周　成，時維靜，肖　新，謝　越，汪建飛，馬忠友，*(1.安徽科技學(xué)院　應(yīng)用微生物研究所，安徽　鳳陽　100;.安徽科技學(xué)院　農(nóng)業(yè)部生物有機肥創(chuàng)制重點實驗室，安徽　鳳陽　100;.安徽科技學(xué)院　食品藥品學(xué)院，安徽　鳳陽　100)

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一株生物轉(zhuǎn)化白頭翁皂苷真菌的篩選與鑒定

周成1，2，時維靜3，肖新2，謝越2，汪建飛2，馬忠友1，2，*
(1.安徽科技學(xué)院應(yīng)用微生物研究所，安徽鳳陽233100;
2.安徽科技學(xué)院農(nóng)業(yè)部生物有機肥創(chuàng)制重點實驗室，安徽鳳陽233100;
3.安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽鳳陽233100)

摘要:目的:篩選能夠轉(zhuǎn)化白頭翁皂苷的真菌，并對該菌株進行分類鑒定。方法:將白頭翁皂苷加入培養(yǎng)基中誘導(dǎo)真菌分泌白頭翁皂苷糖苷酶，并通過薄層層析技術(shù)檢測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。再采用經(jīng)典的形態(tài)學(xué)特征觀察和現(xiàn)代的ITS－rDNA測序分子生物學(xué)分類技術(shù)相結(jié)合對真菌進行鑒定。結(jié)果:篩選出能夠生物轉(zhuǎn)化白頭翁皂苷的RCEF4894菌株，該菌株被鑒定為棘孢曲霉Aspergillus aculeatus Iizuka。結(jié)論:棘孢曲霉RCEF4894菌株能夠被誘導(dǎo)產(chǎn)生白頭翁皂苷糖苷酶，將多糖基的白頭翁皂苷水解成低糖基的皂苷。

關(guān)鍵詞:白頭翁皂苷;生物轉(zhuǎn)化;棘孢曲霉

中藥中活性成分或活性核心物質(zhì)，是在腸道菌群及體內(nèi)酶的作用下產(chǎn)生的一系列代謝產(chǎn)物，天然中藥中不存在或含量很低。生物轉(zhuǎn)化不僅能改變中藥中主要成分的含量、活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，擴大藥源范圍，亦能對有毒中藥進行持效減毒，增效擴用。通過改造皂苷類物質(zhì)的糖基從而提高該類物質(zhì)的活性的研究已有相關(guān)的文獻報道，其中人參皂苷被生物轉(zhuǎn)化為皂苷元后，抗腫瘤藥效明顯提高［1］。

白頭翁(Pulsatilla chinensis (Bunge) Regel)為毛莨科植物，它的干燥根作為中藥，其性寒，味苦，具有清熱解毒，涼血止痢，燥濕殺蟲的功效。臨床上主要用于治療細菌性痢疾，阿米巴痢疾，婦科陰道炎，濕熱瀉痢，溫瘧寒熱，腹痛，下痢濃血等癥。研究表明白頭翁除具有抗菌和抗病原蟲的作用外，還具有抗癌，殺精，治療內(nèi)毒素血癥等作用［2］。本實驗旨在探索以白頭翁皂苷為誘導(dǎo)物，篩選出能夠生物轉(zhuǎn)化白頭翁皂苷的棘孢曲霉Aspergillus aculeatusIizuka RCEF4894菌株，該菌株能夠產(chǎn)生白頭翁皂苷糖苷酶并將多糖基的白頭翁皂苷轉(zhuǎn)變成低糖基的皂苷;為進一步開發(fā)利用白頭翁提供一定的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種毛霉(Mucor)菌株BFKC03、根霉(Rhizopus)菌株BFKC07、曲霉(Aspergillus)菌株RCEF4894等真菌菌株均由安徽科技學(xué)院生物技術(shù)教研室吳萍教授惠贈;

1.1.2培養(yǎng)基及其配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基:稱取KH2PO42.0 g、(NH4)2SO48.0 g、CO(NH2)20.3 g、MgSO4.7H2O 3 g、CaCl20.3 g、MnSO40.00156 g、CoCl20.002 g、FeSO4.7H2O 0.005 g、ZnSO4.7H2O 0.0014 g，用蒸餾水定容至1000 mL，115℃滅菌30 min。

馬鈴薯培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、蔗糖(葡萄糖) 20 g、瓊脂15～20 g、水1000 mL、pH自然。馬鈴薯去皮，切成塊煮沸30 min，然后用紗布過濾，再加糖及瓊脂，溶化后補足水至1000 mL，121℃滅菌30 min。

CYA固體培養(yǎng)基: K2HPO41.0 g、查氏濃貯液10 ml、酵母膏5 g、蔗糖30 g、瓊脂15 g、水1000 mL; pH 為6.0，121℃滅菌15 min。

查氏濃貯液: NaNO330 g、KCL 6 g、MgSO4·7H2O 5 g、FeSO4·7H2O 0.1 g、蒸餾水1000 mL。

CA固體培養(yǎng)基: K2HPO41.0 g、NaNO33.0 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂15 g、水1000 mL; pH為6.0，121℃滅菌15 min。

1.1.3主要試劑白頭翁生藥(根)，購于亳州市滬譙中藥飲片廠，經(jīng)時維靜教授鑒定為正品;高效硅膠G板，購于青島海洋化工廠; TaqDNA聚合酶、dNTP、膠純化回收試劑盒Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0均購自大連寶生物公司(TaKaRa) ;平衡酚(pH8.0)購于上海生工;其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗方法

1.2.1白頭翁皂苷的提取用蒸餾法從白頭翁根中提取得到原白頭翁素，用乙醇提取純化后，濃縮干燥得到白頭翁總皂苷［3］。

1.2.2轉(zhuǎn)化白頭翁皂苷真菌的篩選將毛霉(Mucor)菌株BFKC03、根霉(Rhizopus)菌株BFKC07、曲霉(Aspergillus)菌株BFKC23等真菌菌株分別接種于馬鈴薯培養(yǎng)基上，28℃活化培養(yǎng)2～3 d。于250 mL三角燒瓶中分別裝基礎(chǔ)培養(yǎng)基100 mL，再向瓶中加入葡萄糖2 g，混勻，滅菌。接入活化好的菌種于28℃搖床培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速200rpm) 1～2 d，再向其中加入無菌白頭翁皂苷溶液至終濃度為0.5%，在28℃條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2～3 d。

菌種培養(yǎng)好后將發(fā)酵液用真空泵抽濾，菌體－80℃保存?zhèn)溆?，收集上清液。攪拌上清液加入乙醇達75%(v/v)，4℃保存過夜。離心取上清液，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀30℃濃縮。濃縮液冷凍干燥得干粉，然后用甲醇溶解30 min，離心最后得到上清液用于硅膠板薄層檢測。

1.2.3白頭翁皂苷的薄層層析檢測將硅膠板在110℃烘箱中活化30～60 min，用微量毛細管吸取白頭翁皂苷及樣品點樣于硅膠板上。每次的點樣量為毛細管長度的2 cm左右;點樣三次，每次點樣后均需用電吹風(fēng)吹干。將點好樣品的硅膠板放入層析缸的展開劑中，浸入展開劑的深度為距硅膠板底邊0.5～1.0 cm，密封蓋，待展開至規(guī)定距離(一般為5～6 cm)后，取出吹干溶劑，用碘顯色。所用展開劑為V(氯仿) ∶V(甲醇)∶V(雙蒸水) =50∶38∶2，顯色劑為碘蒸氣顯色。

1.2.4菌株形態(tài)特征的觀察與測定:固體平板培養(yǎng)法:把菌株依次接種到CYA和CA，平板培養(yǎng)基上時，隨著菌落的生長，觀察了菌株培養(yǎng)3 d至7 d時的形態(tài)學(xué)特征，包括宏觀特征(菌落大小、菌落顏色、生長速度、基部菌絲體、褶皺和溝紋等)和微觀特征(細胞形態(tài)，孢子大小，孢子形態(tài)等)［4］。

膠帶顯微觀察法:先取一潔凈的載玻片，用膠頭滴管在載玻片中央滴一滴蒸餾水，用剪刀剪下一段長約5 mm的透明膠帶，在無菌條件下打開培養(yǎng)皿蓋，用膠帶粘性一面在菌落上輕輕地粘一下，將膠帶放在載玻片水滴上，在膠帶上滴一滴乳酸石炭酸棉藍進行染色，再用蓋玻片蓋上，用吸水紙吸去多余水分。然后放在顯微鏡下鏡檢，記錄觀察結(jié)果。

1.2.5菌株ITS－rDNA區(qū)域的擴增采用氯化芐法提取基因組DNA［5］，ITS－rDNA序列擴增采用真菌鑒定通用引物ITS4(5' " TCCTCCGCTTATTGATATGC " 3')和ITS5(5' " GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG " 3')，引物由上海生工生物工程有限公司合成。擴增程序: 94℃變性5 min，(94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min)×30，72℃延伸10 min，4℃保溫。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，純化后送上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司進行序列測定［6］。

1.2.6分子分類系統(tǒng)樹的構(gòu)建為研究供試菌株與相關(guān)真菌的親緣關(guān)系及其系統(tǒng)地位，用該菌株的ITS －rDNA序列，在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索(BLAST search)，下載部分相關(guān)菌株的ITS區(qū)域序列與供試菌株的序列放在一起，用BioEdit軟件進行匹配排列。使用MEGA4.1軟件，并采用Neighbor－Joining和Bootstrap analysis方法進行1000次重復(fù)抽樣分析和分支系統(tǒng)樹的構(gòu)建［6］。

2　結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)化白頭翁皂苷真菌的篩選

毛霉(Mucor)菌株BFKC03、根霉(Rhizopus)菌株BFKC07、曲霉(Aspergillus)菌株RCEF4894在含有白頭翁皂苷的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)后，經(jīng)硅膠板薄層檢測發(fā)現(xiàn)RCEF4894菌株的培養(yǎng)液中產(chǎn)生與白頭翁皂苷標(biāo)準(zhǔn)品遷移率相差很大的斑點(圖1)，既有遷移率大的，也有遷移率小的斑點，判定該菌株能夠?qū)Π最^翁皂苷進行生物轉(zhuǎn)化。然而，其它菌株的培養(yǎng)液中卻產(chǎn)生與白頭翁皂苷標(biāo)準(zhǔn)品遷移率相似的斑點，表明這些菌株沒有轉(zhuǎn)化白頭翁皂苷的能力。

圖1　白頭翁皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的硅膠板薄層分析:1，白頭翁皂苷; 2，曲霉菌株RCEF4894; 3，毛霉菌株BFKC03; 4，根霉菌株BFKC07Fig.1 Analysis of transformed products of Pulsatilla saponin using TLC silica gel plate: 1.Pulsatilla saponin; 2.Aspergillus strain RCEF4894; 3.Mucor strain BFKC03; 4.Rhizopus strain BFKC03

2.2轉(zhuǎn)化白頭翁皂苷真菌的分類鑒定

2.2.1真菌的形態(tài)特征RCEF4894菌株分別接種在CYA和CA固體平板培養(yǎng)基上，在28℃下進行培養(yǎng)，每隔12 d觀察一次。RCEF4894在CYA上:絨狀，正面褐色，反面淡黃色，有明顯褶皺，有同心環(huán)，菌落7 d直徑7.3～7.4cm;在CA上:絨狀，正面黃褐色，反面淡黃色，布滿培養(yǎng)基，有同心環(huán)。分生孢子頭幼時為球形或輻射形(圖2A)，直徑100～230 μm，老時分裂成幾個緊密的圓柱狀結(jié)構(gòu)，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層(圖2B)，孢子有顯著的刺狀突起(圖2C)，橢圓形、球形、近球形，3.6～4.6×3.0～3.5 μm。這些形態(tài)特征與棘孢曲霉Aspergillus aculeatus的描述性狀相符合。

圖2　曲霉RCEF4894菌株的形態(tài)特征: A.分生孢子頭(40×) ; B.產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)(400×) ; C.分生孢子(400×)Fig.2 Morphological traits of Asperillus sp RCEF4894: A.conidial heads (40×) ; B.sterigmata in a single series (400×) ; C.conidia (400×)

2.2.2產(chǎn)白頭翁皂苷糖苷酶真菌的ITS－rDNA序列分析:通過PCR技術(shù)從RCEF4894的DNA中擴增出了ITS－rDNA序列，測序結(jié)果顯示整個ITS區(qū)共計487bp (圖3)，其中ITS1為177bp、5.8S為156bp、ITS2 為154bp(GenBank No.HM140184)。

圖3　曲霉菌株RCEF4894的ITS－rDNA序列Fig.3 ITS－rDNA sequence of Aspergillus aculeatus strain RCEF4894

圖4　曲霉屬部分菌株的ITS－rDNA序列分支系統(tǒng)樹Fig.4 Neighbour－joining tree based on ITS region sequence data of some strains from Aspergillus spp

將測得的RCEF4894 ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比對，和RCEF4894 ITS序列相似率達到99%的菌株均為棘孢曲霉Aspergillus aculeatus Iizuka。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)也可以看出RCEF4894和棘孢曲霉Aspergillus aculeatus聚在一組，概率99%，和其他曲霉菌株相距甚遠。綜合比較該菌株的形態(tài)特征和ITS－rDNA序列結(jié)果，將RCEF4894菌株鑒定為棘孢曲霉Aspergillus aculeatus。

3　結(jié)論與討論

對白頭翁皂苷增強系統(tǒng)免疫和抗腫瘤的研究，是近年來研究的主要熱點。鐘邱等［7］分離白頭翁的皂苷組分(正丁醇部分)有明顯的體外抑瘤活性; Sun等［8］對白頭翁皂苷進行溶血活性、急性毒性和免疫調(diào)節(jié)活性實驗，結(jié)果顯示白頭翁皂苷(正丁醇部分)有弱的毒性;李文超等［3］也發(fā)現(xiàn)正丁醇部位抑菌效果最佳。白頭翁皂苷B4主要在正丁醇部分，因此本實驗選用正丁醇部分的白頭翁皂苷提取物作為轉(zhuǎn)化底物。

生物轉(zhuǎn)化白頭翁皂苷的實驗研究也有相關(guān)報道［9－11］，楊宇等［11］對由犁頭霉Absidia sp.800菌株產(chǎn)的白頭翁皂苷糖苷酶進行了酶學(xué)性質(zhì)的相關(guān)研究。本實驗篩選出能夠轉(zhuǎn)化白頭翁皂苷的RCEF4894菌株，采用經(jīng)典的形態(tài)學(xué)特征觀察和現(xiàn)代的ITS－rDNA區(qū)域測序分子生物學(xué)分類技術(shù)相結(jié)合，確定RCEF4894菌株在系統(tǒng)分類上屬于棘孢曲霉，和楊宇等［11］實驗所用的犁頭霉Absidia sp.800菌株是不同的，為生物轉(zhuǎn)化白頭翁皂苷提供了一個新的途徑。棘孢曲霉RCEF4894菌株白頭翁皂苷糖苷酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以及白頭翁皂苷酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥效正在進一步研究中。

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(責(zé)任編輯:馬世堂)

Isolation and Identification of the Biotransformed－Pulchinenoside Fungi

ZHOU Cheng1，2，SHI Wei－jing3，XIAO Xin2，XIE Yue2，WANG Jian－fei2，MA Zhong－you1，2，*
(1.Institute for Applied Microbiology，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China; 2.Key Laboratory of Bio－organic Fertilizer Creation of Ministry of Agriculture，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China;
3.College of Food and Drug，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China)

Abstract:Objective: The fungi which could biotransform pulchinenoside were selected，and they were classified and identified.Methods: The pulchinenoside was supplemented into the culture medium to induce secretion of pulchinenoside－glycosidase by the fungi，and the pulchinenoside was detected by silica gel thin－layer chromatography.The fungi was identified based on its ITS－rDNA sequence and the morphological characteristics.Results: The RCEF4894 strain biotransformed pulchinenoside was isolated and identified as Aspergillus aculeatus Iizuka.Conclusion: The RCEF4894 strain could be induced to produce the pulchinenoside－glycosidase，which hydrolyzed the polyglycosylation of pulchinenoside into underglycosylation of pulchinenoside.

Key words:Pulchinenoside; Biotransform; Aspergillus aculeatus

中圖分類號:R282

文獻標(biāo)識碼:A

文章編號:1673－8772(2016) 02－0022－05

收稿日期:2016－01－10

基金項目:安徽省科技重大專項項目(15czz03102) ;安徽省自然科學(xué)基金(1608085MC59) ;國家星火計劃(2015GA710013; 2015GA710014)。

作者簡介:周成(1985－)，男，安徽省安慶市人，博士，講師，主要從事農(nóng)業(yè)微生物與植物互作研究。*通訊作者:馬忠友，副教授，E－mail: mazy@ ahstu.edu.cn。