龔云

1西北師范大學體育學院（蘭州 730070）

2北京師范大學體育與運動學院（北京 100875）

運動疲勞對大鼠紋狀體神經元GLUT3 mRNA和蛋白表達的影響

龔云1，2

1西北師范大學體育學院（蘭州 730070）

2北京師范大學體育與運動學院（北京 100875）

目的：探討運動疲勞后大鼠紋狀體神經元GLUT3mRNA和蛋白表達的適應性變化。方法：Wi?star大鼠40只，任選10只為正常對照組，其余采用多級遞增負荷跑臺運動建立運動疲勞模型，留其成功的20只為疲勞組；測試兩組大鼠血糖、血乳酸、尿素氮及血清胰島素含量，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RTPCR）法測定紋狀體神經元GLUT3mRNA的表達，運用免疫組化法觀測該部神經元GLUT3的蛋白表達情況。結果：力竭后即刻，實驗組大鼠血糖、血清胰島素含量均顯著低于對照組大鼠（P＜0.05），而血乳酸及尿素氮水平顯著高于對照組大鼠（P＜0.05），紋狀體神經元GLUT3mRNA及蛋白的表達均較對照組大鼠顯著上調（P＜0.05）。結論：運動疲勞后大鼠能量基本耗竭，迫使機體以非胰島素依賴方式上調紋狀體神經元GLUT3mRNA和蛋白表達水平來應激，以此延擱由能量衰竭所引起的級聯反應，從而形成一種適應性保護反應來減緩運動性疲勞的發(fā)生。

運動疲勞；紋狀體神經元；GLUT3mRNA和蛋白表達；RT-PCR；免疫組化；大鼠

運動性疲勞中樞機制的研究一直是運動科學熱點問題，而紋狀體在皮質-基底神經節(jié)-丘腦-皮質神經回路中居核心地位，直接參與運動的計劃、啟動和執(zhí)行等。GLUT3作為腦組織神經元葡萄糖轉運的有效載體[1]之一，通過它可將葡萄糖轉運至神經元內，以滿足腦組織能量代謝的需要。有關運動疲勞后紋狀體神經元GLUT3mRNA和蛋白表達的研究目前尚不多見。本實驗通過RT-PCR和免疫組化法，檢測大鼠跑臺運動力竭后即刻紋狀體神經元GLUT3mRNA及蛋白的表達狀況，旨在探尋運動疲勞后紋狀體神經元GLUT3mRNA和蛋白表達的適應性變化規(guī)律，為運動性疲勞中樞機制研究積累分子水平的資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及建模

選取健康雄性Wistar大鼠（購自甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（甘2011-0001））40只（體重175～200g），常規(guī)分籠飼養(yǎng)、自由飲食。所有大鼠適應環(huán)境1周后，在動物跑臺（BCPT-96型，中國杭州錢江科技工貿公司）上進行3天的適應性訓練，淘汰體重過輕或過重以及不適應跑臺訓練的大鼠，后隨機選取10只為對照組（D組）；剩余大鼠以Bedford[2]的方法為基準，對常用的多級遞增負荷跑臺運動方案[3]加以改良，以此建立大鼠運動疲勞模型：坡度均為0°，三級負荷：I級負荷（15 m/min，30 min），II級負荷（20 m/ min，30 min），III級負荷（25 m/min，60 min），前6天每天按不同等級跑一遍，第7天由III級負荷跑至力竭[4]（跑姿由蹬地式轉為伏地式，滯留在跑道上不動，聲、光、電刺激及棍棒驅趕均無效），取建模成功大鼠20只為疲勞組（P組）。

1.2 取材及指標測試

力竭運動后準確稱量每只大鼠體重并尾靜脈取血測試尿素氮（BUN）和血乳酸（Bla），在深麻醉下（0.4%戊巴比妥鈉腹腔注射），腹主動脈取血測定血糖（葡萄糖檢測試劑盒，己糖激酶法）及血清胰島素（放射免疫分析試劑盒，購自濰坊三維生物工程集團有限公司）。開顱剝離整腦后參照鼠腦圖譜[5]取每只大鼠右側紋狀體置于10%福爾馬林中浸泡固定、4℃冰箱過夜后供免疫組化用；另取左側紋狀體，用生理鹽水沖凈積血、濾紙吸干后用錫紙包好，置于液氮罐冷藏供RT-PCR用。

1.3 GLUT3mRNA表達的RT-PCR測定

1.3.1 總RNA 提取及檢測

將左側紋狀體從液氮中取出并復溫，采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）并嚴格按要求進行操作。提取后采用紫外分光光度法、1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行純度、濃度及完整性檢測。

1.3.2 引物設計

表1 GLUT3引物序列

1.3.3 RT-PCR法

RT采用Promega公司試劑盒（具體方法詳見產品說明書）進行。采用上海鼎國生物工程公司試劑盒（西班牙進口分裝）行PCR法，嚴格按要求操作。循環(huán)條件：94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)35次，最后一次可延長至7 min。

1.3.4 結果分析

擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，經JS-380C全自動凝膠成像分析系統觀察并拍照，使用Im?ageJ圖像分析軟件分析灰度值，將同組GLUT3基因擴增產物與β-actin內參進行比較得基因相對表達量，因反色而求其倒數得最終值，以此比較疲勞組與對照組大鼠基因表達量的差異。

1.4 GLUT3蛋白表達的免疫組化檢測

1.4.1 免疫組化

隨機選取各組大鼠5塊右側紋狀體行石蠟切片，切片隔5選1，每塊制成5張切片并常規(guī)脫蠟至水，共計制片50張；后微波抗原修復；3%H2O2去離子水孵育5～10 min，以消除內源性過氧化物酶活性，PBS沖洗3次（每次3 min）；滴加正常山羊血清工作液室溫孵育10～15 min，傾去勿洗；滴加適當比例稀釋的一抗，37℃孵育2～3 h或4℃過夜，PBS沖洗3次（每次3 min）；滴加生物素化二抗工作液，室溫或37℃孵育10～15 min，PBS沖洗3次（每次3 min）；滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，室溫或37℃孵育10～15 min，PBS沖洗3次（每次3 min）；DAB顯色（5～10 min）；蘇木精輕度復染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后封片。

1.4.2 拍照及圖像處理

在Motic數碼顯微鏡（BA400/450，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）下觀察上述免疫組化切片，發(fā)現紋狀體神經元部位呈現棕色陽性染色，提示有GLUT3的表達。在1000倍視野下，每張切片任選1張圖像拍照，并運用Motic Images Advanced 3.1圖像處理軟件隨機對這些照片中2個陽性部位行周長和面積測量，共計測量位點100個。

1.5 數據處理

采用SPSS13.0統計軟件對所測數據進行統計學處理，所有數據均以平均數±標準差表示。組間差異比較采用t檢驗，其中差異顯著水平為P＜0.05，差異非常顯著水平為P＜0.01。

2 結果

2.1 運動疲勞判斷

除行為學觀察大鼠是否疲勞外，還檢測了血尿素氮、血乳酸，以觀測大鼠是否真正達到疲勞狀態(tài)。表2顯示，與對照組比較，疲勞組大鼠體重雖有降低，但差異不顯著（P＞0.05）。而血尿素氮、血乳酸顯著高于對照組（P＜0.05），結合行為學觀察結果：跑姿由蹬地式轉為伏地式，滯留在跑道上不動，聲、光、電刺激及棍棒驅趕均無效，可以判斷大鼠運動疲勞模型的建立是成功的。

表2 運動后大鼠體重、血尿素氮和血乳酸含量

2.2 血糖及血清胰島素

表3顯示，力竭后即刻疲勞組大鼠血糖和血清胰島素濃度顯著低于對照組（P＜0.05）。這表明紋狀體神經元能量幾近耗竭，且與胰島素濃度降低變化一致。

表3 力竭后即刻兩組大鼠血糖、血清胰島素含量

2.3 紋狀體神經元GLUT3基因表達

2.3.1 總RNA 純度、濃度及完整性

將提取的兩組大鼠紋狀體總RNA各取兩份（標記P1、P2為疲勞組，D1、D2為對照組）行瓊脂糖凝膠電泳，28S、18S、5S條帶清晰可見，觀察28S的亮度約是18S的1～2倍；RNA電泳圖譜條帶清晰，說明提取的總RNA無降解，完整性較好（見圖1）。

圖1 紋狀體總RNA瓊脂糖電泳圖

同時，本實驗檢測到兩組大鼠紋狀體總RNA在紫外可見分光光度計下A260/A280的比值均小于2.1，介于正常區(qū)間（1.8～2.1）內，提示總RNA純度較好，無蛋白質污染。見表4。

表4 在紫外可見分光光度計下總RNA的A260／A280比值、濃度及含量

2.3.2 大鼠紋狀體神經元GLUT3mRNA表達

將提取的總RNA在引物作用下，經反轉錄得cD?NA后行PCR擴增并在瓊脂糖凝膠電泳上成像，GLUT3兩條帶介于100～250 bp之間（見圖2），說明我們設計、合成的引物符合本實驗要求。

圖2 兩組RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳成像

從圖2可以看出，β-actin在四組中的表達基本一致，而P1、P2組GLUT3基因表達亮度均強于D1、D2組；用Image J軟件做灰度值掃描，結果見表5。由表5可知，大鼠P1和P2組的GLUT3基因表達最終值分別顯著高于D1、D2組（P＜0.05），提示運動疲勞致使紋狀體神經元GLUT3mRNA的表達明顯增強。

表5 兩組大鼠β-actin和GLUT3的灰度值、相對表達量及最終值（n=5）

2.4 大鼠紋狀體神經元GLUT3蛋白的表達

在Motic數碼顯微鏡（BA400/450）下觀察到兩組大鼠紋狀體神經元膜上GLUT3蛋白均有較強表達，且其免疫反應產物呈棕黃色，陽性細胞輪廓清晰（見圖3）。

圖3 兩組大鼠紋狀體神經元免疫組化染色結果（×1000，bar=50μm）

釆用Motic Image advanced 3.1圖像分析系統對圖中陽性反應部位進行周長和面積測量，結果見表6。免疫組織化學反應結果顯示：兩組大鼠紋狀體神經元GLUT3均呈陽性表達。在1000倍Motic數碼顯微鏡下可見神經元中均有大量棕黃色染色顆粒。疲勞組大鼠紋狀體上陽性反應部位面積及周長均顯著大于對照組（P＜0.05）。

表6 兩組大鼠紋狀體神經元反應部位面積與周長

3 討論

3.1 運動疲勞模型的建立

運動性疲勞是機體的生理過程不能持續(xù)其機能在一特定水平或不能維持預定的運動強度[6]。根據其發(fā)生部位，運動性疲勞可分為外周疲勞和中樞疲勞兩大類。既往研究多集中在外周疲勞方面，隨著研究方法和技術的不斷革新，有關中樞神經系統在運動疲勞產生中的重要作用的實驗[7，8，9]不斷出現，并證實中樞神經系統無法充分驅動運動神經元的興奮性是造成肌肉工作能力下降的主要原因。已知中樞神經系統中，大腦皮層與基底神經節(jié)之間存在三條神經環(huán)路聯系：即直接通路、間接通路和超直接通路。在這些通路聯系中，紋狀體（striatum，STR）始終居承上啟下的核心位置，它不僅接受來自皮層的指令信息，還直接參于隨意運動程序的編制與執(zhí)行，并發(fā)出信息調控下游核團，從而完成隨意運動協調、肌張力控制、姿態(tài)平衡維持和習慣性動作的執(zhí)行等功能[10]?？梢姡y狀體神經元生理功能狀況對于運動性疲勞發(fā)生有著極其重要的作用。

在運動性疲勞發(fā)生機制上，能量衰竭學說得到普遍認可，它認為葡萄糖作為細胞能量代謝的底物，其在胞內的含量直接決定糖酵解和有氧氧化進行的程度以及ATP的產量，以此影響細胞的正常生理功能。葡糖糖是一種極性分子，是維持生理條件下腦代謝活動的重要能量來源，但其不能以自由擴散的方式通過細胞膜脂質雙分子層的疏水區(qū)，需由葡萄糖運載體（GLUT）特殊蛋白介導。負責腦組織神經元葡萄糖轉運的是葡萄糖轉運蛋白3（GLUT3）[11]，它通過介導葡萄糖異化擴散，將外周葡萄糖轉運至神經元內。由此可見，GLUT3的多寡直接影響腦組織能量代謝的底物水平，進而影響中樞神經系統的能量代謝，并可影響運動性疲勞。因此，本實驗聚焦于運動性疲勞對紋狀體神經元GLUT3mRNA及其蛋白質表達的影響，具有重要意義。

綜觀國內外大鼠運動疲勞模型的建立方法，除以跑臺運動為主外，還有轉輪法、游泳法、爬桿爬繩法以及曠野法等[12]。但以遞增負荷跑臺運動建立疲勞模型的具體方法又不盡相同。本實驗以Bedford早年的方案為基礎略加改造，坡度固定、強度遞增，在行為學觀察的同時輔以體重、BUN、Bla指標綜合判定疲勞狀態(tài)。結果發(fā)現：疲勞組大鼠BUN、Bla濃度顯著高于對照組，而體重兩組間并無顯著差異。長時間運動過程中，因能源物質耗竭而使氨基酸分解代謝加強，引起B(yǎng)UN生成過多且血清BUN含量升高[13]；Bla是糖酵解的產物，其產量與運動強度成正比。據此可以推斷，我們建立的大鼠運動疲勞模型是成功的。

3.2 力竭運動后糖代謝特點

在遞增負荷跑臺運動中，機體主要依靠糖的無氧酵解或有氧氧化供能。血糖濃度是機體能量代謝狀況的敏感指標之一。大腦對缺血、缺氧尤為敏感。本實驗結果顯示：大鼠末次跑臺運動至力竭，血糖濃度顯著降低，不能繼續(xù)維持跑臺運動。在同類研究中，與大鼠運動疲勞相關的血糖濃度的變化不盡相同。鄭陸等[14]研究發(fā)現，大鼠負重游泳至力竭時血糖水平升高。朱亞林等[15]在力竭運動試驗中發(fā)現，血糖濃度幾乎沒有發(fā)生改變。楊東升等[16]的實驗發(fā)現，力竭運動過程中大鼠外周血糖濃度隨時間延長而顯著降低，這與本實驗結果基本相同。造成這些不同結果的原因，除與運動強度、運動方案、運動時間及頻次有關，可能也與其自身調節(jié)因素有關。

正常情況下，調節(jié)體內血糖穩(wěn)態(tài)的是胰島素（insu?lin，ISN）和胰高血糖素。胰島素是促合成激素，也是體內唯一的降血糖激素。其作用機制可能為：胰島β細胞分泌的胰島素經血液運輸至靶細胞，與靶膜上的酪氨酸激酶受體結合，進而活化受體底物及磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、或可通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號途徑調控GLUT3轉位，由此引發(fā)即刻作用、快速作用和延緩作用。即刻作用表現為誘使胞質囊泡中的GLUT（葡萄糖轉運體）膜轉位，促使更多的葡萄糖通過易化擴散而內向轉運，從而提高胞內氧化分解供能底物水平并使血糖減低。同時促進肝糖原、肌糖原合成，抑制糖異生。上述不同運動導致血糖下降的原因可能有賴于胰島素的這種調控作用。

有關運動與胰島素分泌關系的研究較多，多認為運動可使機體INS分泌減少，且其降低的程度與運動強度和持續(xù)時間呈負相關[17]。另外，無論實驗對象為鼠或人，運動方式、強度的選擇都使運動后血清胰島素濃度呈下降趨勢。鄭陸等[14]通過放免分析法檢測大鼠負重游泳至力竭時INS的變化，結果顯示力竭狀態(tài)下大鼠INS水平下降。何玉秀等[18]運用免疫法檢測游泳對大鼠INS的影響，結果顯示游泳組大鼠INS濃度顯著低于對照組；朱亞林等[15]以體育系大學生為試驗對象，測得力竭運動后其血清胰島素濃度顯著下降。但也有相反的報道，程守科等[19]用碘放射免疫分析法測得劇烈運動后短時間內INS升高。本實驗運用胰島素放射免疫分析法，測得力竭運動后即刻大鼠INS濃度顯著低于對照組，與先前大部分實驗結果較一致。造成這種狀況的原因可能是力竭運動后大鼠血糖濃度降低，這種低葡萄糖負荷反饋調節(jié)胰島β細胞減少分泌INS，或致其敏感性升高。

3.3 運動性疲勞對紋狀體神經元GLUT3mRNA和蛋白表達的影響

紋狀體神經元中存在大量GLUT3，其重要特征[11]是Km值低，說明GLUT3對葡萄糖有較高的親和力，且屬于非胰島素依賴葡萄糖轉運體。即在葡萄糖及胰島素濃度較低的情況下，GLUT3的轉運效率要高于其它的轉運體。已知GLUTs內在活性的變化有兩種機制：一是GLUT在細胞內及胞膜上的重新分布，此種機制可改變葡萄糖攝取的速率而不涉及GLUT水平的改變，GLUT從細胞內轉位至細胞膜上可以使其活性升高，反之則活性降低；另一機制是GLUT表達水平的改變，涉及mRNA及蛋白質的合成[20]。當細胞受到慢性刺激時主要通過GLUT mRNA及蛋白質上調而增加葡萄糖轉運。長時間的葡萄糖缺乏狀態(tài)會引發(fā)GLUT1mRNA與蛋白質表達的升高。GLUT3的基因表達與神經元的成熟程度及功能活動密切相關，并受雌激素、葡萄糖、鉀離子濃度、NMDA受體激活等因素的調控[20]。陳元新等[21]采用半定量RT-PCR法測定不同再灌注時間大鼠短暫性腦缺血后GLUT3表達變化情況，發(fā)現在缺血缺氧晚期GLUT3mRNA表達下調，而再灌注后缺血側GLUT3mRNA的表達明顯上調。本實驗結果顯示：大鼠跑臺運動至力竭即刻，紋狀體神經元GLUT3mRNA的表達明顯上調。提示大鼠運動性疲勞過程中，紋狀體神經元葡萄糖逐漸耗竭，這種葡萄糖長期缺乏、或者跑臺運動本身作為慢性刺激均可引發(fā)紋狀體神經元上調GLUT3mRNA的表達，屬于上述第二種機制。借此翻譯產生較多蛋白質，并促使其進一步轉位，以增加神經元內葡萄糖供給而延緩能量衰竭速度，是一種代償性的保護反應。

有關GLUT3蛋白表達的研究，多集中在缺血缺氧后腦組織GLUT3蛋白表達的研究上。辛穎等[22]研究發(fā)現，在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后腦內GLUT3蛋白表達明顯減少。楊友等[23]應用免疫組織化學的方法檢測缺氧缺血新生大鼠腦內海馬和皮質部位GLUT3的合成情況，結果顯示GLUT3的合成量隨日齡增加而增高。本實驗運用免疫組織化學法并結合顯微觀測周長和面積數值，發(fā)現大鼠跑臺運動至力竭即刻，紋狀體神經元GLUT3蛋白表達顯著增強，且與該組大鼠GLUT3mRNA的表達增強相一致。出現這種狀況，可能既有上述第一種機制原因，即運動等慢性刺激促使GLUT3從胞內囊泡轉運至胞膜并重新分布，并致其活性升高而造成葡萄糖轉運速率的提高；也有上面第二種機制的原因，即GLUT3mRNA表達增強導致GLUT3蛋白合成增多。

在紋狀體，介導葡萄糖轉運的GLUT3屬非胰島素依賴型。什么因素引發(fā)了胞內信號轉導？哪些因素促使GLUT3囊泡轉位，進而促使GLUT3mRNA表達增強、GLUT3蛋白合成增多？具體通過MAPK途徑、PI3K途徑還是mTOR途徑調控GLUT3 mRNA及蛋白表達？將是今后研究的重點方向。

4 結論

本研究通過遞增負荷跑臺運動建造運動疲勞大鼠模型，力竭只是運動性疲勞的終極階段，疲勞的發(fā)生是動態(tài)的累積過程。其機制可能為：此時葡萄糖已基本耗竭，其可反饋調節(jié)胰島素分泌減少；力竭運動或長期葡萄糖缺乏引發(fā)紋狀體神經元GLUT3mRNA表達上調，促使GLUT3蛋白合成增多并積極轉位，藉此提高葡萄糖的轉運速率，延擱由能量衰竭引發(fā)的級聯反應，從而延緩運動性疲勞的發(fā)生并保護神經元。

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Effect of Sports Fatigue on the Expression of GLUT3mRNA and Protein in Striatal Neurons of Rats

Gong Yun1，2
1 College of Physical Education，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China
2 Physical Education and Sports College，Beijing Normal University，Beijing 100875，China

ObjectiveTo discuss the adaptive changes on the expression of GLUT3mRNA and pro?tein in striatal neurons of rats after sports fatigue.MethodsTen rats were randomly chosen in a nor?mal control group from 40 Wistar rats.The sports fatigue model was built into the rest 30 rats through multistage increasing load treadmill exercises，and 20 Wistar rats with the model successfully built were selected into a fatigue experiment group.The body weight，blood glucose，blood lactic acid，blood urea nitrogen and serum insulin level were tested，and the expression of GLUT3mRNA and pro?tein in striatal neurons were observed using RT-PCR and immunohistochemical method for both groups.ResultsImmediately after exhaustion sports，the average blood glucose and blood serum insulin of the experimental group were significantly lower than the control group（P＜0.05），but the blood lac?tic acid，blood urea nitrogen and the expression of GLUT3mRNA and protein of striatal neurons were significantly higher than those of the control group（P＜0.05）.ConclusionsThe energy was exhausted af?ter sports fatigue in rats，and their bodies are forced to upregulate the expression of GLUT3mRNA and protein of striatal neurons without the involvement of insulin.In this way，the cascade reaction induced by energy exhaustion was delayed，thus forming a kind of adaptive protective reaction to slow the hap?pening of sports fatigue.

sports fatigue，striatum neurons，expression of GLUT3mRNA and Protein，RT-PCR，immu?nohistochemical method，rat

2016.1.26

西北師范大學青年教師科研能力提升計劃項目（編號：SKQNGG-13018）

龔云，Email：gongyun@nwnu.edu.cn