張秋紅　李靜　周建甫　向松濤

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·實(shí)驗(yàn)研究·

澳洲茄邊堿對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用及機(jī)制研究

張秋紅李靜周建甫向松濤

510405 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(張秋紅)；廣東省中醫(yī)院泌尿外科(李靜、周建甫、向松濤)

【摘要】目的研究澳洲茄邊堿(solamargine, SM)對(duì)人前列腺癌激素非依賴細(xì)胞增殖的影響及可能的作用機(jī)制。 方法用不同濃度SM(0、1、2、4、6、8、10 μmol/L)處理DU145和PC3細(xì)胞，MTT法檢測(cè)SM對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，Western blot檢測(cè)SM對(duì)相關(guān)信號(hào)通路蛋白p38 MAPK、ERK1/2 MAPK、MUC1表達(dá)的影響。 結(jié)果6 μmol/L SM作用24 h后DU145和PC3細(xì)胞活力分別為(52.53±9.05)%、(56.28±2.36)%,并具有時(shí)間和劑量依賴；10 μmol/L SM作用24 h后細(xì)胞活力分別為(27.36±2.72)%、(32.07±2.53)%。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示不同濃度SM(0、4、6、8 μmol/L)處理PC3細(xì)胞能引起PC3細(xì)胞阻滯在G1期，G1期細(xì)胞比例分別為(52.61±0.50)%、(52.96±1.49)%、(66.16±2.84)%和(69.03±2.38)%。且能激活MAPK信號(hào)通路減少下游蛋白MUC1的表達(dá)。 結(jié)論SM能明顯抑制DU145和PC3細(xì)胞生長(zhǎng)，該作用可能與MAPK信號(hào)通路的激活以及下游MUC1蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】前列腺癌；細(xì)胞增殖；MAPK；MUC1；澳洲茄邊堿

澳洲茄邊堿(solamargine, SM)是從中藥龍葵中提取的天然甾體生物堿糖苷化合物和細(xì)胞毒性劑，能引起腫瘤細(xì)胞的凋亡或與其他化學(xué)藥物起到協(xié)同作用，增強(qiáng)治療效果[1]。研究證明SM能抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)并引起肺癌細(xì)胞凋亡[2]，但有關(guān)SM抗前列腺癌特別是激素非依賴性前列腺癌的報(bào)道很少。本研究將SM作用于激素非依賴前列腺癌細(xì)胞，研究其對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響并探討其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

一、材料

1.細(xì)胞株：人前列腺癌細(xì)胞株DU145、PC3，由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院林百欣醫(yī)學(xué)研究中心實(shí)驗(yàn)室提供。

2.試劑：SM購(gòu)自成都曼徹斯特公司；DMEM高糖培養(yǎng)液、胰酶及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；MTT購(gòu)自廣州威佳科技有限公司。一抗MUC1、p-p38、p38、p-ERK1/2、GAPDH購(gòu)自Abcam公司，兔抗二抗購(gòu)自Cell Signal Technology公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：DU145和PC3細(xì)胞使用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，在含5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞待用。

2.MTT細(xì)胞活力測(cè)定：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DU145和PC3細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液接種于96孔板，細(xì)胞密度為5×103個(gè)/孔，待細(xì)胞貼壁加入不同濃度SM(0、1、2、4、6、8、10 μmol/L)，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，向每孔加入10 μl MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測(cè)定570 nm處吸光度(A)值。細(xì)胞活力(%)=(加藥組A值/空白組A值)×100%。

3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC3細(xì)胞以3×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，貼壁后加入不同濃度的SM，24 h后收集細(xì)胞，按細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作上機(jī)。

4.Western blot分析：細(xì)胞以3×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，貼壁后加入不同濃度的SM，24 h后每孔加入40 μl裂解液，提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，等量蛋白上樣，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后半干轉(zhuǎn)1 h，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，加入二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、SM對(duì)DU145和PC3細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

加藥之后細(xì)胞活力明顯下降并呈時(shí)間和劑量依賴(圖1，表1、2)。說(shuō)明SM對(duì)DU145和PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。

圖1不同濃度SM對(duì)DU14和PC3細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(細(xì)胞活力的計(jì)算：將未加藥組作為空白對(duì)照，加藥組A

值依次與其相比，得出細(xì)胞活力曲線，且對(duì)照組與自身相比比值為1)

表1　SM對(duì)DU145細(xì)胞活力的影響

與未加藥組相比*P<0.05；與24 h相比#P<0.05；與48 h相比△P<0.05

表2　SM對(duì)PC3細(xì)胞活力的影響

與未加藥組相比*P<0.05；與24 h相比#P<0.05；與48h相比△P<0.05

二、SM對(duì)PC3細(xì)胞周期的影響

MTT實(shí)驗(yàn)可以看出1 μmol/L和2 μmol/L對(duì)PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有任何抑制作用，且IC50約為7.0 μmol/L，因此細(xì)胞周期的檢測(cè)中并未設(shè)立1 μmol/L和2 μmol/L組。不同濃度SM(0、4、6、8 μmol/L)處理PC3細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，藥物處理組PC3細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯(圖2)。4、6、8 μmol/L SM組G0/G1期細(xì)胞比例與對(duì)照組[(52.61±0.50)%]相比，分別上升至(52.96±1.49)%、(66.16±2.84)%和(69.03±2.38)%，6、8 μmol/L SM組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：對(duì)照組各時(shí)期的細(xì)胞百分比，G0/G1 (52.61±0.50)%、S (32.92±0.82)%、G2/M (14.48±1.25)%；B：4 μmol/L處理細(xì)胞24 h后G0/G1為 (52.96±1.49)%、S (32.12±1.62)%、G2/M (14.92±0.48)%；C：6 μmol/L處理細(xì)胞24 h后G0/G1為 (66.16±2.84)%*、S (17.99±1.44)%*、G2/M (15.85±1.49)%；D：8 μmol/L處理細(xì)胞24 h后G0/G1為 (69.03±2.38)%*、S (14.97±1.38)%*、G2/M (16.00±2.37)%；E：將上述數(shù)據(jù)整理后畫出柱狀圖(與對(duì)照組相比*P<0.05)

圖2SM引起PC3細(xì)胞周期阻滯，并呈劑量依賴[使用Multicycle AV DNA 分析軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)胞周期每個(gè)階段

(G0/G1、S、G2/M)的細(xì)胞比例]

三、SM對(duì)MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

SM(6 μmol/L)處理DU145和PC3細(xì)胞，Western blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(0、0.5、2、4、8、24 h)p-p38 MAPK、p-ERK MAPK等蛋白的表達(dá)。SM可以增加p-p38 MAPK的磷酸化水平，其中DU145細(xì)胞4 h、8 h與0 h相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PC3細(xì)胞0.5 h、2 h、4 h與0 h相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且可降低p-ERK MAPK的磷酸化水平(圖3A)。不同濃度SM(0、1、2、4、6、8 μmol/L)處理DU145與PC3細(xì)胞24 h，Western blot檢測(cè)MUC1的表達(dá)，SM引起MUC1表達(dá)下調(diào)，其中6 μmol/L、8 μmol/L與0 μmol/L相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3B)。

A：SM能增加p38的磷酸化水平，伴隨p-ERK MAPK的下調(diào)；B：SM引起MUC1表達(dá)下調(diào)(與未處理對(duì)照組相比*P<0.05)

圖3SM對(duì)p-p38 MAPK、p-ERK MAPK和MUC1蛋白表達(dá)的影響

討論

內(nèi)分泌治療為晚期前列腺癌患者贏得了一定的生存期，但前列腺癌由激素依賴向激素非依賴的轉(zhuǎn)化仍然是臨床面臨的難題和威脅患者生命的罪魁禍?zhǔn)譡3]，其轉(zhuǎn)變機(jī)制目前尚不明確。由于現(xiàn)存治療方法的局限性，許多患者死于腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此探索新的輔助藥物，揭示其作用機(jī)制和尋找其細(xì)胞內(nèi)作用的分子靶點(diǎn)是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。中藥龍葵近年來(lái)由于其抗癌活性而日益成為研究的熱點(diǎn)[4]，澳洲茄堿、SM是其主要活性成分。其中SM是一種天然甾體生物堿糖苷化合物和細(xì)胞毒性劑，能引起腫瘤細(xì)胞的凋亡或與其他化學(xué)藥物起到協(xié)同作用，增強(qiáng)治療效果。有研究認(rèn)為SM能夠調(diào)節(jié)Fas和HER2蛋白表達(dá)并增加肺癌細(xì)胞對(duì)表柔比星和赫賽汀的敏感性[5]；在白血病細(xì)胞中能激活溶酶體-線粒體途徑的細(xì)胞死亡通路[6]。但SM對(duì)于激素非依賴前列腺癌的作用未見報(bào)道。

本研究中，我們證實(shí)了SM對(duì)DU145和PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性，并通過(guò)上調(diào)p-p38 MAPK和下調(diào)p-ERK MAPK而激活MAPK信號(hào)通路。MAPK是一組能被不同的細(xì)胞內(nèi)外刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，其中ERK廣泛存在于各種組織，主要參與調(diào)控細(xì)胞的增殖分化，JNK家族是細(xì)胞對(duì)各種應(yīng)激原誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子，主要參與應(yīng)激反應(yīng)，p38介導(dǎo)炎癥、凋亡等[7]。有研究證明SM可以通過(guò)上調(diào)p38 MAPK磷酸化水平引起肺癌細(xì)胞周期阻滯[2]，與我們研究結(jié)果一致。因此我們認(rèn)為在激素非依賴前列腺癌細(xì)胞中p38 MAPK主要介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，ERK主要介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。但也有研究認(rèn)為ERK在有些情況下也是腫瘤的抑制基因，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的衰老和凋亡[8]，提示了MAPK信號(hào)通路在不同的組織和環(huán)境中可能有著不同的功能，有待于更加細(xì)致和深入的研究進(jìn)行闡明。

為了進(jìn)一步闡明SM抑制激素非依賴前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)機(jī)制，我們對(duì)SM對(duì)蛋白MUC1表達(dá)的影響進(jìn)行了研究。MUC1 是單通道Ⅰ型跨膜蛋白，在腫瘤細(xì)胞中異常糖基化的MUC1常呈過(guò)表達(dá)的趨勢(shì)，因此被作為一種致瘤因子受到廣泛的關(guān)注。在對(duì)前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)激素非依賴前列腺癌細(xì)胞DU145 和PC3細(xì)胞相對(duì)于正常的前列腺上皮細(xì)胞PrEC MUC1表達(dá)明顯增多，而激素依賴前列腺癌細(xì)胞LNCaP MUC1表達(dá)缺失[9]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)使用siRNA技術(shù)沉默MUC1基因后，PC3細(xì)胞的增值能力受到影響[10]，且姜黃素可以通過(guò)下調(diào)MUC1而逆轉(zhuǎn)比卡魯胺的耐藥[11]，我們此次的研究結(jié)果表明SM可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并下調(diào)MUC1的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有統(tǒng)一性。我們認(rèn)為可以將MUC1作為激素非依賴前列腺癌的一個(gè)分子標(biāo)志物，并以此為靶點(diǎn)開發(fā)新型藥物，為前列腺癌激素非依賴患者提供新的治療希望。

綜上所述，我們認(rèn)為SM能通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)下游MUC1的表達(dá)從而抑制激素非依賴前列腺癌細(xì)胞的增殖，但有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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(本文編輯：熊鈺芬)

通信作者：向松濤，E-mail:tonyxst@163.com

doi:10.3870/j.issn.1674-4624.2016.01.010

(收稿日期：2015-11-12)

Effect and mechanism of solamargine on proliferation of prostate cancer cells

ZHANGQiu-hong*,LIJing,ZHOUJian-fu,XIANGSong-tao.

*SecondClinicalMedicalCollegeofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,ChinaCorrespondingauthor:XIANGSong-tao,E-mail:tonyxst@163.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of solamargine (SM) on the proliferation of prostate cancer cells and the possible mechanism. MethodsDU145 and PC3 cells were treated with different concentration of SM (0, 1, 2, 4, 6, 8, 10 μmol/L). MTT assay were used to detect the inhibiting effect of SM on the proliferation of DU145 and PC3. Expression of p38 MAPK, ERK1/2 MAPK, MUC1 protein were detected by Western blot. Cell cycle was detected by flow cytometry. ResultsThe cell viability of DU145 and PC3 cells after treated with 6 μmol/L SM for 24 h were (52.53±9.05)% and (56.28±2.36)%. With time and dose dependent, when treated with 10 μmol/L SM for 24 h were (27.36±2.72)%, (32.07±2.53)%. SM (0, 4, 6, 8 μmol/L) can induce cell cycle arrest at G0/G1 phase of PC3 and activate MAPK signal pathway which can reduce the downstream protein MUC1 expression. The cell rate of G1 were (52.61±0.50)%, (52.96±1.49)%, (66.16±2.84)% and (69.03±2.38)%, respectively.ConclusionsSM can inhibit the growth of DU145 and PC3. The mechanism may be related to the activation of MAPK signal pathway and cut on the downstream MUC1 protein expression.

【Key words】Prostate cancer;Cell proliferation;MAPK;MUC1;Solamargine