王　銳，郭　麗 ，李永春 ，崔華峰 ，安　娜

調(diào)心安神針法對(duì)室性心律失常模型兔心肌細(xì)胞Cx43磷酸化表達(dá)的影響

王銳1，郭麗1，李永春2，崔華峰1，安娜2

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(濟(jì)南 250011)，E-mail：sdgli1015@sohu.com；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)

摘要：目的觀察調(diào)心安神針法對(duì)室性心律失常模型兔心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白43磷酸化(connexin-43 phosphate，p-Cx43)的影響。方法采用兔耳緣靜脈注射氯化鋇的方法制作室性心律失常模型。40只新西蘭兔隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、針刺組、藥物組，針刺組施以調(diào)心安神針刺法(取穴：靈臺(tái)、神道、雙側(cè)內(nèi)關(guān)、百會(huì))，藥物組給予心律平灌胃。實(shí)驗(yàn)完畢后取兔左心室，Western印跡技術(shù)及激光共聚焦顯微鏡對(duì)p-Cx43的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果模型組p-Cx43表達(dá)最低，藥物組、針刺組略高于對(duì)照組。結(jié)論上調(diào)p-Cx43的表達(dá)可能是該針法治療心律失常的機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：室性心律失常；調(diào)心安神針法；縫隙連接蛋白43磷酸化；兔

心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白43(connexin-43 phosphate，Cx43)與心律失常的發(fā)生有密切的聯(lián)系。Cx43的重構(gòu)，包括Cx43 基因表達(dá)、數(shù)量及磷酸化水平的改變以及重新分布等，會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞間電活動(dòng)的同步性、協(xié)調(diào)性改變，電傳導(dǎo)速度及各向異性的改變等，從而誘發(fā)心律失常。筆者基于多年臨床經(jīng)驗(yàn)，由靈臺(tái)、神道、內(nèi)關(guān)、百會(huì)穴組成調(diào)心安神方，并施行特定的手法操作，治療早搏取得了滿意的療效[1]。本實(shí)驗(yàn)采用兔耳緣靜脈注射氯化鋇的方法制作室性心律失常模型[2]，觀察調(diào)心安神針法對(duì)其心肌細(xì)胞Cx43磷酸化水平的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑新西蘭兔40只，體重1.5 kg～2.0 kg，雌雄各半，由山東省農(nóng)科院提供，合格證號(hào)：SCXK(魯)20090013。一抗：Beta-actin(博奧森，貨號(hào)bs-0061R)，Cx43(博奧森，貨號(hào)bs-8987R)，p-Cx43(博奧森，貨號(hào)bs-3098R)；二抗：山羊抗兔(Goat anti-rabbit IgG/HRP，博奧森，貨號(hào)bs-0295G-HRP)，山羊抗兔488熒光二抗(Invitrogen公司，貨號(hào)A11034)。

1.2分組與建模40只新西蘭兔按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、針刺組、藥物組，每組10只。10%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉(心律平組給藥1 h后)，仰位固定于兔固定臺(tái)上。將針形電極插入四肢遠(yuǎn)端皮下，選擇標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)，待心電圖穩(wěn)定后沿耳緣靜脈注射20%氯化鋇10 mL/kg造成室性心律失常模型。藥物組給予心律平40 mg/kg灌胃，其余各組不予處理。

1.3針刺方法參照中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸專業(yè)委員會(huì)制訂的“動(dòng)物針灸穴位圖譜”，針刺組于造模后即刻給予針刺內(nèi)關(guān)、百會(huì)、靈臺(tái)、神道。靈臺(tái)、神道穴位于背部正中線上，分別為胸椎六、七及五、六棘突間，向上斜刺5 mm，用震顫法快速小幅度行針1 min后起針；百會(huì)穴向后平刺5 mm；內(nèi)關(guān)穴位于前臂下1/6折點(diǎn)處內(nèi)側(cè)，橈、尺骨間隙中，雙側(cè)內(nèi)關(guān)分別直刺5 mm，行針1 min后接電針治療儀，疏密波，刺激強(qiáng)度以家兔上肢出現(xiàn)輕微顫動(dòng)為度。各組均觀察體表心電變化，留針至恢復(fù)正常心律后停止記錄，拔出針電極，立即處死動(dòng)物，取左心室。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1Western blot技術(shù)方法檢測(cè)Cx43、p-Cx43將樣品加入到PAGE的加樣孔中，80 V電泳30 min左右，待溴酚藍(lán)標(biāo)記的樣品帶進(jìn)入分離膠后，改至100 V繼續(xù)電泳，直至溴酚藍(lán)出膠后卸膠。Bio-Rad 濕法轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將蛋白從PAGE膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，冰水浴中100 V轉(zhuǎn)移2 h。將膜放置于脫脂牛奶封閉緩沖液中，室溫下置于搖床上孵育1 h。棄去封閉液，按推薦的稀釋比配制針對(duì)各蛋白的一抗加到膜上，室溫孵育2 h或4 ℃過夜；用洗滌液洗膜4次，每次10 min。再按推薦比例稀釋HRP偶聯(lián)二抗，加入到膜上，室溫孵育45 min；用洗滌液洗膜4次，每次10 min。配制ECL發(fā)光試劑，均勻鋪于膜上，反應(yīng)2 min后吸去，用Fusion FX化學(xué)發(fā)光成像儀掃描圖像并分析。

1.4.2制備冰凍切片和激光共聚焦顯微鏡觀察p-Cx43分布取左心室心肌組織，組織切片與心肌縱軸平行，制備8 μm厚的冰凍切片，丙酮-20℃固定5 min，以備免疫熒光標(biāo)記。切片用雙蒸水漂洗3次，每次漂洗2 min，然后用0.25%Triton X-100處理10 min，經(jīng)PBS漂洗后用10%羊血清白蛋白封閉20 min，用1∶100稀釋的Cx43和p-Cx43多克隆抗體4℃孵育過夜，用PBS漂洗3次，每次漂洗2 min，滴加1∶400稀釋的IgG-FITC二抗，室溫閉光孵育2 h，用PBS漂洗3次，每次5 min，甘油封片。當(dāng)天用激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Zeiss，LSM780)觀察，用488 nm波長(zhǎng)激發(fā)FITC，發(fā)生光為519 nm綠光。每張切片取(4～6)個(gè)視野，選擇細(xì)胞縱行走向區(qū)域進(jìn)行觀察并拍照。

2結(jié)果

2.1Western blot檢測(cè)結(jié)果對(duì)照組Cx43蛋白表達(dá)最高，模型組最低，藥物組略高于針刺組；模型組p-Cx43表達(dá)最低，針刺組、藥物組略高于對(duì)照組。詳見圖1。

圖1Vesternblot檢測(cè)結(jié)果

2.2免疫熒光染色綠色熒光斑標(biāo)記p-Cx43，藍(lán)色標(biāo)記細(xì)胞核。結(jié)果顯示，對(duì)照組熒光斑形態(tài)清晰，分布均勻，在細(xì)胞端端連接處為主；模型組熒光斑明顯數(shù)量減少，形態(tài)相對(duì)粗亂，端端分布減少，呈不均一分布；針刺組及藥物組熒光斑數(shù)量增多，改變較少。詳見圖2～圖5。

圖2對(duì)照組免疫熒光染色圖3模型組免疫熒光染色圖4針刺組免疫熒光染色圖5藥物組免疫熒光染色

3討論

正常情況下的心肌細(xì)胞間存在著磷酸化和去磷酸化兩種狀態(tài)的Cx43，但僅磷酸化的Cx43 構(gòu)成有功能的縫隙連接通道[3]。持續(xù)缺血能夠?qū)е铝姿峄疌x43水平下降而去磷酸化的Cx43水平升高，同時(shí)各種心律失常的發(fā)生率( 如室性期前收縮、室性心動(dòng)過速和心室顫動(dòng)等) 明顯增加，表明缺血心肌中Cx43 的去磷酸化與心律失常的發(fā)生有關(guān)[4-5]；近年合成的抗心律失常多肽即通過上調(diào)Cx43的磷酸化水平而發(fā)揮抗心律失常作用[6]。本研究表明，耳緣靜脈注射氯化鋇造成兔室性心律失常模型，其左心室心肌細(xì)胞Cx43及p-Cx43表達(dá)均下降，調(diào)心安神針法及心律平皆能上調(diào)二者的表達(dá)，且對(duì)于p-Cx43的上調(diào)作用尤為明顯。

心律平作為臨床上最常用的抗心律失常藥物，有輕度β-受體阻斷作用和輕微的鈣通道阻滯作用[7]。這可能是心律平通過降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度， Ca2+依賴性蛋白酶如蛋白激酶A、C、G(PKA、PKC、PKG)等都會(huì)受到抑制，由于這些蛋白激酶都參與連接蛋白的磷酸化過程[8]，從而增加了Cx43及p-Cx43的表達(dá)。

Cx43可能是構(gòu)成穴位的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，針刺后穴位處Cx43表達(dá)增加，激活了間隙連接通道，促進(jìn)了Ca2+、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、三磷酸肌醇(IP3)或其他小分子物質(zhì)快速傳遞至相應(yīng)臟器，形成了“氣至病所”的物質(zhì)基礎(chǔ)[9]，進(jìn)而調(diào)節(jié)臟器功能。調(diào)心安神針法治療室性心律失常取得較好的臨床療效，對(duì)于Cx43的調(diào)節(jié)，包括增加Cx43的表達(dá)及促進(jìn)Cx43磷酸化，可能即是其作用機(jī)制之一。

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(本文編輯王雅潔)

Effect of Tiaoxin Anshen Acupuncture on the Expression of Myocardial Connexin-43 Phosphate in Rabits with Ventricular Arrhythmia

Wang Rui，Guo Li，Li Yongchun，Cui Huafeng，An Na

The Affiliated Hospital，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250011，Shandong，China

Abstract：ObjectiveTo observe the effect of Tiaoxin Anshen acupuncture on the expression of myocardial connexin-43 phosphate(p-Cx43) in rabits with ventricular arrhythmia.MethodsForty rabits were randomly divided into four groups： the control group， the model group， the acupuncture group treated with Tiaoxin Anshen acupuncture(points selected Lingtai points， Shendao points， Neiguan points on both sides and Baihui points)，and the propafenone group treated with propafenone by intragastric.Rabits of the acupuncture group received treatment of.Left ventricle of all the rabbits were taken out to test p-Cx43 protein expression by western bolt and laser scanning confocal microscope.ResultsThe expression of p-Cx43 was lowest in the model group.The expressions of p-Cx43 in the acupuncture group and the propafenone group were slightly higher than that in the control group.ConclusionThe up-regulating the expression of p-Cx43 might be one of the therapeutic target spots of Tiaoxin Anshen acupuncture for ventricular arrhythmia.

Key words：Tiaoxin Anshen acupuncture；ventricular arrhythmia；connexin-43 phosphate；rabits

中圖分類號(hào)：R541R245

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.10.009

文章編號(hào)：1672-1349(2016)10-1085-03

(收稿日期：2015-07-01)