林英立　李艷麗　戚景光　馬建國　李文平　孫光

221005 徐州市腫瘤醫(yī)院泌尿外科(林英立、戚景光)；徐州市腫瘤醫(yī)院科教科(李艷麗)；河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科(馬建國、李文平)；天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科(孫光)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

CDH13表達(dá)下調(diào)對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲及PI3K/Akt表達(dá)的影響

林英立李艷麗戚景光馬建國李文平孫光

221005 徐州市腫瘤醫(yī)院泌尿外科(林英立、戚景光)；徐州市腫瘤醫(yī)院科教科(李艷麗)；河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科(馬建國、李文平)；天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科(孫光)

【摘要】目的研究膀胱癌5637細(xì)胞中CDH13表達(dá)下調(diào)后對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲和PI3K/Akt表達(dá)的影響以及它們間的關(guān)系。方法應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制人膀胱癌5637細(xì)胞株中CDH13的表達(dá)，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，Transwell 小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，Western blot檢測(cè)CDH13、PI3K及Akt的表達(dá)水平。結(jié)果膀胱癌5637細(xì)胞中CDH13表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)，PI3K及Akt的表達(dá)增加。結(jié)論膀胱癌細(xì)胞中CDH13表達(dá)下調(diào)可能通過激活PI3K/Akt通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

【關(guān)鍵詞】膀胱癌；遷移；侵襲；CDH13

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來隨著暴露于危險(xiǎn)因素的增加及人口的老齡化，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1-3]。CDH13是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)抑癌基因，其表達(dá)下調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)CDH13在膀胱癌組織中表達(dá)減少，并與腫瘤的分期、分級(jí)密切相關(guān)[5-8]。在本研究中我們應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制CDH13在膀胱癌5637細(xì)胞中的表達(dá)，檢測(cè)CDH13表達(dá)下調(diào)對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲及PI3K/Akt表達(dá)的影響，并探討它們之間的關(guān)系。

材料與方法

一、材料

人膀胱癌5637細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫， RPMI 1640培養(yǎng)液購于美國Gibeo公司，胎牛血清購于杭州四季青生物工程公司，兔抗人CDH13多克隆抗體、兔抗人PI3K多克隆抗體、兔抗人Akt多克隆抗體、CDH13 shRNA Plasmid、Control shRNA Plasmid購于美國Santa Cruz公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司，MTT購自美國Sigma公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

5637細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。本研究分為3組，A：正常對(duì)照組(1×PBS)；B：陰性對(duì)照組(Control shRNA Plasmid)；C：實(shí)驗(yàn)組(CDH13 shRNA Plasmid)。取對(duì)數(shù)生長期的5637細(xì)胞用胰酶消化并計(jì)數(shù)，用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml，取500 μl接種于6孔板，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80% 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作按照LipofectamineTM2000 說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代培養(yǎng)，應(yīng)用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá) shRNA 的細(xì)胞，Western blot檢測(cè)CDH13基因的蛋白沉默效果[7-8]。

三、Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗4℃過夜，TBS洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，用ECL發(fā)光劑檢測(cè)；各組以β-actin作內(nèi)參，將每個(gè)樣本的灰度值與內(nèi)參灰度值比較，得出的比值代表蛋白的含量。

四、細(xì)胞遷移能力檢測(cè)

應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，在玻璃培養(yǎng)皿中心加入150 μl濃度為10 μg/ml的纖維蛋白，將細(xì)胞種植于培養(yǎng)皿中心部過夜，用200 μl槍頭尖端在培養(yǎng)皿細(xì)胞層劃痕，分別于不同時(shí)間段在顯微鏡下觀察、拍照,測(cè)量劃痕寬度的變化。

五、Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，消化細(xì)胞，用PBS和無血清培養(yǎng)液先后洗滌1次，用無血清培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為1×105/ml，在下室(即24孔板底部)加入600 μl含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液，在上室加入150 μl細(xì)胞懸液，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)基底膜下室的細(xì)胞數(shù)，顯微鏡下(400×)隨機(jī)選擇6個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均值為穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞數(shù)代表其侵襲能力。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

一、RNA干擾抑制膀胱癌5637細(xì)胞CDH13蛋白的表達(dá)

shRNA轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組CDH13蛋白表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組(圖1)；正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的CDH13蛋白與內(nèi)參蛋白相對(duì)灰度值比分別為(1.182±0.046)、(1.158±0.055)、(0.187±0.015),實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組間CDH13表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、CDH13表達(dá)下調(diào)對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CDH13表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)，與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1、圖2)。

與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較*P<0.05

三、CDH13表達(dá)下調(diào)對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CDH13表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)，與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組穿過慮膜的細(xì)胞數(shù)分別為(58.667±3.886)、(60.735±2.871)、(125.333±7.361)。

四、CDH13表達(dá)下調(diào)對(duì)膀胱癌細(xì)胞PI3K/Akt表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)組PI3K和Akt蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組(圖4)，實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的PI3K蛋白與內(nèi)參蛋白相對(duì)灰度值比分別為(0.654±0.037)、(0.589±0.082)、(1.013±0.027)；正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的Akt蛋白與內(nèi)參蛋白相對(duì)灰度值比分別為(0.469±0.033)、(0.437±0.051)、(0.768±0.061)。

討論

膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過程，在危險(xiǎn)因素的作用下癌基因的激活和抑癌基因的失活促進(jìn)均參與其中[9-10]。CDH13是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)抑癌基因，CDH13基因定位于人染色體16q24，在許多腫瘤中人染色體16q24經(jīng)常發(fā)生突變、缺失以及啟動(dòng)子甲基化等，進(jìn)而影響基因所編碼蛋白的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)CDH13在多種腫瘤中表達(dá)減少或缺失，且CDH13表達(dá)下調(diào)與腫瘤的發(fā)生、增殖和侵襲等有著非常密切的關(guān)系[4]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)在膀胱癌組織中CDH13因其基因啟動(dòng)子甲基化而表達(dá)減少，并且與膀胱癌的惡性生物學(xué)行為及不良預(yù)后有關(guān)[11-13]。CDH13是鈣粘蛋白家族的一員，其參與調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)許多生物加工過程，包括鈣介導(dǎo)的細(xì)胞黏附、細(xì)胞極性和形態(tài)形成，細(xì)胞的聚集和遷移，細(xì)胞的識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程[4]。然而，CDH13表達(dá)是通過何種機(jī)制促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的目前尚不清楚。

研究表明PI3K/Akt信號(hào)通路在大多數(shù)人類腫瘤中調(diào)節(jié)著腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，并且與腫瘤的血管形成和侵襲、轉(zhuǎn)移以及對(duì)化療耐藥、放療抗拒密切相關(guān)，目前在腫瘤研究中備受關(guān)注[14]。激活的Akt重新定位到胞質(zhì)、核內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的其他部位，磷酸化相關(guān)的一些底物蛋白，在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)在膽囊癌細(xì)胞中CDH13表達(dá)減少且伴隨著PI3K和Akt表達(dá)的增高，并且應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使CDH13在膽囊癌細(xì)胞中表達(dá)增高后可抑制PI3K和Akt的表達(dá)，CDH13可能通過PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[15]。然而在膀胱癌中CDH13表達(dá)減少是否對(duì)PI3K和Akt的表達(dá)產(chǎn)生影響、是否通過PI3K/Akt途徑促進(jìn)膀胱癌發(fā)展，目前尚無研究報(bào)道。因此在本研究中我們應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制CDH13在膀胱癌中的表達(dá)，并研究CDH13表達(dá)下調(diào)對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲以及PI3K、Akt表達(dá)的影響，探討CDH13表達(dá)下調(diào)是否通過PI3K/Akt途徑促進(jìn)膀胱癌發(fā)展，為膀胱癌的治療提供新的思路和理論依據(jù)。

我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)使CDH13在膀胱癌5637細(xì)胞中表達(dá)減少后，細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)。我們的結(jié)果與以往在肝癌、乳腺癌及前列腺癌等腫瘤中的研究結(jié)果一致[4,16-18],并且，在膀胱癌細(xì)胞中CDH13表達(dá)減少后PI3K及Akt的表達(dá)明顯增加。研究表明CDH13低表達(dá)將導(dǎo)致多中心體細(xì)胞的出現(xiàn)，而Akt是參與調(diào)節(jié)中心體的主要蛋白激酶[14]。這些結(jié)果表明CDH13表達(dá)下調(diào)可能通過PI3K/Akt通路促進(jìn)膀胱癌的發(fā)展。

綜上所述，在膀胱癌細(xì)胞中CDH13表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)，并且PI3K及Akt表達(dá)明顯增加，這表明CDH13表達(dá)下調(diào)可能與PI3K/Akt通路有關(guān)。

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(本文編輯：熊鈺芬)

The influence of down-regulation expression of CDH13 on the migration, invasion and PI3K/Akt expression of bladder cancer cell

LINGYing-li*,LIYan-li,QIJing-guang,MAJian-guo,LIWen-ping,SUNGuang.

*DepartmentofUrology,XuzhouCancerHospital,Xuzhou221005,ChinaCorrespondingauthor:LINGYing-li,E-mail:lylxz2012@126.com

【Abstract】ObjectiveThe aim of this study was to investigate the influence of down-regulation expression of CDH13 on the migration and invasion of bladder cancer cell and PI3K/Akt expression, as well as the relationship between them. MethodsRNA interference was used to inhibit CDH13 expression in 5637 cells, wound healing was used to examine cell migration, Transwell was used to evaluate cell invasion, the expression of CDH13, PI3K and Akt was examined by Western blot. ResultsThe bladder cancer cell migration, invasion and PI3K/Akt expression was increased after the down-regulation of CDH13. ConclusionsDown-regulation expression of CDH13 in bladder cancer cell maybe promotes tumor cell migration and invasion through PI3K/Akt pathway.

【Key words】Bladder cancer;Migration;Invasion;CDH13

基金項(xiàng)目：徐州市醫(yī)學(xué)青年后備人才項(xiàng)目(2014007)；徐州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(KC14SH015)；江蘇大學(xué)臨床科技發(fā)展基金項(xiàng)目(JLY20140109)；江蘇省“六大人才高峰”資助項(xiàng)目(2014-WSW-066)；江蘇省衛(wèi)計(jì)委青年科研課題項(xiàng)目(Q201514)

通信作者：林英立，E-mail:lylxz2012@126.com

doi:10.3870/j.issn.1674-4624.2016.01.009

(收稿日期：2015-12-23)