劉舒云，侯克東，鹿亮，黃靖香，袁玫，許文靜，盧世璧，郭全義

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人臍帶華通膠細(xì)胞外基質(zhì)源性軟骨組織工程支架的制備及相關(guān)研究

劉舒云，侯克東，鹿亮，黃靖香，袁玫，許文靜，盧世璧，郭全義

【摘要】

目的采用人臍帶華通膠細(xì)胞外基質(zhì)為材料制備軟骨組織工程支架，并對(duì)其性能進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

方法人臍帶去除外膜及動(dòng)、靜脈，通過(guò)機(jī)械粉碎、差速離心去細(xì)胞、冷凍干燥、紫外及化學(xué)交聯(lián)等方法將華通膠組織制備成三維多孔的軟骨組織工程支架，并通過(guò)組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)其成分保留情況；將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合至支架，光鏡及電鏡下觀(guān)察細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)狀況及基質(zhì)分泌情況，初步了解其生物相容性；將人臍帶去細(xì)胞華通膠支架植入兔背部皮下，通過(guò)組織化學(xué)及 CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞免疫熒光染色，了解其炎癥情況及免疫原性。

結(jié)果制備得到的人臍帶華通膠細(xì)胞外基質(zhì)源性支架為三維多孔支架，保留了華通膠中糖胺多糖和 II 型膠原等成分，糖胺多糖含量為 7.05%，總膠原含量為 22.5%；接種于支架上的細(xì)胞黏附于支架孔壁上，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，并有基質(zhì)分泌；在體試驗(yàn)未見(jiàn)明顯免疫反應(yīng)。

結(jié)論人臍帶華通膠細(xì)胞外基質(zhì)的成分與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)類(lèi)似，有利于細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)，無(wú)明顯免疫原性，是一種較有前景的軟骨組織工程支架材料。

【關(guān)鍵詞】華通膠；細(xì)胞外基質(zhì)；組織工程；支架（骨科）

www.cmbp.net.cn中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(3):200-205

作者單位：100853 北京，解放軍總醫(yī)院骨科研究所北京市再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/全軍戰(zhàn)創(chuàng)傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

軟骨損傷難以自我修復(fù)，傳統(tǒng)治療方法無(wú)法達(dá)到滿(mǎn)意療效。組織工程是近年來(lái)興起的修復(fù)缺損組織的方法，為治療軟骨缺損帶來(lái)了新的希望。組織工程包含三方面要素，即支架、種子細(xì)胞和細(xì)胞因子。目前支架材料主要包括兩大類(lèi)，即合成材料和天然材料，天然材料成分接近天然軟骨，細(xì)胞毒性小，生物相容性好。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)源的軟骨支架由于基質(zhì)成分及其比例與天然軟骨更為類(lèi)似，因此成為近年來(lái)眾多研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。但人源性軟骨細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)源有限，成為限制其廣泛研究和應(yīng)用的因素。

臍帶是連接母體和胎兒的組織，包含兩條動(dòng)脈和一條靜脈，周?chē)@著華通膠和臍帶外膜，胎兒分娩后即成為廢棄物。華通膠的生理功能是保護(hù)臍帶血管，防止其受外力擠壓，如子宮收縮、胎兒活動(dòng)等引起的血管受壓，從而保障正常的臍帶血運(yùn)［1-2］，該作用與關(guān)節(jié)軟骨緩沖受力、減少變形、損傷及摩擦的作用相似。另外，臍帶華通膠富含透明質(zhì)酸、硫酸化糖胺多糖及膠原等成分，與軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)成分類(lèi)似。此外，臍帶華通膠中無(wú)血管滋養(yǎng)管、神經(jīng)、淋巴等結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)特征也與軟骨類(lèi)似［3-9］，同時(shí)因其屬于分娩廢棄物，不存在倫理問(wèn)題，且來(lái)源豐富?；谏鲜鎏卣?，我們認(rèn)為臍帶華通膠可能是一種較好的軟骨組織工程支架材料的來(lái)源。本研究采用去細(xì)胞、凍干及交聯(lián)的方法制備出去細(xì)胞人臍帶華通膠軟骨組織工程用支架，并對(duì)其成分、結(jié)構(gòu)、細(xì)胞毒性以及對(duì)細(xì)胞行為的影響、皮下免疫反應(yīng)等進(jìn)行初步的研究。

1　材料和方法

1.1材料

正常足月妊娠新生兒臍帶由解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科提供；戊二醛、鋨酸、醋酸異戊酯、六甲基二硅胺烷（HMDS）、雙氧水、胰酶消化液、碳化二亞胺、甲苯胺藍(lán)、番紅花 O 染色所用試劑均為北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn)；鼠抗人 II 型膠原抗體、鼠抗人 I 型膠原抗體及鼠抗人 Aggrecan 抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗抗體購(gòu)自北京世安科興有限公司；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；胎牛血清購(gòu)自北京元亨金馬生物科技有限公司；小鼠抗兔 CD4 和 CD8 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó) Research Diagnostics 公司；熒光素 TRITC標(biāo)記抗小鼠 IgG 購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司；新西蘭大白兔 6 只購(gòu)自解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：SCXK（京 2007-0003），飼養(yǎng)于清潔普通環(huán)境中；羥脯氨酸測(cè)試盒購(gòu)自南京建成科技有限公司；S-520 型掃描電子顯微鏡為日本日立公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1支架制備于無(wú)菌條件下剝離臍帶外膜及血管組織，余下的華通膠組織用無(wú)菌蒸餾水沖洗，3% 雙氧水浸泡 30 min，加入無(wú)菌三蒸水在低溫下反復(fù)粉碎成華通膠勻漿。向勻漿中加入 10 倍體積三蒸水混勻，-20 ℃ 冷凍后于常溫融化，反復(fù) 3 ～4 次凍融，使殘余細(xì)胞破碎。將勻漿經(jīng) 2000 r/min離心 20 min。取上清加入 1% Triton X-100、0.25%胰蛋白酶、Tris-HCl 緩沖液，于 4 ℃ 條件下輕輕攪拌，洗脫 24 h 后，3000 r/min 離心 20 min。上清用 DNase 和 RNase 混合液于 37 ℃ 消化過(guò)夜，4 ℃、6000 r/min 條件下離心15 ～ 20 min。充分洗去細(xì)胞碎片和殘留物質(zhì)，至 pH 7.0，取上層勻漿，10 000 r/min、4 ℃ 條件下離心 40 min，收集沉淀，即為去細(xì)胞的納米級(jí)臍帶華通膠漿料。

將收集到的人臍帶華通膠漿料調(diào)整為 3% （W/V）混懸液，充分?jǐn)嚢杈鶆?，注入聚乙烯圓筒模具中，-20 ℃ 預(yù)凍 30 min，放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，48 h 后形成三維多孔海綿支架。將支架置于 258 nm 波長(zhǎng)紫外線(xiàn)照射下交聯(lián) 8 h，再于含 20 mmol/L N-羥基琥珀酰亞胺和 50 mmol/L 乙基-二甲基胺-丙基碳化二亞胺的 95%（V/V）乙醇溶液中 4 ℃ 下交聯(lián) 24 h。無(wú)菌 PBS 漂洗浸泡 2 h，三蒸水漂洗去除殘余交聯(lián)劑，再次凍干，密封袋保存，60Co 照射消毒，4 ℃ 條件下保存?zhèn)溆茫?0-12］。

1.2.2細(xì)胞復(fù)合支架支架于培養(yǎng)液中浸泡 20 min后置于 6 孔板中，人 BMSCs以 1 × 107個(gè)/ml 的密度接種至支架上，37 ℃ 孵育 2 h，待細(xì)胞黏附于支架后，加入完全培養(yǎng)液 2 ～ 3 ml/孔。于 37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 2 ～ 3 d，以光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)及黏附情況。

1.2.3組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色將人臍帶組織冰凍切片（10 μm）及華通膠漿料涂片室溫晾干，分別用 95% 酒精固定 10 min，室溫晾干，進(jìn)行 HE 和甲苯胺藍(lán)染色。免疫組化染色時(shí)，將固定、晾干的組織片于 3% 雙氧水中浸泡 10 min， 1 × PBS 緩沖液漂洗 3 次，5 min/次。免疫組化一抗（鼠抗人 II 型膠原、I 型膠原、Aggrecan 抗體）用 1 × PBS 緩沖液按 1∶200 比例稀釋?zhuān)沃辽w玻片上，4 ℃ 孵育過(guò)夜后，1 × PBS 緩沖液洗 3 次，5 min/次，室溫下二抗孵育 15 min，1 × PBS 緩沖液洗 3 次，5 min/次，DAB 顯色液室溫孵育 5 min，洗去多余顯色液，蘇木素染核 5 min，過(guò)鹽酸乙醇分化，水中浸泡 5 min，酒精系列脫水，二甲苯透明，樹(shù)脂封片后顯微鏡下觀(guān)察。

1.2.4糖胺多糖和總膠原含量檢測(cè)應(yīng)用二甲基亞甲藍(lán)（DMB）法，切取凍干華通膠細(xì)胞外基質(zhì)源性支架，稱(chēng)重，加入含有木瓜蛋白酶的裂解液進(jìn)行裂解，離心吸取上清，100 μl 裂解液加入 3 ml DMB顯色液，糖胺多糖中的硫酸軟骨素與二甲基亞甲藍(lán)帶正電染料結(jié)合，產(chǎn)生顏色，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。根據(jù)羥脯氨酸測(cè)試盒說(shuō)明，進(jìn)行顯色，紫外分光光度計(jì)測(cè)定羥脯氨酸含量，換算為總膠原蛋白含量（羥脯氨酸占膠原蛋白 13.4%）。

1.2.5電鏡觀(guān)察用鋒利刀片切取 10 mm2× 2 mm 大小樣品，1 × PBS 緩沖液清洗，依次進(jìn)行2.5% 戊二醛及 1% 鋨酸固定，1 × PBS 緩沖液清洗樣品，酒精梯度脫水（50%、75%、90%、100%），醋酸戊酯置換 40 min，六甲基二硅胺烷干燥，表面噴鍍導(dǎo)電金屬，掃描電鏡觀(guān)察。

1.2.6體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)取新西蘭大白兔 6 只，常規(guī)背部備皮、消毒，取正中切口長(zhǎng)約 7 cm，依次切開(kāi)皮膚、皮下組織。將大白兔隨機(jī)平均分為2 組：實(shí)驗(yàn)組在兔背部深筋膜與肌膜之間埋植大小為 0.8 cm × 0.5 cm 的脫細(xì)胞華通膠支架；對(duì)照組同法皮下埋植兔脫細(xì)胞軟骨支架。每只兔背部均設(shè)3 個(gè)埋植點(diǎn)，各埋植點(diǎn)間距約 3 cm。皮膚切口均用 3-0 細(xì)絲線(xiàn)縫合，術(shù)后分組飼養(yǎng)。分別在埋植后1、2、4 周時(shí)取支架以及周?chē)M織行 HE 染色及CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測(cè)，觀(guān)察炎癥反應(yīng)和細(xì)胞免疫情況［13］。

2　結(jié)果

2.1人臍帶華通膠成分檢測(cè)

組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)臍帶華通膠番紅花 O 染色、甲苯胺藍(lán)染色、II 型膠原、I 型膠原及 Aggrecan 免疫組化染色均呈陽(yáng)性（圖1），表明人臍帶華通膠中富含糖胺多糖、II 型膠原、I 型膠原和軟骨蛋白聚糖等物質(zhì)，基質(zhì)成分與軟骨類(lèi)似。

圖1　臍帶華通膠組織病理染色（A：足月健康人臍帶；B：番紅花 O 染色；C：甲苯胺藍(lán)染色；D：II 型膠原免疫組化染色；E：I 型膠原免疫組化染色；F：Aggrecan免疫組化染色）Figure 1　Histochemistry and immunochemistry staining of human umbilical cord Wharton’s jelly （A： Full-term healthy human umbilical cord； B： Safranine O staining； C： Toluidine blue staining； D： Type II collagen immunochemistry staining； E： Type I collagen immunochemistry staining； F： Aggrecan immunochemistry staining）

圖2　人臍帶華通膠及其細(xì)胞外基質(zhì)的觀(guān)察（A：剝?nèi)〉娜四殠A通膠大體觀(guān)察；B：去細(xì)胞漿料甲苯胺藍(lán)染色；C：去細(xì)胞漿料 II 型膠原免疫組化染色；D：去細(xì)胞漿料電鏡觀(guān)察）Figure 2　Observation of human umbilical cord Wharton’s jelly and its derived extracellular matrix （A： Macroview of the stripped-off human umbilical cord Wharton’s jelly； B： Toluidine blue staining of WJ-ECM； C： Type II collagen immunochemistry staining of WJ-ECM； D： SEM observation of WJ-ECM）

2.2去細(xì)胞華通膠支架的制備

所獲華通膠漿料經(jīng)電鏡觀(guān)察，顯示含大量膠原微絲及蛋白聚糖（圖2）。將漿料注入模具，通過(guò)冷凍干燥法成形，并進(jìn)行物理及化學(xué)交聯(lián)，所得支架為白色、多孔結(jié)構(gòu)，掃描電鏡觀(guān)察可見(jiàn)支架內(nèi)部孔隙相互連通，孔徑大小較均一，直徑多分布于200 μm 左右（圖3）。

2.3糖胺多糖和總膠原含量檢測(cè)

通過(guò) DMB 法檢測(cè)華通膠細(xì)胞外基質(zhì)源性支架的糖胺多糖含量為 7.05%，羥脯氨酸法檢測(cè)支架總膠原含量為 22.5%，表明該支架中保留了較多的糖胺多糖和膠原成分。

圖3　人臍帶華通膠細(xì)胞外基質(zhì)源性支架的大體觀(guān)察（A）和電鏡觀(guān)察（B）Figure 3　Macroview （A） and SEM observation （B） of human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix-derived scaffold

圖4　人 BMSCs 接種于人臍帶華通膠細(xì)胞外基質(zhì)源性支架 48 h 后的形態(tài)觀(guān)察（A、B：光鏡；C、D、E：電鏡）Figure 4　Observation of human BMSCs seeded in human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix-derived scaffold after 48 h （A， B： Light microscope； C， D， E： SEM ）

圖5　人臍帶華通膠細(xì)胞外基質(zhì)源性支架體內(nèi)免疫反應(yīng)（A ～ C：HE 染色；D ～ F： CD4+T 細(xì)胞免疫熒光染色；G ～ I：CD8+T細(xì)胞免疫熒光染色；紅色熒光為 CD4+/CD8+T 細(xì)胞，藍(lán)色熒光為 hoechst 33258 細(xì)胞核染色）Figure 5　Immunoreaction of human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix-derived scaffold in rabbit subcutaneous circumstance （A - C： HE staining； D - F： CD4+T cell immunofluorescence； G - I： CD8+T cell immunofluorescence； red fluorescence is CD4+/CD8+T cell； blue fluorescence is hoechst 33258 nucleus staining）

2.4細(xì)胞活性檢測(cè)

將人 BMSCs 以 1 × 107個(gè)/ml 的密度接種于華通膠細(xì)胞外基質(zhì)源性支架上，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48 ～72 h，光鏡下觀(guān)察可見(jiàn)細(xì)胞貼附于支架內(nèi)部，電子顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，并有基質(zhì)分泌（圖4）。

2.5細(xì)胞免疫反應(yīng)

術(shù)后 1 周去細(xì)胞華通膠支架無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，CD4+和 CD8+單克隆抗體免疫熒光染色陰性；術(shù)后 2 周時(shí)，見(jiàn)有一定量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以中性白細(xì)胞為主，散在數(shù)個(gè) CD4+T 淋巴細(xì)胞和CD8+T 淋巴細(xì)胞；術(shù)后 4 周時(shí)，去細(xì)胞華通膠支架有部分降解，且浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞減少（圖5）；對(duì)照組兔脫細(xì)胞軟骨支架及周?chē)癫夭课唤M織未見(jiàn)明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果表明，去細(xì)胞華通膠支架未誘發(fā)細(xì)胞免疫排斥，只有輕度的炎癥反應(yīng)。

3　討論

軟骨組織工程支架的制備材料主要包括合成高分子材料和天然材料兩大類(lèi)。合成高分子材料主要有聚羥基乙酸（PGA）、聚乳酸（PLA）及其共聚物（PLGA）等，它們雖然具有可控的強(qiáng)度、降解速度、微結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，但其降解產(chǎn)物均為酸性，不利于種植其上的軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，生物相容性不理想。另外，合成材料表面沒(méi)有天然材料所具有的特定的細(xì)胞識(shí)別信號(hào)，且親水性差，不利于軟骨細(xì)胞的黏附、增殖和基質(zhì)合成。天然材料主要有I 型膠原、殼聚糖、藻酸鹽、幾丁質(zhì)、纖維蛋白、透明質(zhì)酸，它們的優(yōu)點(diǎn)在于生物相容性好，且更易于細(xì)胞附著，但其與天然關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分仍存在較大差別，且缺乏軟骨細(xì)胞特定的細(xì)胞識(shí)別信號(hào)。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)源性支架是近年來(lái)出現(xiàn)的軟骨支架研究新方向，它具備了天然軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的成分和配比，能夠模擬天然的軟骨細(xì)胞微環(huán)境，利于軟骨細(xì)胞保持表型、細(xì)胞增殖和基質(zhì)合成，是一種富有前景的軟骨組織工程支架材料［2］。但目前軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要來(lái)源于尸體取材，材料來(lái)源存在較大限制，不利于其廣泛應(yīng)用。

臍帶華通膠細(xì)胞外基質(zhì)在成分組成及比例上與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)類(lèi)似，華通膠具有與軟骨相似的生理學(xué)功能［1-9］，缺乏血管和神經(jīng)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與軟骨類(lèi)似，并且其來(lái)源廣泛，不存在倫理學(xué)問(wèn)題，因此有望成為軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的替代材料，用于軟骨組織工程支架的制備。本研究通過(guò)粉碎、去細(xì)胞、差速離心、凍干、交聯(lián)等方法制備得到人臍帶華通膠細(xì)胞外基質(zhì)源性支架，掃描電鏡顯示支架內(nèi)部孔隙相互連通，孔徑范圍分布在 200 μm左右。組織化學(xué)及免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示支架的糖胺多糖、II 型膠原染色均為陽(yáng)性，定量結(jié)果也顯示經(jīng)去細(xì)胞等方法制備獲得的支架仍保留了華通膠細(xì)胞外基質(zhì)中的主要成分，并與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分類(lèi)似。光鏡及電鏡觀(guān)察顯示接種于支架內(nèi)的人 BMSCs貼附于支架孔隙內(nèi)壁，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，可分泌基質(zhì)。皮下植入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人臍帶華通膠細(xì)胞外基質(zhì)源性支架埋藏于兔背部皮下，未引起明顯免疫反應(yīng)。以上結(jié)果證明，臍帶華通膠細(xì)胞外基質(zhì)可用于制備軟骨組織工程支架，該支架具有與正常軟骨細(xì)胞外基質(zhì)類(lèi)似的組成成分，能夠給接種的種子細(xì)胞提供良好的生長(zhǎng)和分化的微環(huán)境，是一種具有廣闊應(yīng)用前景的軟骨組織工程支架。

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Author Affiliation: Institute of Othopaedics， Chinese PLA General Hospital， Beijing 100853， China

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):200-205

·協(xié)會(huì)之窗·

Preparation and its related study of the engineering scaffold from human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix-derived cartilage

LIU Shu-yun， HOU Ke-dong， LU Liang， HUANG Jing-xiang， YUAN Mei， XU Wen-jing， LU Shi-bi， GUO Quan-yi

【Abstract】

ObjectiveTo fabricate a novel scaffold of cartilage tissue engineering with human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix and assessed it’s function in vitro.

MethodsFull-term healthy human umbilical cords were collected in aseptic condition and the arteries and veins were removed. The remaining Wharton’s jelly was pulverized， centrifugated， lyophilized and cross-linked， and thus was fabricated into a three-dimensional porous scaffold for cartilage tissue engineering.

ResultsThe 3-D porous scaffold retained glycosaminoglycan and collagen content of human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix， as the glycosaminoglycan content accounted for 7.05% and total collagen accounted for 22.5%. The human bone marrow-derived mesenchymal stem cells adhered to the scaffold， and growed well. The human umbilical Wharton’s jelly extracellular matrix-derived scaffold did not evoke immune rejection in the subcutaneous implantation of rabbit backs.

ConclusionThe human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix has very similar chemical component with cartilage extracellular matrix. It benefits for cell adherence and proliferation， and does not evoke immune rejection in vivo， so we propose it to be an ideal material for cartilage tissue engineering.

【Key words】Wharton’s jelly；Extracellular matrix；Tissue engineering；Scaffold

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.002

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863 計(jì)劃）（2012AA020502、2015AA020303）；國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（21134004）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81472092）

通信作者：郭全義，Email：doctorguo_301@163.com

收稿日期：2016-02-18

Corresponding Author:GUO Quan-yi， Email： doctorguo_301@163.com