黃天臣　肖建安　王青兵　王雁軍 　張勇 　白東曉　邱新光

1)河南安陽市腫瘤醫(yī)院外四科　安陽　455000　2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院普通外科　鄭州　450052

Ki-67的表達與胃癌患者臨床病理特征及預后的關(guān)系

黃天臣1)肖建安1)王青兵1)王雁軍1)張勇1)白東曉1)邱新光2)*

1)河南安陽市腫瘤醫(yī)院外四科安陽4550002)鄭州大學第一附屬醫(yī)院普通外科鄭州450052

【摘要】目的探討Ki-67在胃癌組織中的表達及其臨床意義。方法采用免疫組化技術(shù)，檢測326例胃腺癌組織及相應326例正常胃黏膜組織中Ki-67蛋白的表達情況。采用半定量RT-PCR實驗檢測，隨機選取10例胃腺癌組織和相對應的正常胃黏膜組織中Ki-67mRNA的表達情況，應用χ2檢驗、Kaplan-Meier生存分析及COX 回歸分析與患者臨床病理特征及預后的關(guān)系。結(jié)果胃癌組織中Ki-67蛋白和mRNA明顯高于正常胃黏膜組織(P<0.05 )。Kaplan-Meier生存分析顯示Ki-67蛋白表達與胃癌患者的預后密切相關(guān) (χ2=8.086, P=0.005)，COX 回歸分析顯示Ki-67為胃癌患者預后的獨立因素 (P=0.002 )。結(jié)論Ki-67的表達與胃癌預后密切相關(guān)，為胃癌患者預后的獨立因素。

【關(guān)鍵詞】胃癌；Ki-67；臨床病理特征；預后

胃癌為消化道腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤。我國是胃癌發(fā)病率和病死率最高的國家之一。因此，對于胃癌相關(guān)基因及分子標記物的研究對胃癌的早期診斷、治療、預后評定具有重要的臨床意義。Ki-67 是較為肯定的與細胞周期相關(guān)的核增殖標志物，僅僅存在于增殖細胞的細胞核內(nèi)[1]，其表達隨細胞周期的進展而增加[2]，為反應細胞增殖活性的重要指標，廣泛用于腫瘤細胞的增殖評估。研究表明[3-4]，Ki-67在肺癌、肝癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中均有過表達，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移及預后相關(guān)。研究 ki-67 在胃癌組織中的表達，對評估胃癌細胞的增殖活性及判定預后具有重要意義。

1資料與方法

1.1組織標本來源收集2005-03—2010-03間于安陽市腫瘤醫(yī)院接受胃癌根治術(shù)的326例胃癌患者的手術(shù)標本。均排除遠處轉(zhuǎn)移，均未接受放化療、免疫治療，術(shù)后均經(jīng)過病理確診。標本應用多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，分別用于HE染色及免疫組織化學染色。新鮮實驗標本保存于液氮中，用于半定量RT-PCR實驗。正常胃黏膜組織取自手術(shù)標本中距癌組織邊緣5 cm以上的手術(shù)切緣，均經(jīng)病理學證實為正常的胃黏膜組織。

1.2實驗方法

1.2.1免疫組化(1)方法：免疫組織化學方法采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法技術(shù)(streptavidin-perosidase, SP技術(shù))，染色步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。(2)結(jié)果判定：采用雙評分半定量積分法對Ki-67的免疫組化結(jié)果分析。以出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒的細胞作為陽性細胞，Ki-67抗原陽性表達為細胞核呈棕褐色顆粒，在高倍鏡下(400倍高倍鏡下視野)，隨機選取5個視野(每個視野計數(shù)的細胞數(shù)不少于200個)。評分：陽性細胞<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。陽性強度評分：細胞無染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分。將陽性細胞百分比和陽性強度兩項相乘，0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為(++)，≥9分為(+++)，將(++)和(+++)樣本認為陽性表達，(-)和 (+)樣本認為陰性表達。

1.2.2半定量RT-PCR用Primer 6.0軟件輔助設(shè)計PCR擴增引物(由上海生工生物技術(shù)有限公司合成)，序列如下：人Ki-67引物：上游引物為：5'- GTGAGGGAATACCTTTGA-3'，下游引物為：5'-CCTGATGGTTGAGGCTGT-3'，擴增片段長度191 bp。內(nèi)參人GAPDH引物：上游引物為：5'-AATCCCATCACCATCTTCC-3'，下游引物為：5' -CCTGCTTCACCACCTTCTT-3'，擴增片段長度580bp。使用Trizol法提取組織細胞中總RNA，紫外分光光度計測量總RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性。逆轉(zhuǎn)錄合成c DNA，取2μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增。PCR反應條件為：94 ℃ 5min(預變性)一個循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共35個循環(huán)。72 ℃ 10 min，4 ℃ 2 min。擴增結(jié)束后，進行瓊脂糖凝膠電泳實驗，最后在紫外燈下觀察結(jié)果和拍照。

2結(jié)果

2.1Ki-67蛋白在胃癌組織與正常胃黏膜組織中的表達應用SP檢測326例胃癌及相應的正常胃黏膜組織中Ki-67蛋白的表達。結(jié)果顯示，Ki-67蛋白主要表達于癌細胞胞核，呈棕黃色顆粒。在326例胃癌組織中，有204例Ki-67 表達陽性，陽性表達率為62.57%。顯著高于正常胃黏膜組織(11.96%)，胃癌組與正常胃黏膜組Ki-67 的陽性表達率比較有顯著性差異 (χ2=178.602,P=0.000)，見表1。

表1　胃癌與正常胃黏膜組織中ki67蛋白表達比較

2.2RT-PCR檢測胃癌和正常胃黏膜組織中Ki-67 mRNA的表達為了進一步證實免疫組化的結(jié)果，我們采用半定量RT-PCR分析隨機選取的10例胃癌組織和相對應的正常胃組織Ki-67 mRNA表達。結(jié)果表明，隨機選取的10例胃癌組織中Ki-67 mRNA的表達顯著高于相對應的正常胃黏膜組織，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表 2

表2　胃癌和正常胃黏膜組織中Ki-67 mRNA的表達

*：與胃癌組織相比，P<0.05

2.3Ki-67與胃癌臨床病理學的關(guān)系應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分別從性別、年齡、TNM分期、組織分化程度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面分析Ki-67蛋白表達與胃癌臨床病理學之間的關(guān)系，進一步研究Ki-67蛋白在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的可能作用。結(jié)果顯示，Ki-67蛋白的表達與胃癌患者的性別、年齡、TNM分期無關(guān)(P>0.05)，但與胃癌患者的組組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)(P<0.05)，見表3。

2.4Ki-67蛋白表達與胃癌病人預后之間的關(guān)系

2.4.1預后單因素分析應用Kaplan-Meier生存曲線分析Ki-67蛋白表達與胃癌患者存活時間之間的關(guān)系。入組的326例胃癌患者均具有完整的隨訪資料，術(shù)后第1年每3個月隨訪1次，以后每6個月隨訪1次。隨訪形式以門診復查為主，其次為電話方式。隨訪時間3～87個月，中位隨訪時間為36.5個月。將326例胃癌患者的腫瘤分化、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ki-67蛋白表達情況進行單因素分析，結(jié)果顯示，Ki-67蛋白表達與胃癌患者的預后密切相關(guān)(χ2=8.086,P=0.005 )(圖 1)。同時發(fā)現(xiàn)TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度對胃癌患者的預后具有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。

表3　Ki-67蛋白表達與胃癌臨床病理學參數(shù)之間的關(guān)系

圖1　Ki-67與胃癌患者生存關(guān)系

2.4.2預后多因素分析為進一步明確Ki-67蛋白表達的獨立性預后價值，應用COX模型對單因素分析中有顯著意義的4個變量進行多因素分析，COX 回歸分析顯示Ki-67、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期為胃癌患者預后的獨立因素 (P<0.05)，而腫瘤分化程度雖然在單因素分析中與胃癌患者預后相關(guān)，但經(jīng)COX回歸分析，無明顯統(tǒng)計學意義，并非影響胃癌患者預后的獨立因素，見表4。

表4　胃癌患者術(shù)后生存多因素 COX 回歸分析

3討論

Ki-67是較為肯定的與細胞周期相關(guān)的核增值標志物，僅僅存在于增值細胞的細胞核內(nèi)[1]，所編碼的基因位于第10號染色體上，其表達隨細胞周期的進展而增加，細胞分裂周期中，G0期不表達，G1后期開始表達，S和G2逐漸升高，M期達到高峰，細胞分裂結(jié)束后迅速降解消失[2]，為反應細胞增值活性的重要指標，廣泛用于腫瘤細胞的增殖評估。研究表明[3-4]，Ki-67在肺癌、肝癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中均有過表達，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移及預后相關(guān)。

關(guān)于胃癌與Ki-67關(guān)系的研究已較多，但目前尚存在爭議。研究表明，Ki-67在胃癌組織中的表達與腫瘤的臨床病理及患者的預后密切相關(guān)[5]。Tsamandas等[6]研究認為，Ki-67與胃癌患者預后相關(guān)。Kikuyama等[7]認為Ki-67為評估胃癌患者預后的獨立的因子。而Oshima等[8]研究表明Ki-67與患者性別、年齡、腫瘤的臨床分期及患者預后均無明顯相關(guān)。Victorzon等[9]則認為Ki-67對于胃癌患者的預后判定無預測價值。本研究結(jié)果顯示： Ki-67蛋白主要表達于癌細胞胞核，呈棕黃色顆粒，胃癌組織中Ki-67陽性表達率為62.57%，顯著高于正常胃黏膜組織(11.96%)，具有顯著性差異。應用半定量RT-PCR實驗隨機檢測10例胃腺癌組織和對應的正常胃黏膜組織中Ki-67的表達情況，進一步證實Ki-67在胃癌組織中表達明顯高于在正常胃黏膜組織中的表達。

應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分別從性別、年齡、TNM 分期、組織分化程度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面分析Ki-67蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，進一步研究Ki-67蛋白在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的可能作用。結(jié)果顯示，Ki-67蛋白的表達與胃癌患者的性別、年齡、TNM分期無關(guān)，但與胃癌患者的組組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)。

進一步分析Ki-67蛋白表達與胃癌患者預后的關(guān)系。應用Kaplan-Meier生存曲線分析Ki-67蛋白表達與胃癌患者存活時間之間的關(guān)系。將326例胃癌患者的病理學資料：腫瘤分化、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ki-67蛋白表達情況進行單因素分析，結(jié)果顯示，Ki-67蛋白表達與胃癌患者的預后密切相關(guān)。同時發(fā)現(xiàn)TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度對胃癌患者的預后具有統(tǒng)計學意義。為進一步明確Ki-67蛋白表達的獨立性預后價值，應用COX模型對單因素分析中有顯著意義的4個變量進行多因素分析，COX 回歸分析顯示Ki-67、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期為胃癌患者預后的獨立因素。

4參考文獻

[1]Nowieki M, Ostalska, Nowieka D, Miskowiak B, et al. Prognostic significance of Ki-67 negative blaste cell clone in the high risk group of children treated for acute myeloid leukaemi [J]. Folia Histochem Cytobiol, 2006, 44(l): 49-52.

[2]Gerdes J, Lemke H, Baisch H, et al. Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67[J]. J Immunol 1984; 133: 1 710‐1 715.

[3]Ogata DC, Marcondes CA, Tuon FF, et al. Sperfical papillary urothelial neoplasmas of the bladder ( PTA E PT1 ): correlation of expression of p53, ki-67 and CK20 with histologic grade, recurrence and tumor progression [J]. Rev Col Bras Cir, 2012, 39(5): 394-400.

[4]Vilar E, Salazar R, Perez-Garcia J, et al. Chemotherapy and role of the proliferation marker Ki-67 in digestive neuroendocrine tumors [J]. Endocr Relat Cancer, 2007, 14 (2): 221-232.

[5]Daniela Lazar, Sorina Taban, I Sporea. Ki-67 expression in gastric cancer [J]. Romanian Journal of Morphology and Embryology 2010, 51 (4): 655-661.

[6]Tsamandas AC, Kardamakis D, Tsiamalos P, et al. The potential role of Bcl-2 expression, apoptosis and cell proliferation ( Ki-67 expression ) in cases of gastric carcinoma and correlation with classic prognostic factors and patient outcome [J]. Anticancer Res 2009 Feb; 29(2):703-9.

[7]Kikuyama S, Kubota T, Shimizu K. et a1. Ki-67 antigen expresion in relation to clinicopathological variables and prognosis in gastric cancer [J]. Oncol Rep, 1998, 5(4): 867-870.

[8]Oshima CT, Iriya K, Forones NM. Ki-67 as a prognostic marker in colorectal cancer but not in gastric cancer [J]. Neoplasma 2005; 52(5): 420 - 4.

[9]Victorzon M, Roberts PJ, Haglund C. et a1. Ki-67 immunoreactivity ploidy and S-phase faction as prognostic factors in patients with gastric carcinoma [J]. Oncololgy, 1996, 53: 182-191.

(收稿2015-12-24)

Association of Ki-67expression with clinicopathologic features and prognosis in gastric cancer

HuangTianchen,XiaoJianan,WangQingbing,WangYanjun,ZhangYong,BaiDongxiao，QiuXinguang.

Thefourthdepartmentofgeneralsurgery,AnyangtumorHospital,Anyang455000 2.DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the Ki-67 expression and its clinical significance in gastric cancer. MethodsThe expressions of Ki-67protein in 326 adenocarcinoma of gastric structures and in the corresponding 326 normal gastric mucosa structures will be tested by applying Immunohistochemical Technique.The expressions of Ki-67mRNA in 10 random chosen cases of adenocarcinoma of gastric structures and its corresponding normal gastric mucosa structures will be tested by semi-quantitative RT-PCR. The associationof Ki-67 expression with clinicopathologic features and prognosis in gastric cancer patients were analyzed with various statistical methods，such as χ2 -test，Kaplan-Meier method and COX proportional hazard model.ResultsKi-67 protein and Ki-67 mRNA in the gastric cancer structure clearly is more than that in normal gastric mucosa structure(P<0.05 ). The gastric cancer patient’s survival rate with high expression of Ki-67 is dramatically lower than that with low expression of Ki-67. The expression of Ki-67 is closely related to stomach cancer patient’s prognosis(χ2=8.086, P=0.005). The result of COX proportional hazard model shows that Ki-67 is the independent prognostic factor of stomach cancer patient(P=0.002).ConclusionThe expression of Ki-67 is closely related to the prognosis; Ki-67 is the independent prognostic factor of gastric cancer.

【Key words】Gastric cancer;Ki-67; Clinicopathologic features;Prognosis

*通訊作者：邱新光，Email：15836387568@163.com

【中圖分類號】R392.31

【文獻標識碼】B

【文章編號】1077-8991(2016)03-0008-04