史子學(xué)，趙曉明，唐賽涌，曹傳閨，肖耀明，莊建萍，卞 益，朱?？。M(fèi)瓊慧（.上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)委員會，上海 嘉定 0800；.上海市嘉定區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，上海 嘉定 0800）

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應(yīng)用ISSR-PCR技術(shù)鑒別梅山豬肉及其肉制品的研究

史子學(xué)1，趙曉明2，唐賽涌2，曹傳閨2，肖耀明2，莊建萍2，卞 益2，朱?？?，費(fèi)瓊慧1
（1.上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)委員會，上海 嘉定 201800；2.上海市嘉定區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，上海 嘉定 201800）

摘 要：為解決涉及梅山豬及其肉制品的假冒銷售糾紛，有效保護(hù)梅山豬地方品種的市場地位和品牌形象，研究了ISSR-PCR方法鑒別梅山豬及其肉制品的引物及其方法，通過比較PCR指紋圖譜，能特異性鑒別梅山豬肉。

關(guān)鍵詞：ISSR-PCR；梅山豬肉；鑒別；指紋圖譜

梅山豬原產(chǎn)于太湖流域的上海市嘉定、寶山、松江等區(qū)縣和江蘇的昆山、太倉等市縣，是太湖豬中的典型代表，有肉質(zhì)好、耐粗飼、抗病力強(qiáng)等優(yōu)良特性。嘉定區(qū)的梅山豬品種其肌肉鮮嫩、肌纖維細(xì)而密，含水量較少，肌內(nèi)脂肪豐富，呈大理石狀，俗稱“五花肉”［1，2］。近年來隨著人們生活水平的提高，對畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量要求越來越高，許多以追求高產(chǎn)為目的培育的外三元豬肉不能滿足消費(fèi)需求，取而代之的是豬肉市場消費(fèi)追求多樣化、精細(xì)化、肉質(zhì)高品質(zhì)化。梅山豬因肉質(zhì)鮮美、香甜濃香而受到上海市民青睞，盡管價格比較高卻供不應(yīng)求。目前尚沒有鑒定梅山豬肉及其肉制品的方法可以有效地保護(hù)正宗梅山豬肉及其肉制品的市場地位和品牌形象。

目前，制定的以活體豬為檢測對象的鑒別梅山豬的地方性標(biāo)準(zhǔn)，對梅山豬宰殺后分割肉及其他肉制品就不能用這種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定了。豬全基因組測序技術(shù)雖然可以鑒別不同品種、甚至不同個體的豬，但需要檢測的基因數(shù)目很多，成本大，不能廣泛應(yīng)用。而若只檢測不同品種豬的個別基因，則不能區(qū)分轉(zhuǎn)基因和純種豬肉制品。ISSR是Zietkiewicz等［3］于1994創(chuàng)建的一類在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，它和PCR技術(shù)聯(lián)合使用具有很高的特異性和靈敏度且準(zhǔn)確快速，近年來在品種鑒定、種質(zhì)資源和遺傳多樣性研究廣泛應(yīng)用，如ISSR分子技術(shù)鑒別陸川豬肉［4］、雁鵝［5］、馬鈴薯［6］、霍亂弧菌［7］和水稻［8］品種等。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

梅山豬、梅杜二元雜豬樣品來源于上海市嘉定區(qū)梅山豬育種中心（國家級梅山豬保種場）；杜長大三元雜豬肉樣品購自樂購超市；金華兩頭烏豬肉樣品購自專賣店；寧鄉(xiāng)花豬樣品購自湖南景倉農(nóng)業(yè)科技有限公司（寧鄉(xiāng)花豬專賣店）；蘇淮黑豬樣品購自江蘇省蘇食肉品有限公司（蘇淮黑豬專賣店）；陸川豬樣品購自廣西玉林陸川豬養(yǎng)殖戶；羊肉、牛肉購自樂購超市。樣品分裝后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

ISSR隨機(jī)引物根據(jù)British Columbia大學(xué)公布的序列設(shè)計，2×Taq PCR MasterMix購自天根生化科技有限公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）；PCR擴(kuò)增儀（ABI）；臺式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）；DYY-7型電泳儀（北京市六一儀器廠）等。

2 方法

2.1 基因組DNA提取

分別取約100 mg梅山豬母豬、梅杜二元雜母豬、梅山豬公豬、梅杜二元雜公豬、杜長大三元雜的生鮮肉，放入研磨器加1 000μL蒸餾水，研磨5 min，取100 μL研磨液，加入1 mLDNA提取緩沖液（10 mol/ L Tris-HCl，0.1 mol/L EDTA，0.5%SDS），然后再加入25 μL蛋白酶K，使終濃度達(dá)到100 μg/mL，混勻，50 ℃水浴3 h。用等體積的酚抽提1次，2 500 r/min離心收集水相，用等體積的酚、氯仿和異戊醇（體積比25：24：1）的混合物抽提1次，2 500 r/min離心收集水相；用等體積的氯仿和異戊醇（體積比24：1）的混合物抽提1次；加入等體積的5 mol/L的LiCl，混勻，冰浴10 min；2 500 r/min，離心10 min。轉(zhuǎn)移上清加入等體積的異丙醇，室溫10 min；2 500 r/min，離心10 min后棄上清。加入0.1倍體積3 mol/L乙酸鈉（pH5.2）與2倍體積-20℃預(yù)冷無水乙醇，-20 ℃靜置20 min。室溫12 000 r/min離心5 min后棄上清。將基因組DNA溶于適量100 μL TE中，作為ISSR-PCR反應(yīng)的模板DNA。

2.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序

ISSR-PCR反應(yīng)體系為25 μL體系：模板DNA 1μL、引物0.4 μmol/L、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O補(bǔ)足25 μL；擴(kuò)增程序：設(shè)置梯度PCR擴(kuò)增程序。95 ℃預(yù)變性 2 min，95 ℃變性30 s，退火30s，72℃延伸1 min，循環(huán)40次，72 ℃再延伸10 min。

2.3 電泳檢測

將擴(kuò)增產(chǎn)物5μL進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，1×TAE緩沖液，電壓100 V下電泳0.5 h，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

3 結(jié)果與分析

3.1 供試樣品ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

選擇ISSR隨機(jī)引物：5’-ATG ATGATGATGATGATGA-3’，經(jīng)梯度PCR優(yōu)化確定的退火溫度為54.6℃，模板加入量50～100 mg。對梅山豬母豬、梅杜二元雜母豬、梅山豬公豬、梅杜二元雜公豬、杜長大三元雜的生鮮肉提取基因組DNA進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，電泳圖譜見圖1。對梅山豬母豬、金華兩頭烏、蘇淮黑豬、寧鄉(xiāng)花豬、陸川豬、羊肉、牛肉提取的基因組DNA進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，電泳圖譜見圖2。

3.2 擴(kuò)增條帶圖譜分析

如圖1中箭頭所示，梅杜二元雜母豬、梅杜二元雜公豬、杜長大三元雜樣品均產(chǎn)生1條較清晰的條帶，而梅山豬母豬、梅山豬公豬中無此條帶，多次重復(fù)實驗結(jié)果一致，并且梅山豬母豬、梅山豬公豬樣品PCR擴(kuò)增條帶一致。梅山豬有條帶A、B、D、E和F而無條帶B1和C，而梅杜二元雜和杜長大三元雜有條帶A、B、C、D，條帶E和F稍模糊，梅杜二元雜母豬、杜長大三元雜有清晰B1條帶杜梅二元雜公豬B1條帶稍模糊。因此，凡是滿足有且僅有條帶A、B、D、E和F即可鑒定為梅山豬。

圖1 鑒定梅山豬的電泳圖譜

圖2 鑒別梅山豬與其他品種豬及羊肉、牛肉電泳圖譜

如圖2中箭頭所示，金華兩頭烏、蘇淮黑豬、寧鄉(xiāng)花豬、陸川豬樣品均產(chǎn)生一條較清晰的條帶（B1帶，大小為850 bp），而梅山豬中無此條帶，多次重復(fù)實驗結(jié)果一致，羊肉、牛肉與豬肉圖譜差異較大，很容易區(qū)分。由圖2發(fā)現(xiàn)，梅山豬有條帶A、B、D、E和F而無條帶B1和C，而金華兩頭烏豬、蘇淮黑豬、寧鄉(xiāng)花豬、陸川豬有清晰條帶A、B1、D、E和F，陸川豬還有明顯的C帶。而羊肉與牛肉的DNA指紋圖譜與梅山豬相去甚遠(yuǎn)，羊肉具有明顯的條帶C，而牛肉具有極為明亮明顯的條帶B1。因此，凡是滿足有且僅有條帶A、B、D、E和F的樣品可鑒定為梅山豬。

4 討論

ISSR-PCR主要是由單一引物且以重復(fù)序列為擴(kuò)增序列，所以結(jié)果的特異性受引物序列、反應(yīng)體系或退火溫度等影響較大。本研究經(jīng)優(yōu)化建立了基于ISSR-PCR技術(shù)梅山豬肉鑒別方法，圖譜擴(kuò)增帶明亮、穩(wěn)定性及多態(tài)性高，為梅山豬遺傳保種、商業(yè)化推廣提供了技術(shù)手段，也為國內(nèi)其他優(yōu)良地方豬肉品種辨別提供了借鑒。

參考文獻(xiàn)

［1］ 殷方芝，肖耀明，陶軍，等. 近年來我國地方豬種遺傳資源保護(hù)與利用［J］. 豬業(yè)科學(xué)， 2015，32（10）：132-133.

［2］ 唐賽涌，王勃，陸林根.上海地區(qū)梅山豬的歷史發(fā)展與保種現(xiàn)狀［J］.中國豬業(yè)，2013 （S1）：71-73.

［3］ Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D.Genome fingerprintingby simple sequence repeat（SSR） anchored polymerase chainreaction amplification［J］. Genonics，1994， 20（2）：176-183.

［4］ 何瑜林，黃麗，封毅，等.ISSR分子標(biāo)記鑒定陸川豬及其肉制品［J］. 肉類研究，2014，28 （10）：10-14.

［5］ 李瑩，梁強(qiáng)，趙華寶，等.雁鵝遺傳多樣性的ISSR分析［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報， 2009 （6）：63-68.

［6］ 段艷鳳，劉杰，卞春松，等.中國88個馬鈴薯審定品種SSR指紋圖譜構(gòu)建與遺傳多樣性分析［J］.作物學(xué)報，2009，35（8）：1 451-1 457.

［7］ 莫秋華，譚華，王琪，等.霍亂弧菌分子分型和溯源技術(shù)ISSR-PCR的改進(jìn)［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2014 （9）：33-37.

［8］ 黃亮，李雨馨.常見水稻品種的DNA指紋圖譜構(gòu)建及其遺傳［J］.糧食與油脂.2014 （10）：29-32.

收稿日期：（2016-01-28）