王鑫毅 韓艷楠 金 珊 王 麗 趙青松 陳寅兒（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211）

研究簡(jiǎn)報(bào)

烏鱧產(chǎn)吲哚金黃桿菌的鑒定及其胞外產(chǎn)物特性分析

王鑫毅 韓艷楠 金 珊 王 麗 趙青松 陳寅兒
（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211）

烏鱧（Channa argus）俗稱烏魚、黑魚、火頭等，因其骨刺少，肉味鮮美，且具有去瘀生薪、生肌補(bǔ)血、滋補(bǔ)調(diào)養(yǎng)等多種生理功能，一直廣受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的親睞。近十多年來(lái)，為順應(yīng)國(guó)內(nèi)外貿(mào)易市場(chǎng)的需要，我國(guó)人工養(yǎng)殖烏鱧迅速發(fā)展。但由于高密度養(yǎng)殖、種質(zhì)退化、環(huán)境惡化及人為因素干擾等多種原因，使得養(yǎng)殖烏鱧病害日趨增多，新的病原也不斷出現(xiàn)。2013年5—6月，在浙江寧波部分烏鱧養(yǎng)殖池塘出現(xiàn)了批量死亡事件，病魚主要癥狀為體表鱗片大面積脫落，有的爛眼、爛鰓、腹部膨脹、皮膚變黃并伴有少量體表出血現(xiàn)象； 解剖發(fā)現(xiàn)其肝臟顏色變黃，有淡色斑點(diǎn)，組織糊化，偶有腹水。作者對(duì)典型癥狀的病魚進(jìn)行了取樣、病原分離和初步鑒定，認(rèn)為引起本次烏鱧疾病的病原為金黃桿菌屬（Chryseobacterium sp.）細(xì)菌。據(jù)資料顯示［1—3］，金黃桿菌（Chryseobacterium sp.）是一類革蘭氏陰性菌，其廣泛存在于土壤、水、植物等自然環(huán)境及醫(yī)院環(huán)境，為條件致病菌，是人感染性疾病的重要病原，也可引起畜禽［4］和魚類［5］、蛙類［6—9］、中華鱉［10］、河蟹［11］等多種水產(chǎn)動(dòng)物嚴(yán)重疾病。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于金黃桿菌病的研究資料很少，已有的報(bào)道大多是針對(duì)病癥的描述、醫(yī)院臨床感染分布及耐藥性分析等。為了盡快明確烏鱧金黃桿菌病的病原及致病機(jī)理，作者采用常規(guī)生理生化試驗(yàn)結(jié)合16S rRNA序列分析等方法對(duì)所分離的病原菌進(jìn)行了鑒定，并對(duì)病原菌的胞外產(chǎn)物成分及致病性進(jìn)行了研究，以期為魚類金黃桿菌病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚來(lái)源

病魚取自浙江寧波某烏鱧養(yǎng)殖池塘，共3批次，每次至少解剖3尾病魚，體重350—500 g； 健康魚購(gòu)自寧波水產(chǎn)市場(chǎng)，體重350—400 g，外觀檢查并經(jīng)抽樣解剖檢驗(yàn)確認(rèn)無(wú)病。

1.2 病原菌的分離培養(yǎng)

取發(fā)病癥狀典型的烏鱧，無(wú)菌解剖取病魚血液、肝、腎等組織分別劃線接種于TSA平板上，28℃恒溫培養(yǎng)48h后，挑取形態(tài)特征一致的5株優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)

取1.2純培養(yǎng)的細(xì)菌轉(zhuǎn)接TSA斜面，經(jīng)28℃培養(yǎng)20h，用生理鹽水制成約108cell/mL的菌懸液后作革蘭氏染色及電鏡（日立H-7650）觀察。電鏡樣品采用醋酸鈾染色10s。生理生化試驗(yàn)參考伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)（第九版）［12］和趙乃盺等資料［1，2］進(jìn)行。

1.4 16S rRNA基因擴(kuò)增及其序列分析

以分離菌基因組DNA為模板，用細(xì)菌通用引物27f和1492r進(jìn)行16S rRNA序列的PCR 擴(kuò)增［13］。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3min； 94℃變性30s，55℃復(fù)性1min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)； 最后72℃溫育6min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收，連接到pMD18-T載體上，作TA克隆，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序。

將所測(cè)的菌株的16S rRNA基因序列上傳至Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)，并通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST進(jìn)行序列相似性比較，選取與所測(cè)序列同源性高的已知菌株，采用ClustalX軟件進(jìn)行多序列比對(duì)（Multiple Alignments），利用MEGA5.05軟件，采用鄰位相連（Neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)自舉分析（Bootstrap）進(jìn)行置信度檢測(cè)，自舉數(shù)集1000次。

1.5 人工感染試驗(yàn)

根據(jù)1.3和1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所分離的5株菌相似度在99%以上，應(yīng)為同一種菌，因此，人工感染實(shí)驗(yàn)僅采用WL20130525菌株進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)在120 cm×80 cm×50 cm的塑料桶中進(jìn)行，每桶放養(yǎng)體重350—400 g的健康烏鱧10尾，連續(xù)充氣，暫養(yǎng)2d后進(jìn)行感染試驗(yàn)。WL20130525菌株培養(yǎng)24h后，用無(wú)菌生理鹽水制成濃度約2.68×108、2.68×107、2.68×106、2.68×105、2.68×104cfu/mL的菌懸液，細(xì)菌量根據(jù)M cF濁度管結(jié)合活菌計(jì)數(shù)方法確定。感染組共10組，每個(gè)菌濃度肌肉注射20尾，每尾注射0.3 mL，對(duì)照組10尾注射同量無(wú)菌生理鹽水。用SPSS軟件計(jì)算細(xì)菌半致死濃度［14］。

1.6 WL20130525菌胞外產(chǎn)物的制備及活性測(cè)定

細(xì)菌胞外產(chǎn)物的制備采用玻璃紙?zhí)崛》ǎ?5］，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定胞外產(chǎn)物蛋白濃度。胞外產(chǎn)物活性采用杯碟法測(cè)定［16］，在TSA培養(yǎng)基上進(jìn)行。溶血試驗(yàn)血瓊脂平板分別采用脫纖維綿羊血、脫纖維兔血、烏鱧血、鯽魚血，pH 7.5。

1.7 WL20130525菌胞外產(chǎn)物的致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)5個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，分別在120 cm× 80 cm×50 cm的塑料桶中進(jìn)行。每桶放養(yǎng)體重350—400 g健康烏鱧10尾，連續(xù)充氣，暫養(yǎng)2d后進(jìn)行試驗(yàn)。取1.6中制備的胞外產(chǎn)物，用PBS稀釋成70、104、156、235、352 μg/mL系列濃度，每個(gè)濃度肌肉注射 10尾，每尾注射0.3 mL，對(duì)照組注射等量無(wú)菌PBS。胞外產(chǎn)物的注射量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。用改良寇氏法計(jì)算胞外產(chǎn)物半致死濃度［17］。

1.8 WL20130525菌的藥敏試驗(yàn)

以涂布法接種0.1 mL WL20130525菌于TSA平板上，貼上藥敏紙片，28℃恒溫培養(yǎng)24h后，測(cè)抑菌圈直徑。所用藥敏紙片購(gòu)于杭州濱和微生物試劑有限公司。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)從患病烏鱧體內(nèi)共分離5株病原菌，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及16S rRNA基因序列分析，所分離的5株菌相似度在99%以上，應(yīng)為同一種菌，因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅針對(duì)WL20130525菌株。

2.1 病原菌的致病性

采用從患病烏鱧中分離到的病原菌WL20130525感染健康烏鱧，感染初期烏鱧躁動(dòng)不安，狂游，有躍出水面的現(xiàn)象； 隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，魚活力明顯下降，精神萎頓，感染第2天魚開(kāi)始出現(xiàn)死亡，體表注射部位明顯紅腫，感染3d后注射部位出現(xiàn)一塊圓形病灶，該處鱗片向外張開(kāi)，松動(dòng)易脫落，鱗下體表充血腫脹； 隨著病情加重，魚鱗大片脫落，皮膚或成黃色，注射部位潰爛； 解剖發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)組織松軟糜爛，肝腎略有腫大，腸組織黏連。5個(gè)感染菌濃度168h的死亡率分別為100%、90%、75%、40%、10%，WL20130525菌對(duì)烏 鱧的LD50為4.63×105cfu/mL。感染魚癥狀與自然發(fā)病魚相似，從感染發(fā)病魚體內(nèi)的血液、肝、腎等組織中又可以分離到與WL20130525菌株形態(tài)特征完全一致的菌株，說(shuō)明WL20130525菌株確為烏鱧的致病菌。

2.2 WL20130525菌株形態(tài)及生理生化特征

革蘭氏染色和電鏡觀察顯示，WL20130525菌株為革蘭氏陰性桿菌，菌體兩端鈍圓，大小約為（0.3—0.5）μm×（1.0—2.3）μm，大多單個(gè)散在，無(wú)鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)，無(wú)莢膜和芽孢（圖 1）在TSA平板上培養(yǎng)24h，菌落為黃色，圓形，直徑約1—2 mm，表面隆起、光滑，邊緣整齊且有光澤。生理生化特征見(jiàn)表 1，經(jīng)查閱相關(guān)資料［1，2，13］，可知WL20130525菌株為產(chǎn)吲哚金黃桿菌（Chryseobacteriumindologenes）。

表 1 WL20130525菌的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of WL20130525

2.3 16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用引物27F和1492R擴(kuò)增菌株的16S rRNA基因，共包括1549個(gè)堿基。在GenBank中的注冊(cè)號(hào)為JX515610。將測(cè)定的16S rRNA基因序列與GenBank中的參考序列進(jìn)行比對(duì)，找出相關(guān)序列，利用生物學(xué)聚類軟件MEGA5.05進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建（圖 2）。從N-J法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上可以看出菌株WL20130525屬于金黃桿菌（Chryseobacterium）家族，與該菌序列最接近的兩個(gè)菌株產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes）和黏金黃桿菌（C.gleum），其相似度分別為98.3%和97.8%。綜合2.2和2.3結(jié)果，作者認(rèn)為WL20130525菌株應(yīng)為產(chǎn)吲哚金黃桿菌（Chryseobacterium indologenes）。

2.4 WL20130525菌胞外產(chǎn)物的活性和致病性

采用玻璃紙?zhí)崛》ㄖ苽鋀L20130525菌胞外產(chǎn)物，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得蛋白濃度為704 μg/mL。以杯碟法測(cè)定WL20130525菌胞外產(chǎn)物的酶活性，結(jié)果顯示，用50 μL的胞外產(chǎn)物提取液所產(chǎn)生的各酶透明圈直徑分別為卵磷脂酶31 mm，蛋白酶20 mm，淀粉酶13 mm，脂肪酶8 mm，說(shuō)明酶活性卵磷脂酶>蛋白酶>淀粉酶>脂肪酶。WL20130525菌胞外產(chǎn)物對(duì)烏鱧血呈完全（β）溶血，對(duì)綿羊血和鯽魚血部分溶血，對(duì)兔血不溶血。注射WL20130525胞外產(chǎn)物后，烏鱧發(fā)病癥狀與感染菌病魚癥狀相似，5個(gè)實(shí)驗(yàn)組168h的死亡率分別為100%、60%、40%、20%、0，胞外產(chǎn)物對(duì)烏鱧的LD50為158.49 μg/kg體質(zhì)量，說(shuō)明WL20130525胞外產(chǎn)物具有較強(qiáng)毒性。

2.5 WL20130525菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

從表 2可知，WL20130525菌對(duì)米諾環(huán)素、利福平、恩諾沙星、頭孢西丁、強(qiáng)力霉素、依諾沙星、諾氟沙星等7種藥物較敏感，對(duì)鏈霉素等10種藥物耐藥。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從患病烏鱧（C.argus）體內(nèi)分離到菌株WL20130525，經(jīng)人工感染試驗(yàn)證實(shí)，WL20130525可使烏鱧的生活狀態(tài)、體表和肝腎等主要組織器官出現(xiàn)明顯的病癥，且在人工感染患病魚的體內(nèi)又可分離到與WL20130525完全一致的菌株，說(shuō)明WL20130525具有強(qiáng)致病性。通過(guò)對(duì)WL20130525的16S rRNA基因分析，發(fā)現(xiàn)它與產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes）的親緣性最接近，且相似度為98.3%； 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特征試驗(yàn)進(jìn)一步確定WL20130525菌株為產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes）。

圖 2 菌株WL20130525及其相關(guān)菌株16S rRNA基因鄰位連接法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表 2 WL20130525菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Drug sensitive test results of WL20130525

1994年Vandamme等根據(jù)菌體形態(tài)和生理生化特性提出將黃桿菌屬（Flavobacterium）中的部分菌統(tǒng)一劃歸新建立的金黃桿菌屬（Chryseobacterium）［18］，主要有大比目魚金黃桿菌（C.balustinum）、黏金黃桿菌（C.gleum）、產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes）、腦膜膿毒性金黃桿菌（C.meningosepticum）、吲哚金黃桿菌（C.indoltheticum）、大菱鲆金黃桿菌（C.scophthalmum）等6個(gè)種，這一歸屬和命名得到了普遍認(rèn)可。后來(lái)趙乃盺等根據(jù)Vandamme的分類及金黃桿菌屬的特征，在原有6個(gè)種的基礎(chǔ)上增加了污水金黃桿菌（C.defluvii）、臺(tái)灣金黃桿菌（C.formosense）、宙斯特氏金黃桿菌（C.joostei）、C.daecheongense、C.Miricola等共11個(gè)種［1］。

自1992年首次發(fā)現(xiàn)豹蛙產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes）感染性疾病，其后西班牙、日本、中國(guó)等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)陸續(xù)有報(bào)道產(chǎn)吲哚金黃桿菌引起人類疾?。?9，20］。據(jù)資料顯示，產(chǎn)吲哚金黃桿菌是醫(yī)院感染的主要病原菌之一，可引起人肺炎、敗血癥、膿毒血癥、局部組織傷口感染等嚴(yán)重疾病，由于其耐藥范圍廣、臨床癥狀與體征復(fù)雜，因此死亡率高，近幾年已引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的廣泛重視［3，19］。目前關(guān)于產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes）感染動(dòng)物的報(bào)道不多，已有的資料大多也是針對(duì)病癥的描述，如Olson等［2 1］報(bào)道了該菌引起豹蛙敗血癥，Callon等［22］報(bào)道了該菌感染奶羊，祖國(guó)掌等［11］報(bào)道該菌可引起河蟹疾病，Kampfer等［23，24］報(bào)道了該菌可引起大西洋鮭魚疾病，Ilardi［25］等報(bào)道了該菌感染了大馬哈魚。而至今還未見(jiàn)國(guó)內(nèi)有關(guān)產(chǎn)吲哚金黃桿菌對(duì)養(yǎng)殖魚類感染致病的報(bào)道。由于產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes）是人和動(dòng)物的共患病原，它不僅對(duì)人類健康嚴(yán)重危害，而且對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物也產(chǎn)生潛在威脅，因此，值得進(jìn)一步的關(guān)注和深入研究。

目前關(guān)于產(chǎn)吲哚金黃桿菌致病機(jī)理的研究很少，已有的研究顯示可能與其胞外蛋白有關(guān)［18］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，WL20130525菌胞外產(chǎn)物具有強(qiáng)致病性，而其胞外產(chǎn)物中蛋白酶活性較強(qiáng)。此外，已有的研究也表明，產(chǎn)吲哚金黃桿菌具有多重耐藥性，其耐藥機(jī)制復(fù)雜，除細(xì)菌外膜通透性屏障外，還存在多種超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及金屬β-內(nèi)酰胺酶，可導(dǎo)致碳青霉烯類、頭孢菌素類、氨基糖甙類等抗生素廣泛耐藥［3，26］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，WL20130525菌對(duì)米諾環(huán)素、利福平、頭孢西丁、強(qiáng)力霉素、恩諾沙星、依諾沙星、諾氟沙星等7種化學(xué)療劑高度敏感，但由于農(nóng)業(yè)部第2292號(hào)公告已把恩諾沙星、依諾沙星、諾氟沙星等列入禁用漁藥，2016年12月31日起禁止使用，因此可考慮把米諾環(huán)素、利福平、頭孢西丁、強(qiáng)力霉素等4種作為治療烏鱧金黃桿菌病的首選藥物。由于產(chǎn)吲哚金黃桿菌廣泛存在于空氣、水、土壤等自然環(huán)境中，為條件致病菌，且化學(xué)藥物大量的使用不僅會(huì)滋生大量的耐藥菌株，而且污染環(huán)境，甚至危害人類食品安全，因此，該病的控制一定要以防為主，特別是在初夏和初秋季節(jié)是該病的高發(fā)期。

參 考 文 獻(xiàn)：

［1］Zhao N X，Yuan G Y.Name and Classification of Medical Bacteria Identification（third edition）［M］.Jinan:Shandong University Press.2013，115—120，173—179［趙乃盺，苑廣盈.醫(yī)學(xué)細(xì)菌名稱及分類鑒定（第三版）.濟(jì)南:山東大學(xué)出版社.2013，115—120，173—179］

［2］Fang H，Chen C Z，Zhang X J.Aquaculture Animal Pathogenic Bacterium［M］.Beijing:China Agriculture Press.2010，499—517［房海，陳翠真，張曉君.水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病原細(xì)菌學(xué).北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.2010，499—517］

［3］Chen X B.Distribution changes of STAPHYLOCOCCUS spp and drug resistance［J］.Chinese Journal of Nosocomiology，2011，21（4）:772—774［陳曉蓓.醫(yī)院金黃桿菌屬分布變遷與耐藥性研究.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21（4）:772—774］

［4］Hu W J，Song Y H，Qin J C，et al.Intrauterine flora change of postpartum cows and its pathogenicity［J］.Hubei Agricultural Sciences，2014，54（17）:4115—4119［胡文舉，宋艷畫，秦佳辰，等.產(chǎn)后牛子宮內(nèi)菌群變化規(guī)律及致病性研究.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，54（17）:4115—4119］

［5］Huang Z J，He J G，Weng S P，et al.The isolation and preliminary identification of pathogenic bacteria from the diseased mandarin fish［J］.Microbiology，1999，26（4）:241—246［黃志堅(jiān)，何建國(guó)，翁少萍，等.鱖魚細(xì)菌性病原的分離鑒定及致病性初步研究.微生物學(xué)通報(bào)，1999，26（4）:241—246］

［6］Bernardet J F，Vancanneyt M，Matte-Tailliez O，et al.Polyphasic study of Chryseobacterium strains isolated from diseased aquatic animals［J］.Systematic and Applied Microbiology，2005，28（7）:640—660

［7］Ye X P，Yang Z G，Luo Y Z.A study on the pathogen and technioue of prevention of ecnephalitis occvred in cvltured bull-from（Rana Catesbeiana Shaw）［J］.Journal of Zhejiang Institute of Aquaculture，1996，15（4）:301—304［葉雪平，楊廣智，羅毅志.牛蛙腦膜炎（歪脖子病）病原分離及防治技術(shù)研究.浙江水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，1996，15（4）:301—304］

［8］Zhou Y C，Zhu C H，Chen G H，et al.Isolation and identification of pathogen of the cataract disease and its immunological control in Rana tigrina rugulosa［J］.Journal of Shanghai Fisheries University，2001，10（1）:16—21［周永燦，朱傳華，陳國(guó)華，等.虎紋蛙白內(nèi)障病病原的分離鑒定及其免疫防治.上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，10（1）:16—21］

［9］Chen A P，Jiang Y L，Qian D，et al.Chryseobacterium Meningosepticum of Frog（Rana spp.）［J］.China Fisheries，2012，5:51［陳愛(ài)平，江育林，錢冬，等.蛙腦膜炎敗血金黃桿菌病.中國(guó)水產(chǎn)，2012，5:51］

［10］Cai W Q，Sun P F，Zhu Z W，et al.Study on Flavobacterium memingoseptium disease in the soft-shelled turtle（Trionyx sinensis）［J］.Fisheries Science & Technology Information，1997，24（4）:156—161［蔡完其，孫佩芳，朱澤聞，等.中華鱉腦膜炎敗血性黃桿菌病的研究.水產(chǎn)科技情報(bào)，1997，24（4）:156—161］

［11］Zu G Z，Li J N，Yu W Y，et al.The study of bacterial disease on raising Eriocheir sinensisi［J］.Journal of Aquaculture，2007，28（2）:1—4［祖國(guó)掌，李槿年，余為一，等.河蟹細(xì)菌病病原分離與鑒定.水產(chǎn)養(yǎng)殖，2007，28（2）:1—4］

［12］Holt J G，Krieg N R，Sneath P H，et al.Bergey's Manual of Determinative Bacteriology［M］.Ninth Edition.Baltimore.Williams and Wilkins.1994，507—508

［13］Li N，Guo H Z，Jiao R，et al.Identification and pathogenicity of bacterial pathogens isolated in an outbreak on bacterial disease of Ctenopharyngodon idellus［J］.Acta Hydrobiologica Sinica，2011，35（6）:980—987［李楠，郭慧芝，焦冉，等.草魚的一種急性細(xì)菌性傳染病病原的分離鑒定及致病性研究.水生生物學(xué)報(bào)，2011，35（6）:980—987］

［14］Xiong H M，Wei B Q，Wei R J，et al.Calculation of median lethal dose（LD50）for Yersinia pestis by SPSS pac-kage［J］.Chinese Journal of Zoonoses，2013，29（11）:1127—1130［熊浩明，魏柏青，魏榮杰，等.用SPSS軟件計(jì)算鼠疫菌半數(shù)致死量（LD50）.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2013，29（11）:1127—1130］

［15］Wang B，Yu L P，Yuan T，et al.Pathogenicity of extracellular products of Vibrio harveyi to Fugu obscures［J］.Journal of Fishery Sciences of China，2010，17（1）:88—95［王斌，于蘭萍，袁甜，等.哈氏弧菌胞外產(chǎn)物對(duì)紅鰭東方鲀的致病性.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2010，17（1）:88—95］

［16］Jin S，Zheng T L，Wang G L，et al.Pathogenicity of Extracellular Products of Vibrio alginolyticus to Great Yellow Croaker，Psedosciaena crocea［J］.Chinese Journal of Veterinary Science，2004，24（17）:439—441［金珊，鄭天倫，王國(guó)良，等.溶藻弧菌胞外產(chǎn)物對(duì)大黃魚的致病性.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，24（17）:439—441］

［17］Gu B，Zhang Z，Li Y P，et al.Summary of median lethal dose and its calculation method［J］.China Occupational Medicine，2009，36（6）:507—508，511［顧兵，張政，李玉萍，等.半數(shù)致死量及其計(jì)算方法概述.中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué)，2009，36（6）:507—508，511］

［18］Vandamme P，Bernardet J F，Segers P，et al.New perspectives in the classification of the flavobacteria:Description of Chryseobacterium gen.nov.，Bergeyella gen.nov.，and Empedobacter nom.Rev［J］.International Journal of Systematic Bacteriology，1994，44（4）:827—831

［19］Tian G Z，Wang X L.Advances in the study of Flavobacterium indologenes［J］.Journal of Pathogen Biology，2012，5（2）:134—136［田國(guó)忠，王曉蕾.產(chǎn)吲哚黃桿菌研究進(jìn)展.中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2012，5（2）:134—136］

［20］Hsueh P R，Hsiue T R，Wu J J，et al.Flavobacterium indologenes bacteremia:clinical and microbiological characteristics［J］.Clinical Infectious Diseases，1996，23（3）:550—555

［21］Olson M E，Gard S，Brown M，et al.Flavobacterium indologenes infection in leopard frogs［J］.Journal of American Veterinary Medical Association，1992，201（11）:1766—1770

［22］Callon C，Dut hoit F，Delbs C，et al.Stability of microbial communities in goat milk during a lactation year:molecular approaches［J］.Systematic and Applied Microbiology，2007，30（7）:547—560

［23］K?mpfer P，F(xiàn)allschissel K，Avenda?o-Herrera R.Chryseobacterium chaponense sp.nov.，isolated from farmed Atlantic salmon（Salmo salar）［J］.International Journal of Systermatic Evolutionary Microbiology，2011，61（3）:497—501

［24］Ilardi P，Abad J，Rintam?ki P，et al.Phenotypic，serological and molecular evidence of Chryseobacterium piscicola in farmed Atlantic salmon，Salmo salar L.［J］.Journal of Fish Diseases，2010，33（2）:179—181

［25］Ilardi P，Avenda?o-Herrera R.Isolation of Flavobacterium like bacteria from diseased salmonids cultured in Chile［J］.Bulletin of the European Association of Fish Pathologists，2008，28（5）:176—185

［26］Wang S Y，Mu H，Liu Y H.172 strains produce in doles golden coli clinical distribution and drug resistance analysis［J］.Shandong Medical Journal，2013，53（27）:84—85［王世瑜，穆紅，劉燁華.172株產(chǎn)吲哚金黃桿菌的臨床分布及耐藥分析.山東醫(yī)藥，2013，53（27）:84—85］

IDENTIFICATION AND ANALYSIS ON EXTRACELLULAR PRODUCTS CHARACTERISTICS OF CHRYSEOBACTERIUM INDOLOGENES ISOLATION FROM CHANNA ARGUS

WANG Xin-Yi，HAN Yan-Nan，JIN Shan，WANG Li，ZHAO Qing-Song and CHEN Yin-Er
（School of Marine Sciences in Ningbo University，Ningbo 315211，China）

關(guān)鍵詞：烏鱧； 產(chǎn)吲哚金黃桿菌； 生理生化鑒定； 16S rRNA； 胞外產(chǎn)物； 抗菌藥物

Key words:Channa argus； Chryseobacterium indologenes； Physiological and biochemical identification；16S rRNA； Extracellular products； Antimicrobial agents

doi:10.7541/2016.86

收稿日期：2015-09-15；

修訂日期：2015-12-16

基金項(xiàng)目：海洋公益性行業(yè)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（201105007）； 寧波大學(xué)水產(chǎn)浙江省重中之重一級(jí)學(xué)科開(kāi)放基金（xkzsc1503）資助［Supported by the Public Science and Technology Research Funds Projects of Ocean（No.201105007）； Ningbo University Aquaculture in Zhejiang Province Priority Level 1 Subject Open Fund（No.xkzsc1503）］

作者簡(jiǎn)介：王鑫毅（1995—），男，浙江嘉興人； 本科； 研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物病害防控。E-mail:578405056@qq.com

通信作者：金珊（1964—），教授； E-mail:jinshan@nbu.edu.cn

中圖分類號(hào)：S941.42

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3207（2016）03-0641-06