丁晶琳 董穎 張麗娟 趙君 馬艷華 閆寬

1國家體育總局反興奮劑中心（北京 100029）

2北京化工大學理學院（北京 100029）

用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測4種刺激劑類禁用物質(zhì)

丁晶琳2董穎1張麗娟2趙君2馬艷華1閆寬1

1國家體育總局反興奮劑中心（北京 100029）

2北京化工大學理學院（北京 100029）

目的：使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，為世界反興奮劑機構(gòu)（WADA）在檢測窗口中擬增加的4種刺激劑甲磺美嗪（amezinium methylsulfate，I）、嗎拉宗（morazone，II）、貝美格（3-ethyl-3-methylglu?tarimide，III）和阿拉明（metaraminol，IV）建立了常規(guī)檢測方法，并對方法進行考察和驗證。方法：用5%的醋酸鉛水溶液將樣品中蛋白質(zhì)等大分子沉淀后，離心10分鐘，取上清液上機檢測。質(zhì)譜采用電噴霧電離源（ESI），在正離子模式下，通過多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式對樣品進行分析。結(jié)果：經(jīng)過定性和定量分析，得到上述四種刺激劑的檢測限（LOD）分別為0.1、0.5、5和0.5 ng/mL；定量限（LOQ）分別為0.3，1.5，15和1.5 ng/ mL；線性范圍（r2＞0.99）分別在0.3～5000、1.5～3000、15～3000和1.5～4500 ng/mL之間。每種刺激劑在低、中和高3個濃度范圍的基質(zhì)效應(yīng)均在98%～120%之間；準確度誤差在9%以內(nèi)；日內(nèi)精密度的標準偏差低于7.7%，日間精密度的標準偏差不超過10%。結(jié)論：本研究建立的檢測方法具有樣品前處理簡單、靈敏度高、準確度好和基質(zhì)干擾較小等特點，滿足興奮劑檢測實驗室的要求，并已經(jīng)應(yīng)用于常規(guī)檢測中。

液相色譜--串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用；刺激劑；方法驗證；興奮劑控制

刺激劑包含能夠增加刺激性、暫時緩解疲勞以及可能增強競技性、攻擊性等生理作用的各類物質(zhì)，如以苯丙胺為代表的中樞神經(jīng)刺激劑，以麻黃堿為代表的末梢交感神經(jīng)刺激劑等。刺激劑是競技體育中濫用歷史最長的興奮劑。刺激劑作用于中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)，可使運動員的行為和能力得到較快調(diào)整。刺激劑還可以提高肌肉的工作效率，減緩或加速消除疲勞，使運動員能夠進行長時間和大強度的訓練。但使用刺激劑類藥物的副作用也是顯而易見的，此類藥物會降低使用者的身體感知能力，削弱部分人體的自我保護功能。服用后，人體亢奮狀態(tài)持續(xù)一段時間后會進入極度疲勞狀態(tài)。服用大劑量的刺激劑更會影響心肺功能，使人體器官超負荷運轉(zhuǎn)，造成器官損傷，嚴重者會引起血壓急劇上升和心律不齊等，更有甚者會導致死亡。

氣相色譜-氮磷檢測（GC-NPD）技術(shù)是刺激劑傳統(tǒng)的檢測方法[1-4]，但該方法具有檢測重現(xiàn)性較差和靈敏度低等缺點。也可將刺激劑衍生化后用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）進行檢測[5]，但該方法的前處理繁瑣，所用衍生化試劑毒性大，干擾因素多且方法穩(wěn)定性差。為簡化樣品前處理步驟，實現(xiàn)高通量、快速的檢測目標，文獻報道[6，7]將刺激劑在強堿性條件下用液液萃取的方法進行提純后，用GC-MS技術(shù)進行檢測。為提高檢測靈敏度，近年來通常采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）檢測刺激劑[8-11]和其他禁用物質(zhì)[12-17]。

圖1 本研究4種刺激劑的化學結(jié)構(gòu)式

世界反興奮劑機構(gòu)（WADA）曾經(jīng)于2015年初向各個WADA認可的實驗室發(fā)了一份列表，詢問是否為列表上的刺激劑類禁用物質(zhì)建立了檢測方法。本研究包含的4種刺激劑甲磺美嗪、嗎拉宗、貝美格和阿拉明（圖1）也包含在此列表中。通過查閱文獻得知[18]，甲磺美嗪主要通過尿液排出體外，尿液中大概含56%-89%原形藥物。Shintani[19]和Kokot[20]報道用液相色譜法測定甲磺美嗪在血漿中的濃度，檢測限為2 ng/mL。Lho 等[21]發(fā)表過一篇文章，介紹了使用氣相色譜方法檢測兔尿和血漿中嗎拉宗含量的方法。1991年，Soto-Otero 等[22]曾在文章中介紹過使用液相色譜法測定兔子血清和腦組織中貝美格的濃度。還有文獻報道關(guān)于阿拉明的液相色譜檢測方法的研究[23，24]，而在2000年Hill等報道了使用ACPI源的HPLC-MS/MS方法檢測馬尿中該藥物的含量[25]。

到目前為止，國內(nèi)外尚未發(fā)表有關(guān)上述4種刺激劑分別或同時用HPLC-ESI-MS/MS技術(shù)的檢測方法。因此，為上述4種刺激劑建立靈敏度高、重現(xiàn)性好、專屬性強的HPLC-MS/MS檢測方法勢在必行。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

1290/6470 Triple Quad LC-MS/MS來自美國安捷倫公司（Agilent Technology）；氮吹儀購自英國比比科技有限公司（Bibby Scientific Ltd）；低速離心機購自北京雷勃爾離心機有限公司；感量0.0001 g電子天平來自瑞士梅特勒-托利多公司（Mettler Toledo）；超純水系統(tǒng)（Milli-Q Advantage A10）由美國密理博公司生產(chǎn)（Millipore）；GENIE VORTEX-2渦旋混合器由美國科技工業(yè)公司制造（Scientific Industries）。

1.2 主要材料與試劑

甲磺美嗪和貝美格來自東京化成工業(yè)株式會社；嗎拉宗從加拿大全資公司（Toronto Research Chemi?cals INC）購得；阿拉明、內(nèi)標倍可降（mefruside）和色譜純甲醇購自西格瑪奧德里奇科技有限公司；色譜純甲酸、甲酸銨和乙腈來自美國迪馬公司；醋酸鉛（分析純）來自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 標準溶液和質(zhì)控樣品溶液的制備

儲備溶液：稱取一定量的標準品，用甲醇溶解制備成濃度為1 mg/mL的溶液。標準溶液：將儲備液用甲醇稀釋至10 μg/mL。刺激劑質(zhì)控樣品溶液：在空白尿中用標準溶液倍比稀釋制備低、中和高3個濃度的質(zhì)控樣品溶液。

1.4 樣品前處理

采用本實驗室常規(guī)檢測刺激劑的方式對尿樣進行前處理：用1 mL可調(diào)式移液槍準確移取1 mL尿樣于10 mL螺口試管中，再加入1 mL濃度為5%的醋酸鉛水溶液（其中含有濃度為200 ng/mL的內(nèi)標），渦旋混勻，以4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10分鐘，倒出上清液，取10 μL進樣分析。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；采用pH 3.5的甲酸銨緩沖液（A）和乙腈（B）流動相進行梯度洗脫；流速：0.4 mL/min；柱溫：40℃；進樣體積10 μL。梯度洗脫程序如下：

（1）0.00 min：90%solvent A

（2）5.00 min：90%solvent A

（3）10.00 min：50%solvent A

（4）15.00 min：10%solvent A

（5）16.00 min：10%solvent A

（6）色譜柱平衡時間：4 min

1.5.2 質(zhì)譜條件

用電噴霧離子源（ESI），采用正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式采集數(shù)據(jù)。霧化氣：20 psi；毛細管電壓：3000 V，離子源溫度：330℃；干燥氣流速：10 L/ min。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的前處理

由于興奮劑檢測大多收集運動員尿樣，含有的內(nèi)源性干擾物質(zhì)較多，所以通常需要對樣品進行前處理，以達到純化和濃縮樣品的目的。樣品前處理方案通常需要根據(jù)選定的檢測方法和藥物的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和代謝方式確定。由于大部分刺激劑的代謝方式為原形代謝，所以比較常用的前處理方式為直接進樣法。該方法操作簡單、快捷，能最大程度地保留尿樣中的藥物，是較為理想的前處理手段。

2.2 HPLC-MS/MS檢測方法的建立

本研究用濃度為1 ng/μL的標準溶液對質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化。通過全掃描發(fā)現(xiàn)，4種刺激劑在正離子模式下的靈敏度明顯優(yōu)于負離子。再依次對質(zhì)譜的加速電壓和碰撞電壓等進行優(yōu)化，相關(guān)數(shù)據(jù)參見表1。

表1 4種刺激劑的色譜保留時間和質(zhì)譜參數(shù)

2.3 方法驗證

根據(jù)WADA實驗室國際標準和相關(guān)技術(shù)文件的要求，我們測定了4種刺激劑的檢測限、定量限和線性范圍，并驗證了方法的日間和日內(nèi)精密度、準確度、基質(zhì)干擾效應(yīng)和方法的特異性等指標。

2.3.1 檢測限（LOD） 和定量限（LOQ）

檢測限是指對某一特定的分析方法在給定的可靠程度內(nèi)可以從樣品中檢測待測物質(zhì)的最小濃度，通常指信噪比S/N≥3時被測藥物的濃度。定量限是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng)具有一定的準確度，一般定義為信噪比S/N≥10時被測藥物的濃度。檢測限與定量限的測定需要先用一份尿樣初略估計，然后在10份不同的空白尿中添加接近或高于估算濃度的標準品進行測定（表2）。與WADA技術(shù)文件[26]中規(guī)定的刺激劑檢測能力最低要求（100 ng/mL）相比，本方法的靈敏度遠遠超出對興奮劑樣品的檢測要求。

2.3.2 線性范圍

線性范圍指某一方法的校準曲線的直線部分所對應(yīng)的待測物質(zhì)濃度變化范圍。自LOQ開始向上配制系列濃度的樣品，根據(jù)上述1.4的描述處理并上機檢測，測量直至曲線出現(xiàn)彎曲時的濃度，此時相關(guān)系數(shù)r2大于0.99。通過測定得知（表3），這4種刺激劑都具有很寬的定量線性范圍。

表2 4種刺激劑的方法驗證數(shù)據(jù)

表3 4種刺激劑的線性范圍

2.3.3 精密度和準確度

精密度指一組測定的數(shù)據(jù)之間的接近程度，數(shù)據(jù)重復測定越接近，顯示其精密度越高。準確度是指檢測值與真值之間的偏離程度。本實驗的精密度和準確度測定是在低、中和高3個濃度級別進行的。在10份空白尿中，分別添加上述3個濃度的標準品，依據(jù)1.4的描述進行前處理并上機檢測，得出日內(nèi)精密度。按照日內(nèi)精密度的操作方法，每天操作1次，共做至少3次，計算得出日間精密度。通過工作曲線計算測量值，與真實值進行比較再乘以百分比，即為準確度（見表2）。

實驗結(jié)果顯示4種刺激劑在3個濃度水平下日內(nèi)變異系數(shù)均小于7.7%，日間變異系數(shù)均小于10%，檢測的準確度偏差均低于8.2%，符合興奮劑檢測實驗室常規(guī)檢測的要求。

2.3.4 基質(zhì)效應(yīng)

尿樣中的基質(zhì)常常對待測物的分析過程有顯著干擾，并影響分析結(jié)果的準確性，稱之為基質(zhì)效應(yīng)。在10份不同的空白尿中分別添加低、中和高3個濃度的標準品進行基質(zhì)效應(yīng)研究。將空白尿按照上述1.4的描述進行前處理后，在上清液中添加一定濃度的刺激劑和內(nèi)標，上機檢測得到峰面積B。同時，將同體積的純水經(jīng)過前處理后，在上清液中添加相同濃度的刺激劑和內(nèi)標，上機檢測得到峰面積A?；|(zhì)效應(yīng)的計算方式如下：

基質(zhì)效應(yīng) =刺激劑峰面積B/內(nèi)標峰面積B÷刺激劑峰面積A/內(nèi)標峰面積A×100%

表2的實驗結(jié)果顯示，4種刺激劑在低、中和高3個濃度下的基質(zhì)效應(yīng)均在可接受范圍內(nèi)（98%～120%）。

2.3.5 特異性

特異性是指在樣品介質(zhì)中有其它組分共存時，檢測方法對待測物準確而專屬的測定能力。當樣品中含有被分析物時呈陽性反應(yīng)，不含被分析物時呈陰性反應(yīng)。本研究選擇了50份空白尿樣，經(jīng)前處理并上機檢測后，發(fā)現(xiàn)尿樣中基質(zhì)對待測離子窗口無影響。

3 總結(jié)

本研究為WADA擬在檢測窗口中增加的4種刺激劑類禁用物質(zhì)建立了HPLC-ESI-MS/MS檢測方法，并對方法進行了全面考察和驗證。實驗結(jié)果顯示，該方法不僅具有靈敏度高和線性范圍寬等優(yōu)點，還具有很好的精密度和準確度，抗基質(zhì)干擾能力和特異性強也為該方法的實際應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。目前這4種刺激劑已經(jīng)添加到我們實驗室的常規(guī)檢測窗口中。

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[26]World Anti-Doping Agency：WADA Technical Document. http：//www.wada-ama.org.

The Developed LC-MS/MS Method for the Detection of Four Prohibited Stimulants

Ding Jinglin2，Dong Ying1，Zhang Lijuan2，Zhao Jun2，Ma Yanhua1，Yan Kuan1
1 National Anti-Doping Laboratory，China Anti-Doping Agency，Beijing 100029，China
2 Faculty of Science，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China

Dong Ying，Email：dongying@chinada.cn Zhang Lijuan，Email：dazlj@mail.buct.edu.cn

ObjectiveTo develop and validate a liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LCMS/MS）method for the detection of 4 stimulants including amezinium methylsulfate（I），morazone（II），3-ethyl-3-methylglutarimide（III）and metaraminol（IV）to be added to the detection window by World Antidoping Agency.MethodAn equal volume of 5%lead acetate aqueous solution was employed to pre?cipitate the proteins in urine samples.After centrifugation for 10 min，the supernatant was introduced directly into the LC-MS/MS system using positive electrospray ionization with multiple reaction monitor?ing（MRM）mode.ResultsThe limit of detections（LODs）for stimulants I-IV were 0.1，0.5，5 and 0.5 ng/ mL respectively，while the limit of quantifications（LOQs）were 0.3，1.5，15 and 1.5 ng/mL accordingly. The assays were linear（r2＞0.99）over the concentration ranges of 0.3-5000，1.5-3000，15-3000 and 1.5-4500 ng/mL in human urine respectively.The established method also achieved satisfactory results in terms of intra-and inter-day precisions（CV＜10%），accuracies（bias＜9%），matrix effect（98-120%）and specificity at low，medium and high concentration levels.ConclusionsThe developed method is precise，sensitive and accurate with minimum sample preparation.It is a fit-for-purpose approach and has been applied in the National Anti-Doping Laboratory for doping-control sample analysis.

LC-MS/MS，stimulants，method validation，doping control

2016.4.19

董穎，Email：dongying@chinada.cn；張麗娟，Email：dazlj@mail.buct.edu.cn