含量的影響Fig. 4　Effects of different concentrations of KNO3 on cell biomass and chlorogenic acid production in cell suspension cultures

2.5 單一無(wú)機(jī)氮源 NH4+對(duì)“渝蕾1號(hào)”懸浮體系中細(xì)胞生長(zhǎng)和綠原酸含量的影響

由圖5可知，隨著 (NH4)2SO4濃度的增加，生物量逐漸增加，當(dāng)其濃度達(dá)到0.268 g·L-1時(shí)，細(xì)胞生物量達(dá)最大值(10.18 g·L-1)，濃度進(jìn)一步增加時(shí)，生物量略有減少，但各濃度梯度間差異不大。對(duì)于綠原酸的含量來(lái)說(shuō)，當(dāng)(NH4)2SO4濃度低于0.134 g·L-1(對(duì)照)時(shí)，綠原酸含量呈現(xiàn)出逐級(jí)遞減的趨勢(shì)，各濃度間差異顯著；但當(dāng)(NH4)2SO4濃度高于0.134 g·L-1(對(duì)照)時(shí)，綠原酸含量呈現(xiàn)出逐級(jí)遞增的趨勢(shì)，各濃度間差異亦顯著。當(dāng)(NH4)2SO4濃度在0.268 g·L-1時(shí)，綠原酸含量達(dá)到最大值，為9.17 mg·g-1DW。

圖 5　不同濃度的 (NH4)2SO4對(duì)細(xì)胞生物量和綠原酸含量的影響Fig. 5　Effects of different concentrations of (NH4)2SO4 on cell biomass and chlorogenic acid production in cell suspension cultures

圖 6　不同濃度的NaH2PO4·2H2O對(duì)細(xì)胞生物量和綠原酸含量的影響Fig. 6　Effects of different concentrations of NaH2PO4·2H2O on cell biomass accumulation and chlorogenic acid production in cell suspension cultures

2.6 H2PO4-對(duì)“渝蕾1號(hào)”懸浮體系中細(xì)胞生長(zhǎng)和綠原酸含量的影響

由圖6可知，當(dāng)NaH2PO4·2H2O濃度小于0.10 g·L-1時(shí)，細(xì)胞生物量隨NaH2PO4·2H2O濃度的增加而增加，且各濃度間差異顯著。當(dāng)NaH2PO4·2H2O濃度為0.10 g·L-1時(shí)，細(xì)胞生物量達(dá)到最大值，為8.90 g·L-1。當(dāng)NaH2PO4·2H2O濃度大于0.10 g·L-1時(shí)，細(xì)胞生物量隨NaH2PO4·2H2O濃度的增加而減少，各濃度間差異不大。對(duì)于綠原酸的含量來(lái)說(shuō)，當(dāng)NaH2PO4·2H2O濃度小于0.10 g·L-1時(shí)，綠原酸含量同樣隨NaH2PO4·2H2O濃度的增加而增加，各濃度間差異顯著；當(dāng)NaH2PO4·2H2O濃度為0.10 g·L-1時(shí)，綠原酸含量達(dá)最大值，為15.16 mg·g-1DW；當(dāng)NaH2PO4·2H2O濃度為0.15 g·L-1(對(duì)照)時(shí)，綠原酸的含量也較大，并和0.10 g·L-1之間沒(méi)有顯著差異?？梢缘贸?，當(dāng)NaH2PO4·2H2O濃度為0.10 g·L-1時(shí)，生物量和綠原酸的積累均可達(dá)到最大值，是最適的濃度。

2.7 Ca2+對(duì)“渝蕾1號(hào)”懸浮體系中細(xì)胞生長(zhǎng)和綠原酸含量的影響

由圖7可知，對(duì)于生物量來(lái)說(shuō)，當(dāng)濃度低于0.10 g·L-1時(shí)，細(xì)胞生物量隨CaCl2濃度的增加而增加，且差異顯著；當(dāng)CaCl2濃度為0.10 g·L-1時(shí)，細(xì)胞生物量達(dá)到最大值(8.08 g·L-1)；當(dāng)濃度高于0.10 g·L-1時(shí)，細(xì)胞生物量隨CaCl2濃度的增加而減少，除CaCl2濃度在0.10～0.25 g·L-1之間差異不顯著外，其他各濃度間差異均顯著。對(duì)于綠原酸的含量，當(dāng)CaCl2濃度為0.05、0.10 和0.25 g·L-1時(shí)，綠原酸含量差異不大。當(dāng)CaCl2濃度為0.20 g·L-1時(shí)，綠原酸含量達(dá)到最大值(11.46 mg·g-1DW)，與其它各濃度均保持顯著差異。因此，CaCl2濃度并非在對(duì)照濃度即0.15 g·L-1時(shí)生物量和綠原酸含量最高，而是稍有偏離。

圖 7　不同濃度的CaCl2對(duì)細(xì)胞生物量和綠原酸含量的影響Fig. 7　Effects of different concentrations of CaCl2 on cell biomass and chlorogenic acid production in cell suspension cultures

2.8 Mg2+對(duì)“渝蕾1號(hào)”懸浮體系中細(xì)胞生長(zhǎng)和綠原酸含量的影響

由圖8可知，生物量和綠原酸的含量趨向于相反的走勢(shì)，對(duì)于生物量來(lái)說(shuō)，隨著MgSO4·7H2O濃度的增加，生物量逐漸較少，且各梯度間差異基本不大，且在MgSO4·7H2O濃度為0.05 g·L-1時(shí)，達(dá)到最大值(7.28 g·L-1)；而對(duì)于綠原酸的含量，隨著MgSO4·7H2O的增加，綠原酸含量亦在增加，各濃度梯度間差異還是較為顯著，且在MgSO4·7H2O濃度為0.50 g·L-1時(shí)，達(dá)到最大值(15.92 mg·g-1DW)。特別值得一提的是，在本研究中，對(duì)Mg2+來(lái)說(shuō)，低濃度促進(jìn)生物量的積累，高濃度促進(jìn)綠原酸的合成。兼顧細(xì)胞生物量和綠原酸含量，只能選擇適中的濃度，即與對(duì)照組(0.25 g·L-1)相差不大的濃度較為合適。

圖 8　不同濃度的MgSO4·7H2O對(duì)細(xì)胞生物量和綠原酸含量的影響Fig. 8　Effects of different concentrations of MgSO4·7H2O on cell biomass and chlorogenic acid production in cell suspension cultures

3討論

植物細(xì)胞培養(yǎng)中常用培養(yǎng)基成分區(qū)別主要在于無(wú)機(jī)鹽的種類和含量，而培養(yǎng)基成分又與植物細(xì)胞生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的形成有密切的關(guān)系，因此，在選擇培養(yǎng)基時(shí)，既要考慮培養(yǎng)基的種類，更要注重?zé)o機(jī)鹽的種類及含量，尤其是總氮水平、氮源種類及比例，還有K、P、Ca、Mg等大量元素的含量等(李玉平等，2010)。本研究從無(wú)機(jī)總氮水平、無(wú)機(jī)氮源種類及比例、P、Ca、Mg濃度等方面，探究其對(duì)灰氈毛忍冬“渝蕾1號(hào)”懸浮培養(yǎng)體系中生物量和綠原酸含量的影響，旨在優(yōu)化培養(yǎng)條件，為工業(yè)化生產(chǎn)其次生代謝產(chǎn)物——綠原酸打下基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在總氮源方面，保持總N量27 mmol·L-1不變，NO3-/NH4+摩爾比值為B5培養(yǎng)基中NO3-/NH4+摩爾比值13∶1(即對(duì)照)時(shí)，即NO3-遠(yuǎn)多余NH4+，細(xì)胞的生物量和綠原酸含量都比較高，原因可能如李莉等(2006)研究一樣。李莉等(2006)研究表明，當(dāng)過(guò)量的氨存在以及在較高pH條件下，苯丙氨酸解氨酶(PAL)能逆向催化代謝，不利于植物綠原酸代謝體系的進(jìn)行，這或許就是較低濃度的NH4+比較適合目標(biāo)產(chǎn)物綠原酸合成的原因。高日等(2011)研究發(fā)現(xiàn)，在MS培養(yǎng)基中硝態(tài)氮比銨態(tài)氮更有益于人參細(xì)胞皂苷的合成，這與本研究結(jié)果基本一致。Yin et al(2013)發(fā)現(xiàn)，保持60 mmol·L-1總無(wú)機(jī)氮源不變，當(dāng) NO3-/NH4+為2∶1時(shí)，有利于柳錢(qián)屬植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和三萜類化合物的積累，這與本研究結(jié)果稍有差異，可能與物種有關(guān)。單一氮源的研究中，對(duì)硝態(tài)氮來(lái)說(shuō)，NO3-濃度稍高于對(duì)照組(2.5 g·L-1)時(shí)有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，稍低于對(duì)照組時(shí)有利于綠原酸的合成。對(duì)銨態(tài)氮來(lái)說(shuō)，當(dāng)(NH4)2SO4濃度高于0.134 g·L-1(對(duì)照)時(shí)，綠原酸含量呈現(xiàn)出逐級(jí)遞增的趨勢(shì)?？梢?jiàn)單一氮源和復(fù)合氮源之間的結(jié)果差異較大。對(duì)于P、Ca、Mg離子濃度的選擇，本研究表明均應(yīng)考慮適中濃度(即0.1 g·L-1NaH2PO4·2H2O、0.20 g·L-1CaCl2與0.25 g·L-1MgSO4·7H2O)。李玉平等(2010)報(bào)道，適中濃度的H2PO4-(5 mmol·L-1)有利于大花金挖耳細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮的合成；Yin et al(2013)也報(bào)道，適中濃度的KH2PO4(1.25 mmol·L-1)、CaCl2(2 mmol·L-1)均有利于柳錢(qián)屬植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和三萜類化合物的積累，這與本研究結(jié)果一致。但也有不同的研究結(jié)果，如Remya et al(2013)研究表明，在地錢(qián)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)產(chǎn)黃酮的體系中，加入不同濃度的Ca或Mg都不能使細(xì)胞生物量和黃酮產(chǎn)量有顯著變化。另外，高永超等(2003)在大量元素對(duì)牛角蘚愈傷組織懸浮細(xì)胞的研究中指出，大量元素明顯促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，大量元素濃度越高，促進(jìn)作用越明顯。以上結(jié)果表明不同植物對(duì)于Ca或Mg的吸收有差異，從而造成次生代謝產(chǎn)物積累有所不同?？傊参镌谏L(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，無(wú)機(jī)鹽是必不可少的一大營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)于不同的植物材料，需要進(jìn)行具體的研究，得到的結(jié)果也千差萬(wàn)別。本研究對(duì)灰氈毛忍冬“渝蕾1號(hào)”懸浮培養(yǎng)體系中的主要無(wú)機(jī)元素進(jìn)行了探索，旨在獲得更高產(chǎn)量的綠原酸，為綠原酸的生產(chǎn)化打下基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn):

DENG L,YUAN H,YU ZY,2005. Research progress of chlorogenic acid [J]. Chem & Bioeng,7:4-6. [鄧良，袁華，喻宗沅, 2005. 綠原酸的研究進(jìn)展] [J]. 化學(xué)與生物工程，7：4-6.

GAO R,PIAO XC,YU XK,et al， 2011. Effect of sucrose and in organic salt on ginsenoside production ofPanaxginsengduring cell suspension culture [J]. J Agric Sci Yanbian Univ,33(2):89-93. [高日,樸炫春,于曉坤,等， 2011. 人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中蔗糖和無(wú)機(jī)鹽對(duì)皂苷生產(chǎn)的影響 [J]. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào),33(2):89-93.]

GAO YC,XU H,SHA W, et al, 2003. Physiological effect of major elements on the suspended cells ofCratoneuronfilicinum[J]. Plant Physiol Comm，39(6):595-598. [高永超,薛紅,沙偉,等, 2003. 大量元素對(duì)牛角蘚愈傷組織懸浮細(xì)胞的生理效應(yīng) [J]. 植物生理學(xué)通報(bào)，39(6):595-598.]

GONG ZH, REN GP, SHU QX, et al, 2011. Study on separation and purification of chlorogenic acid from honeysuckle flower by macroporous resin [J]. J Instr Anal, 30(1):85-90. [龔志華，任國(guó)譜，舒青孝，等，2011. 大孔吸附樹(shù)脂分離純化金銀花綠原酸研究 [J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，30(1)：85-90.]

HU KJ, SUN KX, WANG L, et al, 2001. Inhibited effect of chlorogenic acid on virusinvitro[J]. J Harbin Med Univ,35(6):430-432. [胡克杰, 孫考祥, 王璐, 等, 2001. 氯原酸體外抗病毒研究 [J]. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),35(6):430-432.]

HUANG CY， 2009. The first new medicinal plant ofLoniceramacranthoidesHand. -Mazz. ‘Yulei 1’callus in Chongqing [J]. Farm Sci Technol,6:53. [黃昌銀， 2009. 重慶市首個(gè)藥用植物新品種—“渝蕾一號(hào)”金銀花 [J]. 農(nóng)家科技,6:53.]

ILAIYARAJA N,DEVI A,KHANUM F， 2015. Chlorogenic acid-loaded chitosan nanoparticles with sustainedrelease property,retained antioxidant activity and enhanced bioavailability [J]. Asian J Pharm Sci,10(3): 203-211.

JIANG FQ, 2012. Study on tissue culture and major secondarymetabolism product content ofLoniceramacranthoidesHand. -Mazz. Yulei No. l [D]. Chengdu:College of Life Sciences Sichuan Normal University. [姜法強(qiáng), 2012. 金銀花新品種“渝蕾一號(hào)”的組織培養(yǎng)及主要次生代謝產(chǎn)物含量的研究 [D]. 成都:四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院.]KE MQ, 1982. physicochemical and pharmacological properties of effective ingredients of Chinese herbal medicine [M]. Changsha:Hunan Science and Technology Press. [柯銘清, 1982. 中草藥有效成分理化與藥理特性 [M]. 長(zhǎng)沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社.]KRISHNAN R, ANIL KVS, MURUGANK, 2014. Establishment of cell suspension culture inMarchantialinearisLehm & Lindenb. for the optimum production of flavonoids [J]. 3Biotech， 4:49-56.

LI DJ, WEI JF, LIU SQ, et al, 2003. Research progress in medicinal plant cell suspension culture [J]. J Hebei For Sci Technol,(4):22-23. [李冬杰，魏景芳，劉淑青，等，2003. 藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究進(jìn)展 [J]. 河北林業(yè)科技，(4)：22-23.]

LI L,ZHAO Y,MA JL, 2006. Recent progress on key enzymes: PAL,C4 H,4CL of phenylalanine metabolism pathway [J]. Chin J Bioinform,5(4):187-189. [李莉,趙越,馬君蘭, 2006. 苯丙氨酸代謝途徑關(guān)鍵酶：PAL、C4H、4CL研究新進(jìn)展 [J]. 生物信息學(xué),5(4):187-189.]LI R,TAN XF,CHEN Q, 2011. Cell suspension culture ofDendrobiumhuoshanenesand its optimal conditions [J]. Chin Trad Herb Drugs, 42(2): 358-362. [李蕤,譚曉芳,陳群, 2011. 霍山石斛細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及條件優(yōu)化 [J]. 中草藥, 42(2): 358-362.]

LI YP,ZHANG N,CHENG XX,et al, 2010. Allelopathy potential of intracellular secondary metabolic products and cell suspension culture ofCarpesiummacrocephalumFranch. et Sav [J]. Acta Agr，18(5):708-713. [李玉平,張妮,陳曉旭,等, 2010. 大花金挖耳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及其胞內(nèi)代謝產(chǎn)物化感潛力的研究 [J]. 草地學(xué)報(bào)，18(5):708-713.]

MA F,ZHU YL,CHEN MH,et al， 2010. Research progress on extraction process of chlorogenic acid fromFloslonicerae[J].

Food Res Dev,31(7):164-166. [馬烽,朱亞玲,陳明輝,等， 2010. 金銀花中綠原酸提取工藝研究進(jìn)展 [J]. 食品研究與開(kāi)發(fā),31(7):164-166.]

NAGELLA P,MURTHY HN， 2010. Establishment of cell suspension cultures ofWithaniasomniferafor theproductionof withanolide A [J]. Bioresourc Technol,101：6 735-6 739.NATIONAL PHARMACOPOEIA COMMITTEE, 2010. Pharmacopeia of the People’s Republic of China [M]. Beijing：Chinese Medicine Science Technology Press. [國(guó)家藥典委員會(huì), 2010. 中國(guó)人民共和國(guó)藥典(一部) [M]. 北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.]NI FY, LIU L, SONG YL, et al,2015. Anti-complementary phenoloc acids fromLonicerajaponica[J]. Chin J Chin Mat Med,40(2):269-274. [倪付勇，劉露，宋亞玲，等，2015. 金銀花中抗補(bǔ)體活性酚酸類成分的研究 [J]. 中國(guó)中藥雜志，40(2)：269-274.] RODRIGUEZ DE SOFILLO DV,MH, 2002. Chlorogenic acid modifies plasma and liverconcentrations of: cholesterol, triacylglycerol,and minerals in (fa/fa) Zucker rats [J]. J Nutr Biochem, 13: 717-726.

WANG L,REN X, 2009. Optimization of technology for extraction of chlorogenic acid fromFlosloniceraewith ethanol [J]. Bever Ind,12(1):18-20. [王利,冉旭, 2009. 金銀花中綠原酸醇提工藝的研究 [J]. 飲料工業(yè),12(1):18-20.]

WANG SK,XU YL,PAN M,et al, 2010. Research on the extraction of chlorogenic acid from sweet potato leafandits antibacterial efficiency [J]. J Anhui Agric Sci,38(1):5 862-5 863, 5 876. [王世寬，許艷麗，潘明，等，2010. 甘薯葉中綠原酸的提取及抑菌作用的研究 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，38(1):5 862-5 863, 5 876.] WANG TZ,LI YM, 2000.FlosLonicerae’s research progress [J]. West Chin J Pharm Sci,15(4) :292-298. [王天志,李永梅, 2000. 金銀花的研究進(jìn)展 [J]. 華西藥學(xué)雜志,15(4) :292-298.]

WU L, 2007. Effect of chlorogenic acid on antioxidant activity ofFlosloniceraeextracts [J]. J Zhejiang Univ Sci B, 8: 673-679.XU JW,ZHAO XJ,WANG XY,et al, 2011. Research progress of evaluation, breeding and application on the commonly used Chinese medicinal herbs of honeysuckle [J]. Sci Technol Innov Her, 1:17. [徐建偉,趙小俊,王雪艷,等, 2011. 常用中藥材金銀花的評(píng)價(jià)、育種和應(yīng)用研究進(jìn)展 [J]. 科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào), 1:17.]YANG DJ,ZHONG GY,LI LY,et al， 2011. The presentsituation and market analysisof the extracts from honeysuckle, http://www. zgcqxs . net/default/comshow-810-23081. shtml,5. 29. [楊大堅(jiān),鐘國(guó)躍,李隆云,等， 2011. 金銀花提取物的現(xiàn)狀及市場(chǎng)分析, http://www. zgcqxs . net/default/comshow-810-23081. shtml,5. 29. ]

YIN ZP,SHANGGUAN XC, CHEN JG,et al, 2013. Growth and triterpenic acid accumulation ofCyclocaryapaliuruscell suspension cultures [J]. Biotechnol Bioproc Eng,18: 606-614.

YU SL,ZHANG L,SUN L, 2002.FlosLonicerae’sresearch progress [J]. Lishizhen Med Mat Med Res, 13(8):498-500. [于生蘭,張龍,孫玲, 2002. 金銀花的研究進(jìn)展 [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 13(8):498-500.]

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Effects of different species of inorganic salt on the chlorogenic acid content and the growth of cell in suspension cultures ofLoniceramacranthoidesHand.-Mazz. “Yulei 1”

TANG Ming， WANG Chao， TAN Yun-Ya， LI Qun*

(CollegeofLifeSciences，SichuanNormalUniversity, Chengdu 610101， China )

Abstract:In order to improve the content of chlorogenic acid in cell suspension cultures of Lonicera macranthoides Hand.-Mazz. “Yulei 1”, this paper discussed that the different species of inorganic salt had many effects on the chlorogenic acid content and growth of cell in suspension cultures of L. macranthoides Hand.-Mazz. “Yulei 1”. We weighed the biomass of the L. macranthoides Hand.-Mazz. “Yulei 1” cells and analyzed the content of chlrogenic acid by HPLC through the additions of different concentrations of inorganic salt in cell suspension cultures of L. macranthoides Hand.-Mazz. “Yulei 1”. The result showed that the optimal NO3-/NH4+ratio was consisted with NO3-/NH4+(nitrate nitrogen/ammonium nitrogen) ratio in B5medium. In other words, the suspension culture would be benefitial for the accumulation of chlorogenicacid and growth of cell when NO3-/NH4+(nitrate nitrogen/ ammonium nitrogen) ratio was 13∶1. When single N source was added, the biomass of callus reached the maximum (19.26 g·L-1) in 3.5 g·L-1KNO3. However, when KNO3 concentration was at relatively low levels (0.5 and 1.5 g·L-1), high chlorogenic acid production was accumulated. The two studies of NO3-had some differences from the control concentration (2.5 g·L-1). What’s more, while (NH4)2SO4 concentration (0.268 g·L-1) exceeded control concentration (0.134 g·L-1), the highest growth of biomass of the L. macranthoides Hand.-Mazz. “Yulei 1” and the high chlorogenic acid production were observed. In the same way, different species and different concentrations of P, Ca and Mg might have different impacts on the chlorogenic acid content and growth of cell. The result showed that when the highest growth of biomass and the high chlorogenic acid production were accumulated, when NaH2PO4·2H2O concentration was 0.10 g·L-1. In addition, when the highest growth of biomass and the high chlorogenic acid production were accumulated, when CaCl2concentration was 0.20 g·L-1. So far as Mg2+was concerned, a low MgSO4·7H2O concentration could promote the growth of cell, while excessive MgSO4·7H2O concentration would promote the accumulation of chlorogenic acid. Taking the biomass growth and chlorogenic acid production into consideration, the optimal concentration of Mg was moderate. These results had some differences from the control. Our study demonstrated that inorganic salt concentration had some differences from inorganic salt concentration of B5 in suspension cultures of L. macranthoides Hand.-Mazz. “Yulei 1”. This study suggested that the optimized conditions could improve biomass accumulation and chlorogenic acid production through the addition of moderate concentration of inorganic salt in cell suspension cultures of L. macranthoides Hand.-Mazz. “Yulei 1”. These results lays a foundation for large-scale production of chlorogenic acid by using the cell suspension cultures of L. macranthoides Hand.-Mazz. “Yulei 1”. This study also has practical significance to large-scale productions of chlorogenic acid.

Key words:Lonicera macranthoides Hand. -Mazz. “Yulei 1”, suspension culture, chlorogenic acid, HPLC, inorganic salt

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201412035

收稿日期:2014-12-23修回日期： 2015-01-15

基金項(xiàng)目：四川省教育廳成果培育項(xiàng)目(12ZZ009)[Supported by the Achievement Cultivation Program of Education Office of Sichuan Province(12ZZ009)]。

作者簡(jiǎn)介：唐明(1988- )，男，甘肅人，在讀碩士研究生，主要從事細(xì)胞生物學(xué)研究，(E-mail)1326665453@qq.com。*通訊作者： 李群，博士，副教授，研究生導(dǎo)師，主要從事植物細(xì)胞工程方面的研究，(E-mail)Liqun01234@163.com。

中圖分類號(hào)：Q943.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142(2016)05-0582-07

唐明，汪超，譚韻雅，等. 不同種類無(wú)機(jī)鹽對(duì)灰氈毛忍冬“渝蕾1號(hào)”懸浮培養(yǎng)體系中細(xì)胞生長(zhǎng)和綠原酸含量的影響 [J]. 廣西植物， 2016， 36(5)：582-588

TANG M，WANG C，TAN YY，et al. Effects of different species of inorganic salt on the chlorogenic acid content and the growth of cell in suspension cultures ofLoniceramacranthoidesHand.-Mazz. “Yulei 1”[J]. Guihaia， 2016， 36(5)：582-588