梁貴秋，陸春霞，吳婧婧，董桂清，周曉玲，黃正勇，沈蔚

（廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站，南寧市 530007）

利用臭氧誘變果酒酵母營養(yǎng)缺陷型突變株選育研究

梁貴秋，陸春霞，吳婧婧，董桂清，周曉玲，黃正勇，沈蔚

（廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站，南寧市 530007）

利用普通酒精酵母通過臭氧發(fā)生器產(chǎn)生臭氧誘變，誘變參數(shù)：臭氧濃度為15 mg/m3，時間為10 min；分離、純培養(yǎng)后篩選出一株的突變株YSS-03。此菌株最大特點(diǎn)是只能利用單糖為碳源發(fā)酵產(chǎn)酒精，且酒精耐性15%以上，是一株具有發(fā)酵制備功能酒前景的菌株。

臭氧；營養(yǎng)缺陷型；誘變；單糖；果酒酵母

生產(chǎn)果酒的方法主要是利用普通果酒酵母發(fā)酵果汁來釀造，發(fā)酵前在果汁中添加葡萄糖、蔗糖、蜂蜜等作為酵母產(chǎn)酒碳源[1]。為了使果酒獲得功能性或較好的口感，特別是益生果酒類在釀造時都會選擇添加低聚糖類，如低聚果糖，低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、蜂蜜等產(chǎn)品，但目前市場上這類產(chǎn)品中含有20%～45%葡萄糖等[2]，這些葡萄糖影響了產(chǎn)品的功能，甚至限制了產(chǎn)品使用人群，使得糖尿病患者對這類產(chǎn)品敬而遠(yuǎn)之。如果在發(fā)酵前添加益生元等低聚糖類原料，雖然解決了產(chǎn)酒碳源問題，但是由于普通果酒酵母對碳源沒有專一性，在利用益生元低聚糖中葡萄糖的同時，也把益生元低聚糖類水解成單糖并利用，不但產(chǎn)品功能性沒有得到體現(xiàn)，反而造成產(chǎn)品中殘?zhí)橇窟^高，影響產(chǎn)品的品質(zhì)。為了充分利用益生元低聚糖中的葡萄糖做碳源釀造產(chǎn)酒，同時完好保持益生元成分，本研究通過從果酒酵母原始菌株開始，利用臭氧誘變方法，獲得營養(yǎng)缺陷型突變菌株YSS-03，此突變株只能利用單糖為碳源發(fā)酵產(chǎn)酒且酒精耐受15%以上。通過YSS-03突變株發(fā)酵添加有益生元低聚糖的桑果汁制備桑果酒，發(fā)酵結(jié)果是益生元低聚糖中的單糖（主要是葡萄糖）幾乎全部被利用，而益生元低聚果糖成分保存率很高，發(fā)酵液中的酒精含量超過13%，獲得很好市場前景的功能性桑果發(fā)酵酒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 果酒酵母（安琪葡萄酒活性干酵母，內(nèi)部編號：YSS-01），通過市場采購、活化、分離篩選得原始菌種。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 蔗糖（國藥集團(tuán)，AR）；Na2HPO4（廣東汕頭市西隴化工廠，AR）；NaH2PO4（廣東汕頭市西隴化工廠，AR）；100%乙腈（廣東汕頭市西隴化工廠，色譜純）；超純水（自制）；無水葡萄糖（天津市大茂化學(xué)儀器供應(yīng)站，AR）；低聚果糖（市場采購，55型食品配料級，南寧縱聯(lián)科技有限公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 電子分析天平（梅特勒，AL-2004），精密數(shù)顯酸度計(jì)（上海電子儀器廠，PHS-25），HH-4電子恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司），臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠制造，ANKE-TGL-16G），高效液相色譜儀（日本島津公司，（LC-10A），色譜工作站 浙大N200），生化培養(yǎng)箱（SPX-160，常州），臭氧發(fā)生器（LT-D928，LITIAN/力天），臭氧濃度試紙（0～40 mg/m3，杭州陸恒生物科技有限公司），酒精計(jì)（DMA35，Anton Paar）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2.1.1 斜面培養(yǎng)基 葡萄糖25 g，蛋白胨12 g，酵母浸出粉12 g，硫酸鎂1.0 g，硝酸鈉1.5 g，KH2PO40.2 g，用蒸餾水溶解后定容到1 000 mL，瓊脂4.0 g/L，pH值為6.8～7.2，121℃，0.1 Mpa，滅菌30 min。接種酵母后置于28℃，培養(yǎng)30 h。

1.2.1.2 分離培養(yǎng)基 蔗糖20g，蛋白胨15 g，酵母浸出粉10 g，硫酸鎂1.0 g，硝酸鈉2.0 g，KH2PO40.2 g，用蒸餾水溶解后定容到1 000 mL，瓊脂4.0 g/L，于121℃，0.1 Mpa，滅菌30 min。接種酵母后生化培養(yǎng)箱30℃，培養(yǎng)48 h。

1.2.1.3 搖瓶培養(yǎng)基 葡萄糖35 g玉米漿粉15 g，豆餅粉20 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，KH2PO30.5 g，于121℃，0.1 Mpa，滅菌60 min，pH值為6.8～7.0，溫度為30℃，接種酵母后培養(yǎng)20～28 h.。

1.2.1.4 100 L擴(kuò)大培養(yǎng)基 葡萄糖35 g，玉米漿粉15 g，豆餅粉25 g，MgSO4·7H2O 1.2 g，KH2PO30.5 g，于121℃，0.1 Mpa，滅菌60 min。pH值為6.5～7.5，接種酵母后溫度為30℃，發(fā)酵20 h。

1.2.1.5 發(fā)酵桑果汁產(chǎn)酒（W%） 桑果汁用55型低聚果糖漿調(diào)固形物至250BX，瞬時滅菌溫度為120～135℃，5～8 s，降溫至28～30℃，接突變株酵母0.5%發(fā)酵144～196 h。

1.2.2 臭氧誘變

1.2.2.1 誘變原理[3]臭氧分子直接氧化細(xì)胞的遺傳物質(zhì)和分解RNA、DNA、蛋白質(zhì)、脂類、多糖分子等，破壞細(xì)胞內(nèi)各酶類系統(tǒng)，導(dǎo)致酵母的生長代謝受到破壞甚至細(xì)胞失活。臭氧分子與有機(jī)生物體發(fā)生各類復(fù)雜生化反應(yīng)，對蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等有機(jī)生物分子有較強(qiáng)的氧化反應(yīng)，將細(xì)胞代謝所產(chǎn)生的酸類物質(zhì)，瞬間氧化去羧基基團(tuán)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶物局部pH值升高，臭氧還具有較高的細(xì)胞因子表達(dá)特異性能。

1.2.2.2 誘變方法[4]培養(yǎng)30 h的斜面種置于密閉且臭氧滅菌25 min，放置3～5 h后的臭氧發(fā)生器倉內(nèi)，使菌株暴露于臭氧倉內(nèi)。啟動臭氧發(fā)生器，使臭氧不斷產(chǎn)生，待臭氧濃度升到一定值后，停止臭氧發(fā)生器，菌株在臭氧倉內(nèi)放置0～10 min，取出加入濃度為19.6 g/L磷酸緩沖液，重復(fù)沖洗多次，洗后緩沖液倒到滅菌好的三角瓶中蓋好，吸取1 mL菌液于100 mL的斜面培養(yǎng)基中，在28～30℃，生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～12 h，馬上轉(zhuǎn)到5～10℃保存10 h進(jìn)行生理穩(wěn)定，之后轉(zhuǎn)移至生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h。挑選單菌落于分離培養(yǎng)基中，然后置于28～30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～40 h，同時用斜面培養(yǎng)基對照試驗(yàn)。在分離培養(yǎng)基不能長出菌落，而在對照培養(yǎng)基中能長出的菌落的即為營養(yǎng)缺陷型突變株稱之為特異性單酵母。

1.2.3 目的菌株篩選 取純培養(yǎng)36～40 h后的菌種接于裝有100 mL搖瓶培養(yǎng)基（pH值為6.8）的250 mL的三角瓶中，置于溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床中搖28 h，從中取10 mL轉(zhuǎn)接到裝有100 mL發(fā)酵產(chǎn)酒培養(yǎng)基的500 mL的三角瓶中，28～30℃，轉(zhuǎn)速為220 r/min的搖床內(nèi)搖72～96 h。先用100目濾布過濾，濾液于8 000 r/min離心機(jī)上離心5 min，取上清液并測定上清液的酒精度及用色譜測定上清液中的各種糖分含量，選出目的菌株。

1.2.4 發(fā)酵力測定 以55型低聚果糖為反應(yīng)底物，調(diào)節(jié)至可溶性固形物含量取100 mL，接種量為5%（V/V），于30℃恒溫?fù)u床中，轉(zhuǎn)速220 r/min，反應(yīng)2 h，取出置于100℃水浴5 min滅活酵母菌。8 000 r/min離心5 min，取上清液，用高效液相檢測各糖分含量，計(jì)算消耗葡萄糖量。在上述條件下，每分鐘消耗1 μmol葡萄糖所需酵母菌體的量為一個發(fā)酵力單位（U）。

注：X表示發(fā)酵力單位，活力單位為U/g；25表示 25%反應(yīng)底物溶液100 mL的總糖，單位為g；G0表示反應(yīng)前葡萄糖的百分含量（%）；G1表示反應(yīng)后葡萄糖的百分含量（%）；0.18表示 1微摩葡萄糖=0.18 mg；t表示反應(yīng)時間，單位為min；m表示用酵母菌量，單位為g。

1.2.5 平均增殖力測定 按搖瓶培養(yǎng)基配制250 mL，取100 mL，接種量為5%（V/V），于30℃恒溫?fù)u床中，轉(zhuǎn)速220 r/min，反應(yīng)4 h取出置于100℃水浴5 min滅活酵母菌，8 000 r/min離心5 min去上清液后稱重量，以接種前為空白對照。在上述條件下，每h增加的重量為平均增殖力單位（mg/h）。

注：式2中，G表示平均增殖力，g0單位為mg/h；g1表示空白試樣的重量，單位為mg；表示反應(yīng)后試樣重量，h單位為mg；表示試樣反應(yīng)時間，單位為小時（h）。

1.2.6 酒精度測定 酒精度的測定用酒精計(jì)[5]法。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變臭氧濃度的選擇

臭氧發(fā)生器所產(chǎn)生臭氧濃度在半衰期內(nèi)濃度隨時間上升，但到半衰期后隨臭氧分子分解，系統(tǒng)達(dá)到平衡。試驗(yàn)所用的設(shè)備所產(chǎn)生臭氧在倉內(nèi)設(shè)定濃度最大值為35 mg/m3，通過測定臭氧濃度與時間曲線推算得誘變時間。本試驗(yàn)臭氧濃度為0.0 mg/L，5 mg/m3，10 mg/m3，15 mg/m3，20 mg/m3，25 mg/m3，30 mg/m3，35 mg/m3，結(jié)果如圖1。

圖1 臭氧濃度對致死率影響

圖1中濃度為15 mg/m3時，致死率為92%，隨濃度升高至20 mg/m3致死率已接達(dá)到98%，所以選用臭氧濃度為20 mg/m3為誘變條件誘變出發(fā)菌株YSS-01，此臭氧濃度對應(yīng)時間為8 min。

2.2 菌株傳代穩(wěn)定性

通過誘變后，斜面培養(yǎng)篩選出突變株為YSS-02，在分離培養(yǎng)基選出營養(yǎng)缺陷型突變株YSS-03，將兩菌株進(jìn)行傳代穩(wěn)定性驗(yàn)證，通過發(fā)酵，測定發(fā)酵活力以考察其發(fā)酵的穩(wěn)定性，結(jié)果如表1。

表1 營養(yǎng)缺陷型YSS-03穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果

從表1可以看出，第1代258 U/g，第5代253 U/g，YSS-03發(fā)酵力比較穩(wěn)定，第0代與第5代相差只有2.5%左右，說明此營養(yǎng)缺陷型突變株是穩(wěn)定的，并以YSS-03進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酒研究。

2.3 誘變前后產(chǎn)乙醇對比

在1 000 mL桑果汁中用葡萄糖調(diào)節(jié)可溶性固形物至280BX，100℃水浴60 min冷卻至28～30℃，分別接2.5%原始種YSS-01和營養(yǎng)缺陷型YSS-03，發(fā)酵48 h。分別連續(xù)試驗(yàn)10批次。測定批次發(fā)酵液的酒精度（表2）。從表中可以看出兩菌株產(chǎn)酒能力非常穩(wěn)定，都在13%～16%之間。10批次的平均產(chǎn)酒分別為:菌株YSS-01為14%，營養(yǎng)缺陷型菌株YSS-03為14.5%?？梢钥闯稣T變前與誘變后的菌株產(chǎn)酒能力相差不大，誘變后得到的營養(yǎng)缺陷型菌株產(chǎn)酒能力稍有提升。

表2 菌株產(chǎn)酒能力對比

2.4 營養(yǎng)缺陷型突變株增殖力

將25 mL搖瓶培養(yǎng)果酒酵母接到裝有500 mL搖瓶液體培養(yǎng)基的1 000 mL三角瓶中，置于30℃，220 r／min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)36 h，每4 h稱量一次，測定增殖力結(jié)果見圖2。營養(yǎng)缺陷型果酒酵母的增殖力從開始至20 h一直在上升，但從16 h至20 h增殖相當(dāng)緩慢，從20 h后增殖力開始加速下降，至36 h時的增殖力只有最高峰的一半左右。由圖2可見生長對數(shù)期應(yīng)在8～16 h之間。

圖2 培養(yǎng)時間對營養(yǎng)缺陷型果酒酵母增殖力的影響

2.5 營養(yǎng)缺陷型突變株對單糖特異性情況

低聚果糖產(chǎn)品組分中含有葡萄糖、果糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等混合物。調(diào)節(jié)低聚果糖液至250BX，取200 mL，接YSS-03菌種5%（V/V）置于30℃，220 r/min的恒溫床反應(yīng)30 h，取出置于100℃水浴滅活10 min。用高效液相色譜檢測反應(yīng)前后的各糖分變化（圖3和圖4）。從圖3中明顯看到反應(yīng)前果糖和葡萄糖含量很高，反應(yīng)后的圖4中可以看出果糖和葡萄糖含量已經(jīng)很少，而從圖4峰面積上看其它糖分含量升高了，是因?yàn)槠咸烟呛凸且呀?jīng)被YSS-03消耗，而其它糖分不被消耗或消耗極少。因此對比說明YSS-03具有單糖特異性。

圖3 反應(yīng)前各糖含量譜圖

圖4 反應(yīng)后各糖含量譜圖

2.6 YSS-03酒精耐受性

2 500 mL桑果汁用55型低聚果糖調(diào)節(jié)至固形物含量為250BX，分別取200 mL，用95%食用乙醇分別調(diào)節(jié)乙醇濃度為10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%等11個濃度梯度，接種量為5%（V/V）于25℃～30℃恒溫?fù)u床中，轉(zhuǎn)速220 r/min，反應(yīng)24 h，測定發(fā)酵力（圖5），結(jié)果顯示，YSS-03最初發(fā)酵力在260U/g左右，由圖5看出，乙醇濃度10%時，對YSS-03菌株已經(jīng)有抑制作用，升至濃度16%只有50%左右的發(fā)酵力，濃度17%時發(fā)酵力急劇下降，至20%時發(fā)酵力幾乎完全被抑制。所以YSS-03的酒精耐受在16%～17%之間。

圖5 YSS-03對酒精耐受性情況

2.7 溫度對YSS-03發(fā)酵影響

取5 000 mL桑果汁用55型低聚果糖調(diào)節(jié)至固形物含量為250BX，分別取200 mL，接種量為5%（V/V），于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃恒溫?fù)u床中，轉(zhuǎn)速220 r/min，反應(yīng)40 h，發(fā)酵過程補(bǔ)加兩次固形物為250BX的55型低聚果糖。取置于100℃水浴5 min滅活酵母菌。分別測定發(fā)酵液中的發(fā)酵活力和酒精度（圖6）。

由圖6看出發(fā)酵力和酒精濃度都從開始就上升，發(fā)酵力從約90 U/g升到25℃接近220 U/g，升至260 U/g為最高點(diǎn)，此時溫度約30℃，之后隨溫度升高逐漸下降，到45℃時，發(fā)酵力小于90 U/g。而酒精濃度從起始2%升到最高濃度15%，此時溫度約25℃，之后隨溫度升高逐漸下降，降到30℃酒精濃度已經(jīng)降到約13%。發(fā)酵力和酒精濃度最高點(diǎn)不同，說明最佳發(fā)酵力和最佳產(chǎn)酒溫度不在同一溫度。溫度在25～30℃，發(fā)酵力在上升階段，但上升速度已經(jīng)減緩，而產(chǎn)酒能力在這溫度區(qū)間已經(jīng)從最高點(diǎn)下降。通過綜合各種因素，選25～30℃為發(fā)酵控制溫度。

圖6 溫度對發(fā)酵力和產(chǎn)酒影響

2.8 pH值對發(fā)酵進(jìn)程影響

2 500 mL桑果汁用55型低聚果糖調(diào)節(jié)至固形物含量為250BX，分別取200mL，用鹽酸和碳酸氫鈉分別調(diào)節(jié) pH值為 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5等10個梯度，接種量為5%（V/V），于25℃～30℃恒溫?fù)u床中，轉(zhuǎn)速220 r/min，反應(yīng)40 h，發(fā)酵過程補(bǔ)加兩次固形物為250BX的55型低聚果糖。取出于100℃水浴 5 min滅活酵母菌。分別測定發(fā)酵液中的酒精濃度和發(fā)酵活力（圖7）。從圖7中可以看出，pH值較低時對發(fā)酵力和產(chǎn)酒能力都有抑制作用，隨pH值的上升發(fā)酵力和產(chǎn)酒能力也上升，pH值升至5.5時者都接近最高值；pH值再上升，發(fā)酵力和產(chǎn)酒能力反而下降，但發(fā)酵力下降較緩慢，而產(chǎn)酒能力下降較快，說明產(chǎn)酒能力對pH值更敏感。通過圖7可以看出最合適發(fā)酵得pH值為5.0～5.5。

圖7 pH值對發(fā)酵影響

3 討論

3.1 營養(yǎng)缺陷型酵母發(fā)酵參數(shù)的確定

通過臭氧誘變獲得營養(yǎng)缺陷型的果酒酵母，其對單糖具有良好的特異性，保持原有產(chǎn)酒能力，酒精耐受16%以上。并初步確定了酵母菌株的最佳發(fā)酵條件：溫度為25～30℃，pH值為5.0～5.5，生長對數(shù)期在8～16 h。

3.2 營養(yǎng)缺陷型果酒酵母工業(yè)應(yīng)用研究及推廣應(yīng)用

通過實(shí)驗(yàn)獲得具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值株?duì)I養(yǎng)缺陷型果酒酵母，并在功能性桑果酒制備上建立了應(yīng)用示范中試基地。下一步將重點(diǎn)開展菌株工業(yè)放大發(fā)酵試驗(yàn)，建立相關(guān)發(fā)酵參數(shù)；并對YYS-03增殖細(xì)胞進(jìn)行工業(yè)固定化研究，以提高釀酒應(yīng)用次數(shù)，降低工業(yè)化應(yīng)用成本。同時，探索把此菌株推廣至更多功能性果酒如葡萄酒紅酒、火龍果酒、芒果果酒、香蕉果酒等應(yīng)用上；此外，還將重點(diǎn)研究此菌株的特性如酵母粘性、生長特性等性質(zhì)。

［1］馬兆瑞，祝戰(zhàn)斌，張坐省，等.不同加糖方式和加糖量對蘋果酒風(fēng)味影響[J].釀酒，2003，30（4）:89-90.

［2］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.低聚果糖國家標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

［3］楊家蕾，董全 .臭氧殺菌技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]，食品工業(yè)科技.2009，30（4）：353-359.

［4］米運(yùn)宏，梁智，藍(lán)伯廣，等.臭氧誘變米曲霉產(chǎn)專用制備高純度低聚果糖酶突變菌株[C].中國淀粉工業(yè)協(xié)會糖醇專業(yè)委員會.五屆四次會員大會論文集.南京，2015:105-112.

［5］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.果酒通用分析方法GB/T15038-2006[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

S88；

A；

1006-1657（2016）01-0032-5

］2015-10-25；

2016-01-20

信息］梁貴秋（1975—），女，碩士研究生，高級農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)師，主要從事蠶桑資源綜合利用研發(fā)工作。E-mail:liangguiqiu0816@163.com