李必一，楊帆，李洋，王若雨，趙勇

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FSP1在小鼠巨噬細(xì)胞中的表達(dá)特征及其生物學(xué)意義

李必一，楊帆，李洋，王若雨，趙勇

【摘要】

目的探討 FSP1 在小鼠巨噬細(xì)胞中的表達(dá)特征及其在巨噬細(xì)胞功能的意義。

方法以 FSP1-GFP 小鼠作為研究對(duì)象，采用流式細(xì)胞染色檢測(cè) FSP1 在小鼠巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況；應(yīng)用多種細(xì)胞因子對(duì) FSP1-巨噬細(xì)胞進(jìn)行刺激，觀察 FSP1 的表達(dá)情況；應(yīng)用過氧化氫（H2O2）對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行氧化應(yīng)激誘導(dǎo)，并觀察其 FSP1 的表達(dá)情況及上清中 FSP1 的濃度；流式檢測(cè) FSP1-和 FSP1+的巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌情況及吞噬功能。

結(jié)果腹腔巨噬細(xì)胞和骨髓誘導(dǎo)來源的巨噬細(xì)胞均可被分為 FSP1+和 FSP1-兩群。隨著 H2O2刺激腹腔巨噬細(xì)胞時(shí)間延長，F(xiàn)SP1+巨噬細(xì)胞的比例下降，ELISA 檢測(cè)上清中的 FSP1 濃度增加；刺激 FSP1+和 FSP1-兩群巨噬細(xì)胞對(duì) LPS 誘導(dǎo)的 IL-6、IL-12、TNF-α 等促炎性細(xì)胞因子無明顯差異；FSP1-的腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞及乳膠微球的吞噬能力高于 FSP1+巨噬細(xì)胞。

結(jié)論依據(jù)巨噬細(xì)胞對(duì) FSP1 的表達(dá)可將巨噬細(xì)胞分為FSP1+和 FSP1-兩群。FSP1+巨噬細(xì)胞經(jīng) H2O2刺激分泌大量 FSP1 蛋白。這兩群巨噬細(xì)胞對(duì)促炎性細(xì)胞因子的分泌無明顯差異，但 FSP1-巨噬細(xì)胞的吞噬能力高于 FSP1+巨噬細(xì)胞。

【關(guān)鍵詞】鈣結(jié)合蛋白質(zhì)類；巨噬細(xì)胞；吞噬能力

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(3):236-241

作者單位：116001 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院腫瘤科（李必一、王若雨）；100101 北京，中國科學(xué)院動(dòng)物研究所膜生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（楊帆、李洋、趙勇）

成纖維細(xì)胞特異性蛋白（fibroblast-specific protein 1，F(xiàn)SP1）是屬于 S100 蛋白家族的一種與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的鈣結(jié)合蛋白，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)證實(shí)FSP1 鈣結(jié)合蛋白在多種惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌等轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，并與預(yù)后不良具有高度相關(guān)性［1-6］。近年來，F(xiàn)SP1 在免疫細(xì)胞中的表達(dá)及其生物學(xué)作用越發(fā)受到人們的關(guān)注，并且多項(xiàng)研究表明 FSP1 與多種自身免疫性疾病，如銀屑病、關(guān)節(jié)炎等密切相關(guān)［7-8］。最近研究結(jié)果表明，F(xiàn)SP1+成纖維細(xì)胞促進(jìn)胸腺上皮細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞成熟［9］。然而盡管有報(bào)道顯示 FSP1 蛋白在小鼠的發(fā)育期間對(duì)巨噬細(xì)胞的分化和功能有著重要的作用［10］，但是 FSP1 在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況以及其影響機(jī)制尚不清楚。本文主要研究 FSP1 在巨噬細(xì)胞的表達(dá)情況以及對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6 ～ 8 周齡 FSP1-GFP 小鼠，由中國科學(xué)院生物物理研究所秦志海研究組提供，所有 SPF 級(jí)小鼠均按照中國科學(xué)院動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)規(guī)定飼養(yǎng)于本所 SPF 級(jí) IVC 動(dòng)物房，所有實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格遵照國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用和管理?xiàng)l例進(jìn)行。

1.1.2試劑及抗體牛血清白蛋白（BSA）、PBS（粉末）和 anti-F4/80-PE、anti-CD11b-PE-Cy5、anti-IL-12-PE、anti-IL-6-PE、anti-TNF-α-PE 等抗體購自美國 BD 公司；重組小鼠細(xì)胞因子 M-CSF 購自美國 Pepro Tech 公司；LPS 購自美國 Sigma 公司；S100A4 ELISA 試劑盒購自美國 Cloud-Clone公司；熒光染料 PKH26、乳膠微球購自美國Sigma-Aldrich 公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)用 PBS 緩沖液沖洗小鼠腹腔取得腹腔灌洗液，將灌洗液 1700 r/min 離心5 min，用含 10% 胎牛血清及 100 U/ml 青霉素和0.1 mg/ml 鏈霉素的 DMEM 重懸并培養(yǎng)于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，靜置 2 h 后棄上清，底部貼壁細(xì)胞為巨噬細(xì)胞。取骨髓細(xì)胞培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清以及 100 U/ml 青霉素和 0.1 mg/ml 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，加巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）50 ng/ml 置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，分別于第 3、5、7 天更換培養(yǎng)液，底部貼壁細(xì)胞為巨噬細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞表面分子染色及流式細(xì)胞術(shù)分析取來自小鼠腹腔巨噬細(xì)胞以及骨髓誘導(dǎo)來源巨噬細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞懸液，使每管細(xì)胞總數(shù)為 5 × 105個(gè)/100 μl，每管加入各種抗體 10 μl，輕輕混勻，4 ℃ 避光，靜置 30 min。PBS 洗 3 次后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，應(yīng)用 FCS Express V3 軟件進(jìn)行分析。

1.2.3ELISA 實(shí)驗(yàn)ELISA 試驗(yàn)方法根據(jù)制造商的說明進(jìn)行操作。將 ELISA 板用含 5% BSA 的PBS 在室溫下預(yù)包被至少 1 h。再用 PBS 洗 3 遍后將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入預(yù)包被的 ELISA 板中，室溫下孵育 2 ～ 4 h。洗液洗 3 遍之后，在 30 ℃ 的條件下加入特異的細(xì)胞因子檢測(cè)抗體反應(yīng) 1 h，隨后加入 Avidin-HRP A，于 30 ℃ 反應(yīng) 1 h。在板中加入顯色劑，避光顯色 10 ～ 20 min 后用終止液終止反應(yīng)，在 450 nm 測(cè)定 OD 值。

1.2.4巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)將灌洗的腹腔細(xì)胞用完全 DMEM 培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至 2.5 × 106個(gè)/ml，以每孔 200 μl 加入 48 孔板，貼壁 2 h后用溫 PBS 洗去未貼壁細(xì)胞，再加入 100 μl 完全DMEM，再加入 100 μl 不同濃度的 PKH26 標(biāo)記的雞紅細(xì)胞（chicken red blood cell，cRBC）或直徑2 μm 帶有紅色熒光的乳膠微球，培育 2 h 后用溫育的 PBS 洗去未吞噬 cRBC 或乳膠微球，用冷PBS 吹下貼壁細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析巨噬細(xì)胞吞噬率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1FSP1 在巨噬細(xì)胞的表達(dá)情況

應(yīng)用 FSP1-GFP 報(bào)告基因小鼠觀察巨噬細(xì)胞中 FSP1 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，腹腔巨噬細(xì)胞約有 50% 細(xì)胞表達(dá) FSP1（圖1A）。應(yīng)用 M-CSF 誘導(dǎo)小鼠骨髓前體細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化，在誘導(dǎo)的3、5、7、9、11 d 分析巨噬細(xì)胞中 FSP1 的表達(dá)，其中約有 75% 表達(dá) FSP1-GFP（圖1B）。無論是腹腔來源還是骨髓來源的巨噬細(xì)胞都可以依據(jù) FSP1 的表達(dá)情況將其分為 FSP1+和 FSP1-兩亞群。

圖1　流式細(xì)胞儀檢測(cè) FSP1 在腹腔巨噬細(xì)胞（A）和骨髓來源巨噬細(xì)胞（B）的表達(dá)情況Figure 1　Expression of FSP1 on peritoneal macrophages （A） and bone marrow derived macrophages （B） detected by flow cytometry

2.2FSP1+巨噬細(xì)胞在氧化應(yīng)激刺激后可以釋放FSP1

應(yīng)用 H2O2（125 μmol/L）分別處理 CD11b+F4/80+巨噬細(xì)胞 0 min、20 min、40 min、1 h、3 h 之后流式檢測(cè) FSP1 的表達(dá)情況，結(jié)果表明 FSP1+巨噬細(xì)胞中 FSP1+的表達(dá)隨時(shí)間的延長而降低（圖2A、B），提示巨噬細(xì)胞中表達(dá)的 FSP1 可能分泌到胞外。ELISA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn) FSP1 在上清中的濃度確實(shí)隨時(shí)間的延長而增大（圖2C）。說明氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑可以刺激 FSP1+巨噬細(xì)胞釋放 FSP1蛋白。

圖2　氧化應(yīng)激誘導(dǎo) FSP1+巨噬細(xì)胞釋放 FSP1（A：H2O2處理巨噬細(xì)胞后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) FSP1 的表達(dá)；B：H2O2處理不同時(shí)間后 FSP1+巨噬細(xì)胞的比例；C：ELISA 檢測(cè)上清中 FSP1 的濃度）Figure 2　FSP1+macrophage subset can release FSP1 by oxidative stress induction （A： Expression of FSP1 on macrophages after oxidative stress induction by H2O2； B： Percentage of FSP1+macrophages induced by H2O2； C： Concentration of FSP1 in supernatant detected by ELISA）

2.3FSP1-巨噬細(xì)胞與 FSP1+巨噬細(xì)胞功能差異比較

為了研究 FSP1-和 FSP1+巨噬細(xì)胞在功能上的區(qū)別，檢測(cè)了其細(xì)胞因子的分泌水平，結(jié)果顯示腹腔巨噬細(xì)胞（圖3A，B）在 LPS 刺激下，IL-6、IL-12、TNF-α 表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異，熒光強(qiáng)度也沒有明顯差異。但是檢測(cè)巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞和乳膠微球的吞噬結(jié)果表明，F(xiàn)SP1-巨噬細(xì)胞的吞噬能力明顯高于 FSP1+巨噬細(xì)胞（圖4）。因此，F(xiàn)SP1-與 FSP1+巨噬細(xì)胞具有相似的炎性因子產(chǎn)生能力，但是 FSP1-巨噬細(xì)胞比 FSP1+巨噬細(xì)胞具有更強(qiáng)的吞噬功能。

3　討論

FSP1 是 S100 蛋白家族成員之一，作用于多種細(xì)胞，其生物功能主要集中在促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移方面。S100 蛋白家族只在脊椎動(dòng)物有表達(dá)且具有特異性的表達(dá)圖譜，主要由 20 多個(gè)功能不同的成員組成。S100 蛋白通過與多種靶向蛋白包括酶、細(xì)胞骨架蛋白、受體、轉(zhuǎn)錄因子和核酸等的相互作用來參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、Ca2+平衡、能量代謝、炎癥反應(yīng)、遷移和入侵［11］。有報(bào)道證實(shí)FSP1 在膀胱癌中有表達(dá)，而且可以作為判斷遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存活率的一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)［12］。在乳腺癌中，F(xiàn)SP1 是由腫瘤細(xì)胞或者基質(zhì)細(xì)胞所分泌，通過重塑細(xì)胞骨架和增加腫瘤細(xì)胞的黏附作用，下調(diào)促凋亡相關(guān)基因 Bax 的表達(dá)和血管生成抑制因子血小板反應(yīng)蛋白-1 基因的表達(dá)并且增加內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞 MMPs 的產(chǎn)生來促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移［13］。應(yīng)用 FSP1 阻斷抗體 6B12 可以有效抑制原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶內(nèi) T 細(xì)胞的招募，從而抑制了自發(fā)性乳腺癌模型的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移［14］。

圖3　FSP1-巨噬細(xì)胞與 FSP1+巨噬細(xì)胞具有相似的分泌細(xì)胞因子能力（A：流式分析 FSP1+和 FSP1-巨噬細(xì)胞 IL-12、IL-6、TNF-α 的表達(dá)情況；B：柱狀圖顯示 FSP1+和 FSP1-巨噬細(xì)胞 IL-12、IL-6、TNF-α 的表達(dá)情況）Figure 3　FSP1-macrophage subset has similar ability to release inflammatory cytokines compared to FSP1+subset （A： Expression of IL-12、IL-6、TNF-α on FSP1+macrophage and FSP1-macrophages detected by flow cytometry； B： Expression of IL-12， IL-6，TNF-α on FSP1+macrophage and FSP1-macrophages）

不僅在腫瘤組織中，在小鼠和大鼠的各個(gè)組織器官和細(xì)胞中也有 FSP1 的表達(dá)，如脾臟、胸腺、骨髓、T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞，尤其在腹腔巨噬細(xì)胞中表達(dá)量最高［15-16］。在自身免疫疾病如銀屑病中，F(xiàn)SP1 表達(dá)量升高可促進(jìn)疾病發(fā)展［7］。另外，F(xiàn)SP1 促進(jìn)關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細(xì)胞通過TLR4 信號(hào)通路的炎性應(yīng)答反應(yīng)［8］，而在葡萄球菌感染引起的關(guān)節(jié)炎模型中，F(xiàn)SP1 敲除導(dǎo)致細(xì)菌清除率增加，對(duì)于葡萄球菌導(dǎo)致的關(guān)節(jié)破壞的保護(hù)作用也有所增強(qiáng)［17］。有研究表明在肝臟受損后，F(xiàn)SP1可以作為一群具有炎性特征的巨噬細(xì)胞的標(biāo)記，其特點(diǎn)為高表達(dá) COX2、骨調(diào)素、多種細(xì)胞因子（TNF、IL-1β、IL-6、IL-10）、抑癌蛋白 M 以及多種趨化因子 CCL3、CCL4、CCL7、CXCL1、CXCL2、CXCL10，而下調(diào) MMP3 和 TIMP3 的表達(dá)［18］。類似的結(jié)果表明，肝臟中 FSP1 是由一群巨噬細(xì)胞所分泌并且在肝臟纖維化的進(jìn)展期通過激活肝星狀細(xì)胞來促進(jìn)肝臟纖維化的發(fā)展［19］。另外還有研究顯示，F(xiàn)SP1+成纖維細(xì)胞亞群對(duì)胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞的維持和再生也具有至關(guān)重要的作用，F(xiàn)SP1 敲除鼠的胸腺明顯減小且胸腺上皮細(xì)胞的數(shù)量也顯著降低［9］。眾所周知巨噬細(xì)胞是一種廣泛分布于全身組織的具有很強(qiáng)可塑性的天然免疫細(xì)胞，在天然免疫與適應(yīng)性免疫以及維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)中起到關(guān)鍵作用。相關(guān)報(bào)道顯示，F(xiàn)SP1 敲除后炎癥反應(yīng)對(duì)巨噬細(xì)胞的趨化作用受損，F(xiàn)SP1 在對(duì)巨噬細(xì)胞趨化到炎癥局部組織這一過程中起關(guān)鍵的調(diào)控作用［20］。而 FSP1 對(duì)巨噬細(xì)胞的其他方面的影響以及機(jī)制尚不清楚。因此，本文主要研究巨噬細(xì)胞中 FSP1 的表達(dá)情況，探討 FSP1 對(duì)天然免疫細(xì)胞的生物學(xué)作用。為了進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞的 FSP表達(dá)情況，應(yīng)用 FSP1-GFP 小鼠檢測(cè)了腹腔以及骨髓來源的巨噬細(xì)胞中 FSP1 的表達(dá)情況，研究發(fā)現(xiàn)可以依據(jù)巨噬細(xì)胞表達(dá) FSP1 的情況將其分為FSP1+以及 FSP1-兩群。FSP1+巨噬細(xì)胞經(jīng)過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑 H2O2刺激以后，隨時(shí)間的推移FSP1+巨噬細(xì)胞比例降低且可以分泌大量 FSP1蛋白。由于巨噬細(xì)胞可以分泌大量促炎性細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)過程，如 IL-6、IL-12、TNF-α 等［21］，因此我們對(duì)比檢測(cè)了 LPS 刺激后兩群巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子的分泌情況的差異，結(jié)果顯示兩群巨噬細(xì)胞產(chǎn)生 IL-6、IL-12、TNF-α 的比例并沒有顯著的變化。而巨噬細(xì)胞的另一重要功能是吞噬凋亡細(xì)胞及外來病原微生物，在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)及免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這兩群巨噬細(xì)胞的功能差異對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬功能進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示FSP1-巨噬細(xì)胞無論是吞噬雞紅細(xì)胞還是吞噬乳膠微球的能力均較 FSP1+巨噬細(xì)胞有所增強(qiáng)。提示 FSP1 可能抑制巨噬細(xì)胞的吞噬能力。

綜上所述，F(xiàn)SP1 在腹腔巨噬細(xì)胞和骨髓誘導(dǎo)來源的巨噬細(xì)胞中都有表達(dá)。氧化應(yīng)激條件下FSP1+巨噬細(xì)胞可以分泌大量的 FSP1 蛋白。在功能上，F(xiàn)SP1-巨噬細(xì)胞與 FSP1+巨噬細(xì)胞有著相似的分泌細(xì)胞因子的能力，但是吞噬能力強(qiáng)于 FSP1+巨噬細(xì)胞。FSP1 的表達(dá)可能會(huì)抑制巨噬細(xì)胞的吞噬能力。關(guān)于 FSP1 在巨噬細(xì)胞以及其他天然免疫細(xì)胞的表達(dá)情況以及其在腫瘤、炎癥性疾病和自身免疫性疾病中的生物學(xué)意義有待進(jìn)一步研究。

圖4　FSP1-巨噬細(xì)胞比 FSP1+巨噬細(xì)胞具有更強(qiáng)的吞噬能力（A：流式檢測(cè) FSP1-和 FSP1+腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的比例 PEM∶cRBC 為 1∶10；B：折線圖顯示腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力，*P ＜ 0.05；C：流式檢測(cè) FSP1-和 FSP1+腹腔巨噬細(xì)胞吞噬乳膠微球的比例 PEM∶Beads 為 1∶30；D：折線圖顯示腹腔巨噬細(xì)胞吞噬不同比例乳膠微球的能力，*P ＜0.05）Figure 4　FSP1-macrophage subset had higher phagocytosis ability compared to FSP1+subset（A： Percentage of chicken red blood cells phagocytic by FSP1+macrophage and FSP1-macrophages detected by flow cytometry. PEM∶cRBC 1∶10； B： Line chart shows chicken red blood cells phagocytic by peritoneal macrophages，*P ＜ 0.05； C： Percentage of beads phagocytic by FSP1+macrophage and FSP1-macrophages detected by flow cytometry PEM ： Beads 1∶30； D： Line chart shows beads phagocytic by peritoneal macrophages，*P ＜ 0.05）

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Author Affiliations: Department of Oncology， the Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University， Dalian 116001， China （LI Bi-yi， WANG Ruo-yu）； State Key Laboratory of Membrane Biology， Institute of Zoology， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100101， China （YANG Fan， LI Yang， ZHAO Yong）

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):236-241

Expression and function of FSP1 on macrophages

LI Bi-yi， YANG Fan， LI Yang， WANG Ruo-yu， ZHAO Yong

【Abstract】

ObjectiveTo determine the expression of fibroblast-specific protein 1 （FSP1） on macrophages and its roles on macrophage functions.

MethodsFSP1-GFP reporter mice was used in the present study. Macrophages from FSP1-GFP mice were treated with H2O2and the FSP1 expression was detected by flow cytometry and ELISA in protein level. The expressions of cytokines and the phagocytosis on FSP1-or FSP1+macrophages were assayed by flow cytometry.

ResultsPeritoneal macrophages and bone marrow-derived macrophages can be divided into either FSP1+or FSP1-subpopulations. The percentage of FSP1+macrophages was decreased and FSP1 in the supernatant was increased after oxidative stress induction by H2O2stimulation. There was no significant difference between FSP1-and FSP1+macrophages on the expressions of pro-inflammatory cytokines like IL-6， IL-12 and TNF-α after stimulated with LPS. The phagocytosis on chicken red blood cells and latex beads of FSP1-macrophages was higher than FSP1+macrophages.

ConclusionsMacrophages can be divided into two subpopulations depending on the expression of FSP1. FSP1+macrophages can secret abundant FSP1 protein after H2O2stimulation. There is no significant difference between the two subpopulations of macrophages on the secret of cytokines， but FSP1-macrophages own higher phagocytosis ability than FSP1+macrophages.

【Key words】Calcium-binding proteins；Macrophages；Phagocytosis

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.007

通信作者：王若雨，Email：wry1963@sohu.com

收稿日期：2015-12-25

Corresponding Author:WANG Ruo-yu， Email： wry1963@sohu.com