朱永娜，張　菁，蘇圣哲，李　頌

(安徽醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 安徽省口腔疾病研究中心實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥　230032)

◇臨床醫(yī)學(xué)◇

cAMP信號通路對根尖乳頭干細(xì)胞增殖的影響

朱永娜，張菁，蘇圣哲，李頌

(安徽醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 安徽省口腔疾病研究中心實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230032)

摘要：目的 探討cAMP信號通路對根尖乳頭干細(xì)胞(SCAP)增殖、遷移的影響。方法 酶消化法培養(yǎng)細(xì)胞；礦化誘導(dǎo)液和成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)細(xì)胞后，茜素紅和油紅O染色鑒定細(xì)胞多分化潛能；分別用不同濃度的cAMP信號通路激活劑Forskolin和抑制劑H-89處理細(xì)胞；MTT和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的增殖能力及遷移能力。結(jié)果 礦化和成脂誘導(dǎo)液分別誘導(dǎo)SCAP后，茜素紅和油紅O染色顯示有鈣鹽沉積及脂滴形成。低濃度的Forskolin(2.5 μmol·L-1)促進(jìn)細(xì)胞增殖，高濃度的Forskolin(10 μmol·L-1,20 μmol·L-1)則發(fā)揮相反作用。用低濃度H-89(5 μmol·L-1,10 μmol·L-1)抑制cAMP信號后,SCAP的增殖能力增加,而高濃度H-89(20 μmol·L-1)在MTT第3天時促進(jìn)細(xì)胞增殖，第5天和第7天時抑制該細(xì)胞增殖。遷移結(jié)果顯示高濃度Forskolin(10 μmol·L-1,20 μmol·L-1)抑制SCAP的遷移，而H-89( 5 μmol·L-1,10 μmol·L-1)促進(jìn)該細(xì)胞的遷移。結(jié)論 cAMP信號通路對根尖乳頭干細(xì)胞增殖、遷移有一定的調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞：牙乳頭；間質(zhì)干細(xì)胞；3′,5′-環(huán)AMP磷酸二酯酶類；信號傳導(dǎo)

根尖乳頭干細(xì)胞是2006年學(xué)者發(fā)現(xiàn)的一種新的成體間充質(zhì)干細(xì)胞。2008年學(xué)者報道切除小型豬的根尖乳頭后，牙根發(fā)育受限[1]。2014印度學(xué)者報道，把根尖乳頭干細(xì)胞(Stem cell from the apical papilla,SCAP)移植到牙根未完全發(fā)育伴根尖炎的患牙根管內(nèi)后，患牙根尖病損愈合同時牙根繼續(xù)發(fā)育[2]；另外文獻(xiàn)報道一些因素如NFIC可以通過影響SCAP而影響牙根發(fā)育[3-4]。以上表明SCAP可以調(diào)節(jié)牙根發(fā)育。自我更新能力是干細(xì)胞的一個重要特征。作為一種新的干細(xì)胞，SCAP自我更新能力即增殖、遷移能力較牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞強(qiáng)[5-6]。但是影響SCAP增殖、遷移的因素還不清楚。而信號通路對細(xì)胞的增殖、遷移有一定的調(diào)節(jié)作用。目前關(guān)于調(diào)節(jié)SCAP增殖、遷移的相關(guān)信號通路的報道較少。

細(xì)胞外刺激如甲狀旁腺激素、腎上腺素等激活細(xì)胞內(nèi)的cAMP(Cyclic adenosine monophosphate),后者作用于其受體即環(huán)磷腺苷酸依賴的蛋白激酶(protein kinase A)，然后活化的PKA激活下游信號分子，從而發(fā)揮該信號通路對細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用[7-8]。該信號通路分布于多種細(xì)胞中，同時本課題前期研究表明SCAP中也存在該信號通路[8-9]。cAMP信號通路能夠調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖、遷移，如胚胎干細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞等[10-12]。cAMP信號還參與其他信號對細(xì)胞的調(diào)節(jié)，如NF-κB(nuclear factor-kappa B)等。而NF-KB又調(diào)節(jié)SCAP的增殖、遷移[13-14]。因此我們推測cAMP信號對SCAP的增殖、遷移也有一定的調(diào)節(jié)。但是還未見cAMP信號調(diào)節(jié)SCAP增殖、遷移的相關(guān)報道。因此本課題探討體外條件下cAMP信號通路對SCAP增殖、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning-Costar，美國)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo,美國)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(DMI3000B，Leica，日本)；紫外分光光度儀(Shimadzu,日本)；搖床(上海智城)。α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibico，美國)；I型膠原酶，Dispase酶，DMSO，MTT， Forskolin，H-89(Sigma，美國)；茜素紅，油紅O(sigma，美國)。

1.2方法

1.2.1SCAP的分離培養(yǎng)經(jīng)患者同意，收集安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院14 ～ 18歲患者因正畸或阻生需要拔除的牙根發(fā)育未超過根長2/3的健康第三磨牙。分離根尖軟組織，3 g·L-1I型膠原酶和4 g·L-1Dispase酶消化細(xì)胞，用20% FBS的α-MEM培養(yǎng)原代細(xì)胞[3]。 傳代后培養(yǎng)液FBS調(diào)整為10%。

1.2.2SCAP的鑒定取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，以1×105個/孔接種于6孔板。然后按照張菁等[6]人方法分別誘導(dǎo)細(xì)胞向成脂細(xì)胞及成骨細(xì)胞分化，然后油紅O和茜素紅染色鑒定細(xì)胞分化能力。

1.2.3cAMP對細(xì)胞增殖的影響取生長狀態(tài)良好的第3代SCAP,以4×103/孔種96孔板，F(xiàn)BS調(diào)整為2%。待細(xì)胞貼壁后饑餓24 h。然后更換含不同濃度的激活劑Forskolin(2.5,10,20 μmol·L-1)和抑制劑H-89(5,10,20 μmol·L-1)培養(yǎng)液，同時設(shè)立對照組，每組設(shè)立5個復(fù)孔。然后參照陳娜等[15]方法于1、3、5、7 d MTT測各組細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4cAMP對細(xì)胞遷移的影響取生長狀態(tài)良好的第3代SCAP,以2×105/孔種6孔板。待細(xì)胞融合至孔底的40%時饑餓24 h。然后更換含不同濃度的Forskolin(10、20 μmol·L-1)和H-89(5、10 μmol·L-1)培養(yǎng)液，同時設(shè)立對照組。待細(xì)胞融合至孔底的90%時，用200 μL的槍頭于孔底劃痕。然后在劃痕的0、10、20 h鏡下拍照，測量劃痕處無細(xì)胞區(qū)的寬度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1 SCAP的分離培養(yǎng)培養(yǎng)3～6 d時鏡下可見游離出的梭形原代細(xì)胞。待原代細(xì)胞融合至孔底的80%時，按1∶3傳代。

2.2SCAP的鑒定用成脂條件培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞五周后，油紅O染色見脂滴形成如圖1(A)。另外該細(xì)胞礦化誘導(dǎo)2周后茜素紅染色，發(fā)現(xiàn)鈣鹽沉積如圖1(B)。

圖1SCAP的鑒定

2.3cAMP對細(xì)胞增殖的影響與對照組相比，用2.5 μmol·L-1的Forskoin刺激SCAP，該細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，而當(dāng)Forskoin濃度為10、20 μmol·L-1時則該細(xì)胞的增殖能力減弱。用 5、 10 μmol·L-1的H-89處理SCAP后，該細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。而用20 μmol·L-1的H-89處理SCAP后，在MTT第3天時促進(jìn)該細(xì)胞增殖，在第5天及第7天時抑制細(xì)胞的增殖如圖2。

2.4cAMP對細(xì)胞遷移的影響與對照組相比，用10、20 μmol·L-1的Forskoin處理SCAP后，該細(xì)胞的遷移能力降低。5、10 μmol·L-1的H-89處理SCAP后，該細(xì)胞遷移能力提高如圖3。遷移率 = (原劃痕寬度 - 現(xiàn)劃痕寬度) / 原劃痕寬度 × 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

注：CON為對照組，F(xiàn)OR2.5是Forskolin2.5 μmol·L-1，F(xiàn)or10是Forskolin 10 μmol·L-1，F(xiàn)or20是Forskolin 20 μmol·L-1,H-5是H-89 5 μmol·L-1，H-10是H-89 10μmol·L-1，H-20是H-89 20 μmol·L-1(*P<0.05，**P<0.01)。

圖2cAMP信號通路對SCAP增值的影響

3討論

學(xué)者發(fā)現(xiàn)作為牙組織工程中新的種子細(xì)胞，SCAP增殖及遷移能力較強(qiáng)[5-6]。但是調(diào)節(jié)SCAP增殖和遷移的機(jī)制還不太清楚。信號通路是影響干細(xì)胞增殖的因素之一[14]。作為一種常見的信號通路，cAMP不僅調(diào)節(jié)干細(xì)胞的分化也能調(diào)節(jié)干細(xì)胞的增殖[14,16]。本課題組前期研究cAMP信號通路影響SCAP的分化，但cAMP是否對SCAP的增殖、遷移有一定的影響尚不清楚。本課題研究cAMP對SCAP增殖、遷移的影響，可以為SCAP在牙組織工程學(xué)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

Forskolin是cAMP信號的的激活劑，通過提高細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平激活該信號通路[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用低濃度的Forskolin(2.5 μmol·L-1)處理SCAP后，SCAP的增殖能力增強(qiáng)。而用高濃度的Forskolin(10 、20 μmol·L-1)處理SCAP后，該細(xì)胞的增殖能力減弱。2008年文獻(xiàn)報道激活骨髓間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的cAMP后，影響該細(xì)胞的增殖，并且低濃度激活劑促進(jìn)細(xì)胞增殖，而當(dāng)激活劑濃度較高時則發(fā)揮相反作用[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)cAMP低濃度激活劑促進(jìn)SCAP增殖，而高濃度激活劑抑制該細(xì)胞增殖，與文獻(xiàn)報道一致。PKA是cAMP的下游信號，由調(diào)節(jié)亞基和催化亞基組成，主要有PKAⅠ和PKAⅡ兩種類型[18]。細(xì)胞外信號激活細(xì)胞內(nèi)的cAMP,活化的cAMP激活下游的PKAⅠ和PKAⅡ，當(dāng)活化的PKAⅠ和PKAⅡ水平不同時，對細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用不同[18]。在間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)PKAⅠ活化水平高時抑制該細(xì)胞增殖，而當(dāng)PKAⅡ活化水平較高時促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。本實(shí)驗(yàn)中不同濃度的Forskolin對SCAP增殖的調(diào)節(jié)作用不同，可能因?yàn)椴煌瑵舛鹊腇orskolin處理SCAP后，對細(xì)胞內(nèi)PKAⅠ和PKAⅡ活化水平不同。另外本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用Forskolin(10、20 μmol·L-1)處理SCAP后，細(xì)胞的遷移能力降低。2015年文獻(xiàn)報道用10 μmol·L-1的Forskolin激活黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)的cAMP信號通路后，抑制了該細(xì)胞則遷移[19]。該報道與本研究結(jié)果一致。

H-89通過抑制PKA，抑制cAMP信號通路。用5、10 μmol·L-1的H-89處理SCAP后，促進(jìn)SCAP的增殖,當(dāng)用20 μmol·L-1的H-89處理SCAP，隨著時間增加，細(xì)胞增殖能力減弱。H-89對SCAP增殖的調(diào)節(jié)有一定的濃度依賴性及時間依賴性。在血管平滑肌細(xì)胞中，用PKA抑制劑處理該細(xì)胞后，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[20]。H-89抑制抑制SCAP內(nèi)的cAMP信號后，該細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)。

本研究發(fā)現(xiàn)用cAMP信號通路激活劑及抑制劑處理SCAP后,影響該細(xì)胞的增殖、遷移，表明cAMP信號對該細(xì)胞的增殖、遷移有一定的調(diào)節(jié)作用。2014年文獻(xiàn)報道用TGF-β(transforming growth factor beta)刺激SCAP后，該細(xì)胞的增殖能力下降，TGF-β調(diào)節(jié)SCAP的增殖[21]。2015年有學(xué)者報道在腎細(xì)胞中cAMP可以促進(jìn)TGF-β的表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的TGF-β表達(dá)升高時，又可以抑制cAMP對其的調(diào)節(jié)。cAMP信號通路對TGF-β的表達(dá)有一定的調(diào)節(jié)作用[22]。cAMP信號通路參與NF-κB信號的調(diào)節(jié)，后者對細(xì)胞的增殖、遷移又有一定的影響[11,13,23]。cAMP信號通路在調(diào)節(jié)SCAP的增殖，遷移時，可能與TGF-β、NF-κB有關(guān)，但是還需要進(jìn)一步的研究證明。

注：CON是對照組，F(xiàn)OR10是Forskolin 10 μmol·L-1，F(xiàn)OR20是Forskolin 20 μmol·L-1,H5是H-89 5 μmol·L-1,H10是H-89 10 μmol·L-1。

圖3cAMP信號對SCAP遷移的影響

4結(jié)論

體外條件下，作為cAMP信號通路的激活劑及抑制劑，F(xiàn)orskolin和H-89影響SCAP的增殖和遷移，表明cAMP信號通路對的SCAP增殖、遷移有一定的調(diào)節(jié)作用，但是其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

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The influence of cAMP signaling on proliferation of apical papilla stem cell

ZHU Yong-na,ZHANG Jing,SU Sheng-zhe,et al

(StomatologicHospital&College,AnhuiMedicalUniversity,KeyLaboratoryofOralDiseasesResearchofAnhuiProvince，Hefei,Anhui230032，China)

Abstract：Objective This study was designed to investigate the influence of the cAMP signaling on proliferation and migration of SCAP.Methods SCAP was cultured by Enzyme digestion method.After mineralization induction and adipogenic induction,the multiple differentiation potential of SCAP was identified by alizarin red staining and oil red O staining.SCAP was exposed to various concentrations of Forskolin and H-89 respectively.Cell proliferation ability and migration ability were checked by MTT assay and wound healing test.ResultsAfter mineralization induction and adipogenic induction,calcium deposition and lipid droplet were identified in SCAP by alizarin red staining and oil red O staining.Low concentration of Forskolin (2.5 μmol·L-1) promoted proliferation of SCAP,while high concentrations of Forskolin(10 μmol·L-1,20 μmol·L-1) inhibited proliferation of the cell.After inhibiting the signaling by H - 89 (5 μmol·L-1,10 μmol·L-1),the proliferation of SCAP was increased sharply.20 μmol·L-1H-89 promoted the proliferation of SCAP at the third day.However the proliferation of SCAP was inhibited at the fifth day and the seventh day by 20 μmol·L-1H-89.The SCAP stimulated by Forskolin(10 μmol/l,20 μmol·L-1) presented a lower migration capacity.While the SCAP stimulated by H - 89(5 μmol·L-1,10 μmol·L-1) exhibited an improved migration capacity.Conclusion The cAMP signaling can influence the proliferation and migration of SCAP.

Key words:Dental Papilla；Mesenchymal Stem Cells；3′,5′-Cyclic-AMP Phosphodiesterases；Signal Transduction

基金項(xiàng)目:安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 1408085QH178)；安徽醫(yī)科大學(xué)?？蒲谢鹳Y助項(xiàng)目(No 0401059101)

作者簡介:朱永娜，女，碩士研究生 通信作者:李頌，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：牙體牙髓病，E-mail：xlisong@sohu.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.05.016

(收稿日期：2015-11-18，修回日期：2016-01-27)