郭吉利，韓雪蕾，李素雅，呂 剛，喬瑞敏，任廣志，李新建（.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 45000；.河南省新大牧業(yè)有限公司，鄭州 450000）

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豫南黑豬及其雜交后代豬H-FABP基因的遺傳變異研究

郭吉利1，韓雪蕾1，李素雅2，呂 剛1，喬瑞敏1，任廣志1，李新建*
（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002；2.河南省新大牧業(yè)有限公司，鄭州 450000）

摘 要：本研究以60頭豫南黑豬、30頭巴×豫豬、27頭杜×豫豬、40頭豫×蘇豬為研究對(duì)象，采用PCR-RFLP方法檢測(cè)豬心臟脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）基因的5-UTR（Hinf I）和內(nèi)含子2上（HaeIII、MspI和Hinf I*）的4個(gè)SNP位點(diǎn)在試驗(yàn)群體中的分布，旨在研究H-FABP基因在豫南黑豬及其雜交后代豬中的遺傳變異。結(jié)果顯示，5-UTR突變位點(diǎn)在4個(gè)試驗(yàn)群體中均表現(xiàn)中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），等位基因H的頻率分別為0.83，0.33，0.70和0.61；除巴豫豬群體外，其余3個(gè)試驗(yàn)群體的基因頻率和基因型頻率均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）；內(nèi)含子2上的3個(gè)突變位點(diǎn)處于連鎖平衡狀態(tài)，在4個(gè)群體中的顯性等位基因頻率分別為0.32、0.58、0.45和0.50，除豫南黑豬外，其余試驗(yàn)組群體均表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）。本研究通過(guò)對(duì)H-FABP基因的多態(tài)位點(diǎn)在試驗(yàn)群體中的遺傳變異研究，進(jìn)一步揭示了H-FABP基因在不同群體中的遺傳規(guī)律，為下一步通過(guò)對(duì)H-FABP基因的選擇加快群體的選育提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豫南黑豬；雜交后代豬；H-FABP基因；PCR-RFLP法

近年來(lái)，隨著人們生活水平的不斷提高，豬的肉質(zhì)問(wèn)題已經(jīng)引起了生產(chǎn)者和消費(fèi)者的重視。肌內(nèi)脂肪（Intramuscular fat，IMF）含量是影響豬肉品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，與豬肉的多汁性、嫩度和風(fēng)味直接相關(guān)［1-4］，一般認(rèn)為2%～3%的IMF含量可以產(chǎn)生理想的口感［5］，但由于近年來(lái)過(guò)度地追求高瘦肉率，導(dǎo)致IMF含量降至1%～1.5%［6］，嚴(yán)重影響了肉質(zhì)風(fēng)味。IMF含量作為肉質(zhì)性狀的一個(gè)重要指標(biāo)，不能在活體準(zhǔn)確地測(cè)量，必須在豬只達(dá)到一定體重后才能通過(guò)屠宰取樣，代價(jià)巨大且周期漫長(zhǎng)。國(guó)外育種者研究發(fā)現(xiàn)，IMF含量具有較高的遺傳力（0.6），因此，利用分子標(biāo)記輔助選擇是最有效的方法［7］。豬心臟脂肪酸結(jié)合蛋白（Heart Fatty Acid-binding Protein，H-FABP）基因?qū)儆贔ABP家族，主要在心肌、骨骼肌和乳腺中表達(dá)，其主要作用是參與胞內(nèi)脂肪酸的攝取和運(yùn)輸，可將脂肪酸從細(xì)胞膜上運(yùn)到脂肪酸氧化和甘油三酯及磷脂的合成位置［8］。豬H-FABP基因定位于6號(hào)染色體上，前人研究發(fā)現(xiàn)在5’-UTR 和Intron2分別存在Hinf I和HaeIII、MspI和Hinf I*4個(gè)酶切多態(tài)性位點(diǎn)［9］。眾多研究表明，H-FABP基因的遺傳變異是影響IMF含量的主要因素之一［10-15］，因此被認(rèn)為是影響豬IMF的重要候選基因。

豫南黑豬是以河南省優(yōu)秀地方品種淮南豬為母本，美系杜洛克為父本歷時(shí)10余年培育出的一個(gè)耐粗飼的瘦肉型新品種，具有繁殖性能優(yōu)良、胴體瘦肉率高、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)，IMF含量高達(dá)4.11%［16，17］。本研究為了利用豫南黑豬的優(yōu)良遺傳特點(diǎn)，在雜交測(cè)定的基礎(chǔ)上，對(duì)豫南黑豬及其雜交后代群體中H-FABP基因的Hinf I和HaeIII、MspI、Hinf I*4個(gè)酶切遺傳變異進(jìn)行檢測(cè)與分析，為H-FABP基因的分子標(biāo)記法進(jìn)一步在豫南黑豬選育過(guò)程中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)群體包括豫南黑豬60頭、巴克夏×豫南黑豬雜交后代30頭、豫南黑豬×蘇太豬雜交后代40頭、杜洛克×豫南黑豬雜交后代27頭，總計(jì)157頭，全部來(lái)自河南省豫南黑豬育種中心。采集耳組織樣，放入含有70%酒精的EP管，采用酚仿抽提方法提取基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 H-FABP基因的PCR擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)［9］設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，如表1所示。以試驗(yàn)豬基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增總體積均為15 μL，其中雙蒸水5.8 μL，上下游引物各0.6 μL，TaqMix 7.5 μL，DNA模板0.5 μL，瞬時(shí)離心混勻。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，（61 ℃，53 ℃）退火45 s，72 ℃延伸2 min，33個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 酶切反應(yīng)

PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)之后，進(jìn)行酶切?？偡磻?yīng)體系：總體積為15 μL，其中內(nèi)切酶0.5 μL （12 U/μL），10×Buffer 1 μL，PCR產(chǎn)物5 μL，ddH2O 8.5 μL，混勻后37 ℃水浴酶切30 min，然后用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，根據(jù)各引物片段大小電泳30～60 min，在紫外燈下觀察結(jié)果并分型，并用凝膠成像分析系統(tǒng)拍攝成像。隨后挑選不同基因型個(gè)體送交生工生物工程（北京）有限公司，以確證分型結(jié)果。

表1 SNP擴(kuò)增的引物序列

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel進(jìn)行初步處理后，采用SPSS17.0對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，結(jié)果采用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 H-FABP基因SNP位點(diǎn)PCR擴(kuò)增結(jié)果

H-FABP基因的5’- UTR和Intron2中的4個(gè)SNP位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)（見(jiàn)圖1和2）。PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段與目的片段大小一致，條帶清晰，可以直接進(jìn)行下一步的酶切試驗(yàn)。

2.2 H-FABP基因SNP位點(diǎn)PCRRFLP分型及測(cè)序

圖1 H-FABP基因的693 bp擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 H-FABP基因的816 bp擴(kuò)增產(chǎn)物

PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)后，用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，Alpha凝膠成像系統(tǒng)照相并進(jìn)行基因分型，結(jié)果如圖3～圖6所示。其中Hinf I-RFLP位點(diǎn)擴(kuò)增片段全長(zhǎng)693 bp，存在4個(gè)Hinf I酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生339、172、98、59和25 bp 5個(gè)片段，由于存在一個(gè)因T/C突變而產(chǎn)生的Hinf I酶切位點(diǎn)，當(dāng)該位點(diǎn)為C時(shí)酶切位點(diǎn)消失，172 bp和59 bp片段合并產(chǎn)生231 bp的片段，從而得到3種基因型，分別定義為HH、Hh和hh基因型（見(jiàn)圖3）。

圖3 豬H-FABP基因Hinf I-RFLP位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切多態(tài)電泳圖

如圖4所示，HaeIII-RFLP位點(diǎn)擴(kuò)增片段全長(zhǎng)816 bp，存在3 HaeIII個(gè)酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生405、278、117和16 bp 4個(gè)片段，其中存在一個(gè)由于G/ C突變而產(chǎn)生的HaeIII酶切位點(diǎn)，當(dāng)此位點(diǎn)為C等位基因時(shí)，酶切位點(diǎn)消失，278 bp和405 bp片段合并產(chǎn)生683 bp的片段，從而得到3種基因型，分別定義為DD、Dd和dd基因型。

圖4 豬H-FABP基因HaeIII-RFLP位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切多態(tài)電泳圖

如圖5所示，MspI-RFLP位點(diǎn)擴(kuò)增片段全長(zhǎng)816 bp，在該片段750 bp處，存在一個(gè)由于T/C突變而產(chǎn)生的MspI酶切位點(diǎn)，酶切后片段大小分別為750 bp和66 bp，定義為AA基因型，當(dāng)此酶切位點(diǎn)消失時(shí)為816 bp，定義為aa基因型。

圖5 豬H-FABP基因MspI-RFLP位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切多態(tài)電泳圖

如圖6所示，Hinf I*-RFLP位點(diǎn)擴(kuò)增片段全長(zhǎng)816 bp，此片段中存在3個(gè)Hinf I*酶切位點(diǎn)，分別產(chǎn)生527、217、47和32 bp 4個(gè)片段，其中有一個(gè)Hinf I*酶切位點(diǎn)是由于在Intron2 的1 970 bp處發(fā)生C/T突變而產(chǎn)生，因此當(dāng)此酶切位點(diǎn)消失時(shí)，217 bp和47 bp片段合并產(chǎn)生264 bp的片段，從而得到3種基因型，分別為BB型、Bb型和bb型。

圖6 豬H-FABP基因Hinf I*-RFLP位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切多態(tài)電泳圖

2.3 試驗(yàn)群體H-FABP基因SNP的遺傳特征分析

對(duì)H-FABP基因的4個(gè)SNP位點(diǎn)在試驗(yàn)群體中進(jìn)行基因頻率和基因型頻率分析，結(jié)果如表2所示， 第二內(nèi)含子上的HaeIII-RFLP、MspI-RFLP和Hinf I*-RFLP3個(gè)突變位點(diǎn)的分型結(jié)果一致，并處于連鎖平衡狀態(tài)。

其中HaeIII-RFLP位點(diǎn)存在3種基因型分別為DD、Dd和dd，等位基因d是優(yōu)勢(shì)等位基因，群體中χ2值0.37（＜χ=5.99），差異不顯著（P＞0.05）；Hinf I*-RFLP位點(diǎn)有3種基因型HH、Hh和hh， H等位基因在群體中為優(yōu)勢(shì)等位基因，群體中χ2值1.33（＜χ=5.99）因此差異不顯著，群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；上述2個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量分別為0.35、0.37都屬于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），雜合度分別為1.81、1.97（表2）。

表2 H-FABP基因5’-UTR及第二內(nèi)含子SNP基因型、基因頻率及遺傳多態(tài)指標(biāo)

表3 Hinf I-RFLP位點(diǎn)在豫南黑豬及其雜交后代中基因型頻率分布

如表3顯示，H-FABP基因 5’-UTR上的Hinf I-RFLP位點(diǎn)的基因型頻率在杜×豫豬、豫×蘇豬和豫南黑豬中χ2值分別為0.55、1.11 和2.40（＜χ=5.99），差異不顯著（P＞0.05），群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；巴×豫豬χ2值為7.50（＞χ=5.99），差異顯著（P＜0.05），群體處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)；豫南黑豬群體多態(tài)信息含量為0.24（PIC＜0.25），屬于低度多態(tài)；雜合度為0.28。

表4 HaeIII-RFLP位點(diǎn)在豫南黑豬及其雜交后代中基因型頻率分布

表4顯示，HaeIII-RFLP位點(diǎn)基因型頻率在杜×豫豬、豫×蘇豬、巴×豫豬和豫南黑豬中χ2值分別為0.33、0.49、0.35和1.89，均小于χ=5.99，因此差異不顯著（P＞0.05），群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。豫南黑豬群體多態(tài)信息含量為0.34，屬于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），雜合度為0.44。

3 討論

前人研究報(bào)道，位于H-FABP基因的5’-UTR的Hinf I酶切多態(tài)位點(diǎn)，是通過(guò)影響H-FABP基因的表達(dá)進(jìn)而影響IMF的含量［11］。在本研究中，該位點(diǎn)豫南黑豬、豫×蘇和杜×豫雜交群體中H等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因，與Gerberns（1997）等［9］研究在杜洛克群體中的研究結(jié)果相一致。Gerbens（1999）等［18］進(jìn)一步分析了H-FABP基因在杜洛克群體中與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示Hinf I-RFLP位點(diǎn)HH型個(gè)體的肌內(nèi)脂肪（IMF）含量高于其他基因型，而豫南黑豬作為地方品種豬，具有肌內(nèi)脂肪含量高、肉質(zhì)性狀好等優(yōu)點(diǎn)［17］，因此，可推斷本研究結(jié)果的可靠性，在本試驗(yàn)群體中與肉質(zhì)性狀間的相關(guān)性有待于進(jìn)一步的研究。

曾勇慶［19］及龐衛(wèi)軍等［20］一致認(rèn)為aaddHH（MspI-a、HaeIII-d、Hinf I-H）具有較高的IMF含量。本研究中HaeIII酶切位點(diǎn)上，各組試驗(yàn)豬均表現(xiàn)多態(tài)性，豫南黑豬和豫×蘇豬群體中有利等位基因d占優(yōu)勢(shì)，杜×豫豬和巴×豫豬群體中等位基因d的頻率分別為0.50和0.42。在Hinf I*-RFLP位點(diǎn)，巴×豫豬的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镈，頻率為0.58，與李楨等［21］等研究結(jié)果相一致。張桂香等［22］和李楨等［23］研究發(fā)現(xiàn)，MspI-RFLP位點(diǎn)在中國(guó)地方豬種中不具有多態(tài)性，而在本研究試驗(yàn)群體中均表現(xiàn)多態(tài)，分析可能與豫南黑豬培育過(guò)程中導(dǎo)入了杜洛克血統(tǒng)有關(guān)，因此后續(xù)將利用淮南豬及豫南黑豬作為供試群體，進(jìn)一步研究H-FABP基因的多態(tài)位點(diǎn)與生產(chǎn)性能的相關(guān)性。此外，本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)該豫南黑豬及其雜種豬的HaeIII、MspI和Hinf I*酶切位點(diǎn)處于連鎖平衡狀態(tài)，該研究結(jié)果進(jìn)一步揭示了H-FABP基因在試驗(yàn)群體中的遺傳規(guī)律，但至于在其他豬種中是否存在連鎖，有待進(jìn)一步確證。

4 結(jié)論

本研究中，豫南黑豬及其雜交后代豬的H-FABP基因在5’-UTR和intron2的4個(gè)酶切位點(diǎn)均存在多態(tài)性，且在intron2的HaeIII、MspI和Hinf I*酶切位點(diǎn)處于連鎖平衡狀態(tài)。本研究結(jié)果，可為將來(lái)篩選出合適有效的肉質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記提供重要的理論基礎(chǔ)。

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基金項(xiàng)目：河南省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（S2012-06）；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（142102110047）；鄭州科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（141PCXTD513）

作者簡(jiǎn)介：郭吉利（1989-），女，河南鞏義人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖學(xué)研究。

*通訊作者：李新建（1977-），男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種學(xué)研究。

收稿日期：（2016-03-30）