楊丹，陳曉明，李夸良，謝立君，潘福生，黃捷

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雷帕霉素的三氮唑新衍生物FIM-X13對(duì)人胃癌細(xì)胞株AGS的作用及機(jī)制的初步研究

楊丹，陳曉明，李夸良，謝立君，潘福生，黃捷

【摘要】

目的研究雷帕霉素的三氮唑新衍生物 FIM-X13 對(duì)人胃癌細(xì)胞株 AGS 的作用，探討其作用機(jī)制并分別與雷帕霉素和依維莫司比較。

方法磺酰羅丹明 B 檢測(cè) FIM-X13 對(duì) AGS 增殖的抑制活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) FIM-X13 對(duì) AGS 細(xì)胞凋亡及周期影響；Western blot 分析 AGS 細(xì)胞內(nèi) mTOR、p70S6K1、S6 和 4EBP1 的磷酸化水平。

結(jié)果FIM-X13 能顯著抑制 AGS 細(xì)胞的增殖，IC50為（9.32 ± 0.70）μmol/L，抑制能力強(qiáng)于雷帕霉素和依維莫司；FIM-X13 能顯著誘導(dǎo) AGS 細(xì)胞凋亡及阻滯細(xì)胞周期于G1期，其誘導(dǎo) AGS 細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期的能力均強(qiáng)于雷帕霉素及依維莫司；FIM-X13 能顯著抑制 AGS 細(xì)胞內(nèi) mTOR、p70S6K1、S6 和 4EBP1 的磷酸化，抑制能力與雷帕霉素和依維莫司相當(dāng)。

結(jié)論雷帕霉素的三氮唑新衍生物 FIM-X13 對(duì)人胃癌細(xì)胞株 AGS 的抑制活性強(qiáng)于雷帕霉素和依維莫司。與雷帕霉素和依維莫司一樣，F(xiàn)IM-X13 主要通過抑制 AGS 的mTOR 信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及阻滯細(xì)胞周期于 G1期等發(fā)揮抗腫瘤作用。

【關(guān)鍵詞】胃腫瘤；哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白；雷帕霉素三氮唑衍生物

www.cmbp.net.cn中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(3):224-228

作者單位：350122 福州，福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（楊丹、黃捷）；350007福州，福建省微生物研究所（楊丹、陳曉明、李夸良、謝立君、黃捷）；310012 杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)新藥研究院有限公司（潘福生）

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種保守的絲-蘇氨酸蛋白激酶，直接或間接參與細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和代謝有關(guān)環(huán)節(jié)的調(diào)控，處于復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中心，mTOR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑過度激活與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、代謝和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1］。mTOR 抑制劑雷帕霉素衍生物依維莫司和替西羅莫司已作為抗癌藥物應(yīng)用于臨床。

胃癌是常見惡性腫瘤之一，世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率一直居高不下［2］。研究表明，60% ～ 80%胃癌中存在 mTOR 信號(hào)通路過度激活［3］，激活與mTOR 上游的關(guān)鍵蛋白基因如 PIK3R3［4］、PIK3CA［5］和 PTEN［6-7］等突變及與 mTOR 相關(guān)的信號(hào)通路失調(diào)［8］有關(guān)。依維莫司治療胃癌的 I/II 期臨床試驗(yàn)已取得較好效果［9-10］。本文報(bào)道雷帕霉素的三氮唑新衍生物 FIM-X13 對(duì)胃癌細(xì)胞株 AGS的作用，與雷帕霉素和依維莫司進(jìn)行比較，探討其用于治療胃癌的可能性。

1　材料與方法

1.1材料

人胃癌細(xì)胞株 AGS 購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；FIM-X13（純度 ＞ 95%）由福建省微生物研究所合成，雷帕霉素（純度 ＞ 95%）由福建科瑞藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，依維莫司（純度 ＞ 95%）購(gòu)自成都雅途生物醫(yī)藥公司，三種化合物用二甲基亞砜（DMSO）配成 1 mmol/L 儲(chǔ)存液，-20℃ 保存；兔抗 mTOR、p-mTOR（Ser2448）、p70S6K1、p-p70S6K1（Thr389）、4EBP1、p-4EBP1（Ser65）、S6、p-S6（Ser235/236）和 GAPDH 抗體購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology公司；HRP 標(biāo)記的兔抗羊 IgG 二抗購(gòu)自美國(guó)Bioworld Technology 公司；F12 培養(yǎng)基、胎牛血清、消化胰酶和磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自美國(guó) Gibco公司；NC 膜和 ECL 發(fā)光試劑均購(gòu)自美國(guó) Biorad公司；磺酰羅丹明 B（sulforhodamine B，SRB）購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司，以 1% 乙酸配制成 4% 溶液，4 ℃ 儲(chǔ)存；三氯乙酸（TCA）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)股份有限公司；Annexin V-FITC/PI 雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；硫酸慶大霉素購(gòu)自福建匯天生物藥業(yè)有限公司。

1.2方法

1.2.1人胃癌細(xì)胞株 AGS 的培養(yǎng)AGS 細(xì)胞在含 10% 胎牛血清、0.08 U/L 慶大霉素的 F12培養(yǎng)基中，于 37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2.2SRB 蛋白染色法檢測(cè) FIM-X13 對(duì)胃癌細(xì)胞株 AGS 增殖的影響操作方法參照文獻(xiàn)［11］進(jìn)行，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 AGS 細(xì)胞以 10 000 個(gè)/孔接種于 96 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng) 24 h 后，加入用培養(yǎng)基稀釋至終濃度分別為 10、15 和 20 μmol/L 的FIM-X13，以相同濃度梯度的雷帕霉素和依維莫司作為陽(yáng)性對(duì)照，不加藥培養(yǎng)基作空白對(duì)照。每個(gè)濃度設(shè) 3 個(gè)重復(fù)孔。培養(yǎng) 48 h，用預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)10% 的 TCA 固定細(xì)胞，4 ℃ 放置 1 h 后蒸餾水洗滌 5 次，室溫自然干燥。加入由體積分?jǐn)?shù) 1% 冰醋酸配制的 0.4% SRB 溶液，室溫染色 15 min，去上清液，以 1% 醋酸洗滌 5 次，室溫自然干燥。最后加入 10 mmol/L Tris 溶液（pH 10.5），酶標(biāo)儀540 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定 OD 值。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1 - OD實(shí)驗(yàn)組/OD空白對(duì)照組）× 100%。并計(jì)算各化合物對(duì) AGS 細(xì)胞的 IC50。

1.2.3Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè) FIM-X13 對(duì) AGS 細(xì)胞凋亡的影響將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 AGS細(xì)胞以 6 × 105個(gè)/孔種入 6 孔板并培養(yǎng) 24 h，傾去培養(yǎng)基，加入用培養(yǎng)基稀釋至終濃度分別為 10、15 和 20 μmol/L 的 FIM-X13，另設(shè) 15 μmol/L 雷帕霉素和依維莫司作為兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組及不加藥培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h 后，采用AnnexinV-FITC/PI 凋亡試劑盒測(cè)定細(xì)胞凋亡率：不含 EDTA 的胰酶消化細(xì)胞后，PBS 洗滌 2 次，用結(jié)合緩沖液 500 μl 重懸細(xì)胞后加入 5 μl AnnexinV-FITC 和 PI，室溫黑暗條件下反應(yīng) 5 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4PI 標(biāo)記檢測(cè) FIM-X13 對(duì) AGS 細(xì)胞周期的影響細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理同 1.2.3，采用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞周期。以不含 EDTA 的胰酶消化細(xì)胞后 PBS 洗滌 2 次。細(xì)胞用 75% 預(yù)冷的乙醇 4 ℃ 固定 12 h 后，預(yù)冷 PBS 洗滌細(xì)胞1 次，然后加入 200 μl 預(yù)冷的 PBS 重懸細(xì)胞。向細(xì)胞懸液中加入 20 μl RNase A 溶液，37 ℃ 水浴30 min，400 目篩網(wǎng)過濾。向?yàn)V液中加入 400 μl PI染液，搖勻后，4 ℃ 避光孵育 30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.5Western blot 檢測(cè) FIM-X13 對(duì) AGS 細(xì)胞mTOR 及其下游蛋白磷酸化的影響細(xì)胞培養(yǎng)同1.2.3。傾去培養(yǎng)基，加入用培養(yǎng)基稀釋至終濃度分別為 0.01、0.1 和 1 μmol/L 的 FIM-X13，另設(shè)0.1 μmol/L 雷帕霉素和依維莫司作為兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組，不加藥培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后，傾去培養(yǎng)基，用 PBS 洗滌細(xì)胞 2 次后，用2% SDS 100 μl 裂解細(xì)胞并收集細(xì)胞裂解液，沸水浴 10 min 后，10 000 r/min 離心 10 min，棄細(xì)胞殘?jiān)?，收集蛋白。BCA 蛋白試劑盒測(cè)定細(xì)胞裂解液蛋白含量并將各樣品蛋白含量定量至一致。根據(jù)不同待測(cè)蛋白質(zhì)的分子量選擇不同濃度的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，半干式轉(zhuǎn)膜儀將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至 NC 膜，5% 脫脂牛奶封閉空白位點(diǎn)，特異性一抗 4 ℃ 振搖孵育過夜。次日，蛋白條帶在 TBST 中潤(rùn)洗 3 次，每次 15 min。二抗孵育 1 h后，TBST 潤(rùn)洗 3 次，每次 15 min。ECL 發(fā)色法顯影。以 GAPDH 作為內(nèi)參蛋白。Image-Pros Plus 6.0 計(jì)算 Western blot 條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1FIM-X13 抑制 AGS 細(xì)胞增殖

FIM-X13 作用 AGS 細(xì)胞 48 h 后，AGS 細(xì)胞增殖受到抑制，F(xiàn)IM-X13 對(duì) AGS 細(xì)胞增殖的抑制活性隨濃度升高而增強(qiáng)，其 IC50為（9.32 ± 0.70）μmol/L，強(qiáng)于雷帕霉素（14.68 ± 1.07）μmol/L 和依維莫司（14.66 ± 1.11）μmol/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）（圖1）。

2.2FIM-X13 誘導(dǎo) AGS 細(xì)胞凋亡

與空白對(duì)照組相比，F(xiàn)IM-X13 顯著誘導(dǎo) AGS細(xì)胞的凋亡（P ＜ 0.05），誘導(dǎo)能力隨濃度增加而增強(qiáng)。在相同濃度下，F(xiàn)IM-X13 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力顯著高于雷帕霉素和依維莫司，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）（圖2）。

圖1　FIM-X13、雷帕霉素和依維莫司對(duì) AGS 細(xì)胞增殖的抑制作用比較（與雷帕霉素或依維莫司相比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01）Figure 1　In comparison of FIM-X13 with rapamycin and everolimus on inhibiting cell proliferation in AGS cell line （#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01 vs rapamycin or everolimus）

2.3FIM-X13 阻滯 AGS 細(xì)胞周期于 G1期

FIM-X13 能夠阻滯 AGS 細(xì)胞周期于 G1期，其 G1期細(xì)胞百分比與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01），隨著 FIM-X13 濃度增大，其阻滯細(xì)胞周期的能力增強(qiáng)。在相同濃度下，F(xiàn)IM-X13 阻滯 AGS 細(xì)胞周期的能力強(qiáng)于雷帕霉素和依維莫司，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）（圖3）。

2.4FIM-X13 抑制 AGS 細(xì)胞 mTOR 及其下游蛋白的磷酸化

Western blot 檢測(cè)表明，F(xiàn)IM-X13 顯著抑制mTOR、p70S6K1、S6 和 4EBP1 的磷酸化（P ＜0.05）并具有濃度梯度效應(yīng)。與相同濃度的雷帕霉素和依維莫司相比，活性相近（P ＞ 0.05）（圖4）。上述結(jié)果表明，與雷帕霉素和依維莫司一樣，F(xiàn)IM-X13 能抑制 mTOR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的過度活化，為 mTOR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑。

圖2　FIM-X13、雷帕霉素和依維莫司誘導(dǎo) AGS 細(xì)胞凋亡的比較（與空白組相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與雷帕霉素或依維莫司相比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01）Figure 2　In comparison of FIM-X13 with rapamycin and everolimus on reducing cell apoptosis in AGS cell line （*P ＜0.05，**P ＜ 0.01 vs control；#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01 vs rapamycin or everolimus）

圖3　FIM-X13、雷帕霉素和依維莫司阻滯 AGS 細(xì)胞周期作用的比較（A：各細(xì)胞周期所占比例分析結(jié)果；B：G1期細(xì)胞百分比分析結(jié)果；與空白組相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與雷帕霉素或依維莫司相比，#P ＜ 0.05）Figure 3　In comparison of FIM-X13 with rapamycin and everolimus on cell cycle arresting AGS cell line （A： The comparision of percentage of different cell cycle； B： The analysis of G1percentages；*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01 vs control；#P ＜ 0.05 vs rapamycin or everolimus）

圖4　FIM-X13、雷帕霉素和依維莫司對(duì) AGS 細(xì)胞 mTOR 及其下游蛋白磷酸化抑制作用的比較（與空白組相比，**P ＜0.01）Figure 4　In comparison of FIM-X13 with rapamycin and everolimus on inhibiting the phosphorylation of mTOR and its downstream proteins in AGS cell line （**P ＜ 0.01 vs control）

3　討論

綜上所述，F(xiàn)IM-X13 具有很強(qiáng)的抑制胃癌細(xì)胞株 AGS 增殖的作用，抑制能力強(qiáng)于雷帕霉素和依維莫司。與雷帕霉素和依維莫司一樣，F(xiàn)IM-X13 通過抑制 mTOR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、誘導(dǎo) AGS 細(xì)胞凋亡、阻斷 AGS 細(xì)胞于 G1期等達(dá)到抑制 AGS細(xì)胞增殖的作用。提示 FIM-X13 作為 mTOR 抑制劑，在治療胃癌方面值得開展進(jìn)一步體內(nèi)外藥效研究。

含有三氮唑基團(tuán)的衍生物具有包括抗腫瘤在內(nèi)的多種生物學(xué)活性，一直是藥物研究的熱點(diǎn)。其原理是三氮唑五元芳香唑環(huán)上的 3 個(gè)氮原子很容易與生物體內(nèi)的各種酶和受體以非共價(jià)鍵相互作用。三氮唑衍生物的抗癌機(jī)制多樣，如 1，2，3-三氮唑衍生物抑制熱休克蛋白合成、抑制組氨酸去乙酰化酶活性、抑制微管聚合作用、抑制蛋白酪氨酸激酶活性等［12］，抑制芳香化酶活性的三氮唑衍生物來曲唑、阿那曲唑和伏氯唑已作為治療乳腺癌的藥物應(yīng)用于臨床。FIM-X13 為 1，2，3-三氮唑 C43-雷帕霉素，其對(duì) AGS 細(xì)胞增殖抑制能力強(qiáng)于雷帕霉素和依維莫司，說明 1，2，3-三氮唑駢合雷帕霉素增強(qiáng)了雷帕霉素的抗胃癌活性，其機(jī)制是否達(dá)到預(yù)期的三氮唑和 mTOR 抑制聯(lián)合發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步探討。本研究為雷帕霉素與三氮唑類化學(xué)半合成及雷帕霉素類 mTOR 抑制劑與三氮唑類藥物聯(lián)合治療胃癌提供借鑒。此外，從化學(xué)結(jié)構(gòu)分析，三氮唑的 3 個(gè)氮原子增加了化合物的極性，可能從藥代動(dòng)力學(xué)方面也比母核雷帕霉素有更好的表現(xiàn)。

PI3K/AKT/TSC/mTOR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，PI3K接受來自胰島素或胰島素樣生長(zhǎng)因子的信號(hào)，通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)磷酸化 AKT 的蘇氨酸 308 位點(diǎn)激活A(yù)KT，后者抑制了 TSC 從而激活 mTORC1［1］。mTORC1 上游任何激酶如 PI3K、AKT、TSC 基因的突變和缺失都促進(jìn) mTOR 信號(hào)途徑的活化，mTOR 通過對(duì)其下游 4EBP1 和 S6K1 的磷酸化激活了與核糖體發(fā)生、細(xì)胞增殖和代謝相關(guān)蛋白的翻譯，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移［3］。AGS 為PI3K 基因 PIK3CA 突變的胃癌細(xì)胞株細(xì)胞，PIK3CA 基因的突變使 PI3K 異常表達(dá)，造成AGS 細(xì)胞的 mTOR 信號(hào)途徑過度活化。繼手術(shù)、放化療后，針對(duì)癌癥發(fā)生、發(fā)展相關(guān)信號(hào)途徑關(guān)鍵激酶的靶向治療成為晚期腫瘤治療的重要手段，其中的小分子靶向藥物數(shù)量有限。因此，可通過其他胃癌株進(jìn)一步研究，以明確 FIM-X13是否是由PIK3CA 基因突變?cè)斐傻?mTOR 信號(hào)途徑過度激活的胃癌潛在治療藥物。

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Author Affiliations: Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China （YANG Dan， HUANG Jie）； Fujian Institute of Micbiology， Fuzhou 350007， China （YANG Dan， CHEN Xiao-ming， LI Kua-liang， XIE Li-jun， HUANG Jie）； Hangzhou HuaDong Medicine Group Pharmaceutical Research Institute Co. Ltd.， Hangzhou 310012， China （PAN Fu-sheng）

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):224-228

Preliminary study on effect and mechanism of a novel rapamycin containing triazole derivative FIM-X13 on gastric carcinoma AGS cell line

YANG Dan， CHEN Xiao-ming， LI Kua-liang， XIE Li-jun， PAN Fu-sheng， HUANG Jie

【Abstract】

ObjectiveOur purpose is to investigate the inhibitory effect and mechanism of a novel rapamycin containing triazole derivative FIM-X13 on gastric carcinoma as compared with rapamycin or everolimus separately.

MethodsThe proliferation of cancer cells was tested by sulforhodamine B assay. The apoptosis and cell cycle of cancer cells were individually analyzed by flow cytometry. The expressions of mTOR， p70S6K1， S6， 4EBP1 and their phosphorylation level were separately detected by Western blot.

ResultsFIM-X13 inhibited the proliferation of gastric carcinoma AGS cells in a dose-dependent manner with IC50value of （9.32 ± 0.70） μmol/L and the inhibitory effect was even more potent than that of rapamycin and everolimus. It also induced apoptosis and G1phase cell cycle arrested in AGS cells. In addition， FIM-X13 suppressed the phosphorylation level of mTOR and its downstream targets of 4EBP1， p70S6K1 and S6， which was consistent with rapamycin and everolimus.

ConclusionThe novel triazole-containing rapamycin derivate FIM-X13 exerts more potent effect on cell proliferation than rapamycin and everolimus do. Similar to rapamycin and everolimus， FIM-X13 significantly inhibits proliferation of gastric cancer cell， induces cell apoptosis and G1phase cell cycle arrest via blocking mTOR pathway. FIM-X13 may become a promising mTOR inhibitor candidate for the treatment gastric carcinoma.

【Key words】Stomach neoplasms；TOR serine-threonine kinases；Rapamycin triazole containing derivative

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.005

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81502935）；福建省屬工藝類科研院所基本科研專項(xiàng)（2015R1009-7）

通信作者：黃捷，Email：xlms2003@163.com

收稿日期：2015-12-21

Corresponding Author:HUANG Jie， Email： xlms2003@163.com