孫寒靜，劉志和，吳艷華，喻騰云

川芎嗪對急性腦梗死大鼠CD40/CD40L信號通路的影響及機制探討

孫寒靜，劉志和，吳艷華，喻騰云

廣州市紅十字會醫(yī)院/暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣州紅十字會醫(yī)院(廣州 510000)，E-mail：zhangjie567@hotmail.com

摘要：目的研究不同劑量川芎嗪對急性腦梗死SD大鼠血清及腦組織中CD40、CD40L含量的影響。探討川芎嗪治療急性腦梗死過程中CD40/CD40L信號通路干擾的作用機制。方法采用改良Zea Longa法制作急性腦梗死模型大鼠，檢測不同劑量川芎嗪治療前后大鼠神經(jīng)功能變化，外周血sCD40L水平及CD40、CD40L在腦組織中的表達。結(jié)果治療后大鼠神經(jīng)功能改善明顯優(yōu)于模型組(P<0.05)，其中高、中劑量治療組神經(jīng)功能改善明顯優(yōu)于低劑量組(P<0.05)；治療組外周血中SCD40L水平和腦組織中CD40、CD40L的表達較模型組均明顯降低(P<0.01)；高、中劑量治療組血清SCD40L水平和腦組織中CD40、CD40L的表達低于低劑量組(P<0.05)，高、中劑量組之間相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論川芎嗪能有效改善神經(jīng)功能損傷，其治療效用可能與CD40/CD40L信號通路下調(diào)其介導(dǎo)的炎癥凋亡分子生物學(xué)因素有關(guān)。

關(guān)鍵詞：急性腦梗死；川芎嗪；CD40/CD40L；信號通路干擾；作用機制；神經(jīng)損傷；大鼠

急性腦梗死(ACI)是臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，屬于中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，作為“風(fēng)、癆、臌、膈”古代四大疑難病證之首，具有發(fā)病率高、致死率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高及治療費用高等臨床特點。據(jù)統(tǒng)計2010年我國死于腦卒中的病人近170萬，缺血性腦梗死占腦血管意外事件的80%[1]。腦動脈粥樣硬化是急性腦梗死最重要的病理學(xué)基礎(chǔ)，在病變過程中，斑塊的形態(tài)特征及穩(wěn)定性與腦梗死的發(fā)生關(guān)系密切。有研究表明[2]，CD40/CD40L信號通路可刺激斑塊內(nèi)單核巨噬細胞分泌MMP(尤其是MMP-8和MMP-9，通過降解基質(zhì)成分，使斑塊承受血流剪切力和機械壓力的能力下降，最終導(dǎo)致斑塊破裂。本研究以急性腦梗死模型SD大鼠為研究對象，研究不同濃度川芎嗪對模型大鼠血清及腦組織中CD40及CD40L濃度的變化，探討CD40/CD40L信號傳導(dǎo)通路對急性腦梗死的損傷作用機制及最佳治療劑量，為臨床提供理論依據(jù)及指導(dǎo)用藥。

1材料與方法

1.1動物分組SD大鼠60只，雄雌各半，體重250 g～300 g，由廣東省中醫(yī)院實驗動物中心提供，許可證號：SYXK9(粵)2008-0094。隨機分為陽性對照組、模型對照組、川芎嗪高劑量組、川芎嗪中劑量對照組、川芎嗪低劑量對照組及空白對照組(單純手術(shù)不加線)，每組10只，雄雌各半。

1.2主要藥物及試劑川芎嗪注射液(規(guī)格：40 mg/2 mL，國藥批號：H20054485，上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司)；阿司匹林腸溶片(規(guī)格：100 mg/片，拜耳醫(yī)藥保健公司)；尼莫地平片(規(guī)格：20 mg/片，山東新華制藥股份有限公司)；10%水合氯醛(由本院實驗室提供)；生理鹽水(由本院實驗室提供)；枸櫞酸鈉注射液；Elisa試劑盒(美國R&DSystem公司提供，購自晶美生物工程有限公司)；濃縮型兔抗人CD40及CD40L單克隆抗體(一抗)、酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物(二抗，購自Abcam公司)；即用型免疫組化EliVisionTM plus試劑盒、DAB顯色試劑盒及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS；購自福州邁新生物技術(shù)有限公司)。sCD40L的濃度單位為ng/mL，靈敏度0.156。

1.3主要儀器漁線(日本釣魚人株式會社有限公司)、低速控溫離心機、醫(yī)用低溫電冰箱、水浴箱、酶標(biāo)儀、切片機(德國ZEISS公司)、光學(xué)顯微鏡(日本)。

1.4模型制備參照改良的Zea Longa法制備一側(cè)大腦中動脈阻塞(MCAO)動物模型[3]。術(shù)前準(zhǔn)備及手術(shù)步驟：術(shù)前禁食不禁水12 h，隨后稱重計數(shù)。大鼠以10%水合氯醛腹腔注射(30 mg/100 g)后，固定于操作臺上，常規(guī)消毒后，沿頸部正中線切開，分離皮下組織，分離出右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈遠心端和近心端，并在兩節(jié)間把血管剪斷，夾閉頸總動脈和頸內(nèi)動脈，從頸外動脈的游離端剪一小切口，將漁線插進頸內(nèi)動脈(18.5±0.5)mm，縫合傷口，缺血2 h后再灌。造模大鼠清醒后，按照Zea Longa進行神經(jīng)功能評分[3]，0分：無神經(jīng)病學(xué)征象；1分：提尾時病灶對側(cè)前肢不能完全伸直；2分：向癱進行瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)征象；3分：向病灶對側(cè)跌倒；4分：無自發(fā)活動及意識障礙者。神經(jīng)功能評分為1分～3為實驗所需，其余棄之不用。

1.5劑量設(shè)計依據(jù)鹽酸川芎嗪注射液在治療急性腦梗死時，臨床使用劑量為120 mg，換算成大鼠給藥劑量為10.8 mg/kg(按成人體重為70 kg折算，并擬定為10 mg/kg計量，利于實驗注射取量)。分別按大鼠1倍、2倍、4倍臨床等效劑量為實驗使用劑量，即依次按川芎嗪注射液10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg擬定給藥，分別為川芎嗪低、中、高劑量組。

1.6藥物制備及給藥方法用蒸餾水配成含阿司匹林2.2 mg/mL，含尼莫地平0.875 mg/L的混懸液，置于4℃冰箱備用。 除模型對照組和空白對照組予以生理鹽水0.5 mL腹腔注射外，治療組中的高、中、低劑量組及陽性對照組，在缺血后2 h統(tǒng)一予阿司匹林尼莫地平混懸液10 mL/kg灌胃，并按低、中、高及陽性對照組，分別予川芎嗪注射液按10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、生理鹽水0.5 mL腹腔注射，每日一次，連用3 d。給藥組均按人鼠體表換算。

1.7取材動物脫臼處死，取出大腦，冰凍的PBS清洗組織表面血液，取缺血側(cè)大腦的顳葉組織，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，所有蠟塊均連續(xù)切片為4 μm，每個蠟塊切兩張，進行HE染色及免疫組織化學(xué)檢測。取大鼠股動脈血，抗凝管收集之后2 000 r/min離心15 min，用移液器吸取中間黃衣層放置于EP管內(nèi)，放入-20 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.8觀察指標(biāo)及方法待動物蘇醒后對大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分，并記錄實驗數(shù)據(jù)。

1.8.1大鼠血清中sCD40L測定采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定(Elisa)，所有標(biāo)本收集后由專業(yè)人員測定(嚴格按照說明書)。

1.8.2大鼠腦組織病理學(xué)觀察將已制備好的石蠟切片，進行HE染色，在光鏡下進行觀察。

1.8.3炎性因子CD40、CD40L在腦組織中的表達采用免疫組化法。將已制備好的石蠟切片，微波修復(fù)抗原，3%H2O2液室溫孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶活性，PBS沖洗，加入一抗(工作濃度為1：100)，4℃孵育過夜，PBS沖洗，加入聚合物增強劑，室溫孵育20 min，PBS沖洗，加入二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗后，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，0.1%鹽酸分化，PBS返藍，常規(guī)脫水透明，中性樹脂封固。每批次均設(shè)陽性對照片(試劑公司提供的空白石蠟切片)1張，PBS液取代一抗作陰性對照。結(jié)果判定：以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色至深棕色顆粒為陽性細胞。陽性細胞必須符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①細胞結(jié)構(gòu)清晰；②陽性顆粒定位準(zhǔn)確；③著色明顯高于背景，對比清楚。①按顯色細胞數(shù)記分，陽性細胞數(shù)<1/3為1分，陽性細胞數(shù)1/3～2/3為2分，陽性細胞數(shù)>2/3為3分。②按細胞顯色深淺記分，無陽性反應(yīng)細胞為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。積分數(shù)=A×B，A×B=0判斷為(-)，A×B=1～2判斷為(+)，A×B=3～4判斷為(++)，A×B=6～9判斷為(+++)。至少隨機觀察5～10個高倍鏡視野(放大倍數(shù)為×400)。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)功能缺損評分(NSS)術(shù)后大鼠蘇醒后，要求頸部傷口無滲血，無大鼠死亡。手術(shù)后，各組大鼠與空白對照組比較，各組大鼠均表現(xiàn)出不同程度的神經(jīng)功能缺損，提尾時可見病灶對側(cè)前肢不能完全伸直且緊貼于胸壁，部分大鼠行走時可見向癱瘓側(cè)進行旋轉(zhuǎn)征象，甚至跌倒不起。除空白對照組外，各組神經(jīng)功能評分多在(1～3)分。

治療前，空白對照組與各組神經(jīng)功能障礙評分比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，動物造模成功；除空白對照組外，各組間評分對比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。治療后，模型組與空白對照組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評分增加，除空白對照組，與模型組比較，各組評分均有所減少(P<0.05或P<0.01)。治療后高、中劑量組的神經(jīng)損傷評分低于模型組(P<0.01)。詳見表1。

表1　各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較(±s)分

2.2大鼠血清中sCD40L的表達空白對照組與其他各組相比，sCD40L表達最弱，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；除空白對照組外，陽性對照組與川芎嗪低劑量組比較，血清中sCD40L表達無統(tǒng)計學(xué)意義，與余下各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；川芎嗪低劑量組分別與川芎嗪高劑量組、川芎嗪中劑量組比較，sCD40L表達偏高(P<0.05)；川芎嗪高劑量組與川芎嗪中劑量組比較，sCD40L在血清中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2　SD大鼠血清中sCD40L表達比較(±s)

2.3腦組織病理學(xué)觀察空白對照組腦組織無缺血性表現(xiàn)，組織形態(tài)正常，細胞排列、結(jié)構(gòu)形態(tài)規(guī)整，基本沒有細胞的病變及壞死現(xiàn)象。模型組缺血區(qū)細胞數(shù)量減少，細胞排列松散，細胞間隙增寬，神經(jīng)元胞漿及胞膜形態(tài)不規(guī)則、邊界不清，呈缺血樣病理改變，可見細胞核明顯的固縮，空泡樣變性壞死數(shù)量較多。陽性對照組可見細胞排列紊亂，神經(jīng)元較少，細胞核有固縮和空泡現(xiàn)象，細胞間隙部分增寬，與低劑量組形態(tài)學(xué)改變相當(dāng)?？瞻讓φ?、低劑量兩組與模型組對比，神經(jīng)元細胞稍有增多，固縮和空泡樣變稍減少，細胞間隙改善不明顯。中、高劑量兩組與模型組對比，神經(jīng)細胞排列層次稍欠整齊，固縮、空泡樣變和細胞間隙明顯改善，與低劑量組對比可見神經(jīng)細胞壞死數(shù)量明顯減少。高劑量組總體跟中劑量組相差不大，小部分出現(xiàn)壞死神經(jīng)細胞沒有中劑量組的效果明顯。

2.4川芎嗪對SD大鼠腦組織CD40、CD40L表達的影響模型組與空白對照組比較，大鼠腦組織CD40、CD40L含量均增加，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與低劑量組比較，高、中劑量組CD40、CD40L含量減少幅度較大，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組與中劑量比較，高劑量大鼠腦組織CD40、CD40L略高于中劑量組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3　各組大鼠腦組織中CD40、CD40L的表達比較(±s)

3討論

CD40/CD40L是一對互補跨膜糖蛋白，分別屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)及腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員，作為炎性和免疫反應(yīng)中的重要信號傳導(dǎo)通路，參與調(diào)控免疫、炎癥、高凝等多種病理狀態(tài)，可激活炎癥反應(yīng)、活化血小板，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙等[4]。由于CD40蛋白分子結(jié)構(gòu)本身在信號傳導(dǎo)過程中表達的活性較低，只有與CD40L結(jié)合活化后，使得CD40化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)變，活性增強，可促進單核細胞的黏附、特定的轉(zhuǎn)錄因子激活、趨化因子的分泌等。而轉(zhuǎn)錄因子的活化、單核細胞的黏附及趨化因子都可造成炎癥反應(yīng)，對腦組織造成損傷，反過來這些炎性介質(zhì)也可上調(diào)CD40及CD40L的表達，加重腦缺血損傷。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦血管病上調(diào)了CD40/CD40L系統(tǒng)表達，引起炎性因子釋放增多，最終引起動脈硬化斑塊不穩(wěn)定，進而破裂、脫落，促使腦梗死的形成[5]。另一方面，腦組織缺血缺氧后，梗死灶的腦組織產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì)，釋放細胞毒性物質(zhì)和自由基，誘導(dǎo)中性粒細胞和內(nèi)皮細胞的黏附，介導(dǎo)缺血瀑布反應(yīng)[6]。川芎嗪作為臨床經(jīng)驗用藥，能透過血腦屏障，具有擴張腦血管、增加血流量、降低耗氧量、改善微循環(huán)、抑制血小板聚集等作用[7]。

本研究運用川芎嗪結(jié)合急性腦梗死發(fā)病過程中病理機制，從多角度、多層次、多靶點研究治療急性腦梗死時所具有抗炎癥作用。模型組比空白對照組的CD40、CD40L表達明顯增多，川芎嗪各治療組比陽性對照組的CD40、CD40L表達明顯減少，且差異都有統(tǒng)計學(xué)意義。證實川芎嗪可通過抑制CD40/CD40L炎癥信號通路傳導(dǎo)，抑制一系列炎癥反應(yīng)，起到了保護腦組織的作用。川芎嗪對急性腦梗死病人的CRP水平變化研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪能有效降低C反應(yīng)蛋白(CRP)含量[8]。CRP作為炎性因子，能夠激活并下調(diào)CD40/CD40L信號傳導(dǎo)通路。本實驗也證明了川芎嗪對急性腦缺血模型大鼠腦組織具有保護作用。

川芎嗪能降低腦梗死急性期的神經(jīng)缺損評分，改善神經(jīng)損傷癥狀，提高生存質(zhì)量及治療功效?？赡芘c其抑制缺血局部炎癥反應(yīng)、減少炎癥因子的釋放有關(guān)。

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(本文編輯王雅潔)

基金項目：廣東省中醫(yī)藥管理局建設(shè)中醫(yī)藥強省科研基金資助項目(No.20121003)；廣州市衛(wèi)生局資助項目(No.2013A011037)

中圖分類號：R743.3R289.5

文獻標(biāo)識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.10.010

文章編號：1672-1349(2016)10-1087-04

(收稿日期：2016-02-24)