袁江迪陳中元張奇亞（.中國科學(xué)院水生生物研究所，淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072； 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 00049）

正常和蛙病毒感染后大鯢血清和黏液蛋白圖譜比較分析

袁江迪1，2陳中元1張奇亞1
（1.中國科學(xué)院水生生物研究所，淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072； 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

摘要：為了更好地了解大鯢在感染蛙病毒過程中的生理生化及抗病毒反應(yīng)，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）輔以密度分析，對(duì)大鯢正常血清和感染血清、正常黏液和感染黏液的蛋白圖譜分別進(jìn)行測(cè)試比較。結(jié)果顯示:在正常血清（CS）、包括自然感染血清（NS）和人工感染血清（AS）在內(nèi)的感染血清中，蛋白帶集中在60—80 kD，其含量超過血清蛋白總量的42%； 正常血清在14—57 kD 之間有16條蛋白帶:57、53、50、43、40、38、36、31、27、26、25、22、16、15.5、15 和14 kD，其中正常與感染血清（包括NS和AS）比較，有10條共有蛋白帶:57、43、40、31、27、26、25、15.5、15 和14 kD和4條差異蛋白帶:53、33、22 和16 kD。正常黏液（CM）和感染黏液（NM或AM）共有11條蛋白帶:116、100、75、57、53、45、27、18、17、16和15 kD，但感染黏液多出7 條蛋白帶:90、52、43、32、26、20 和13 kD。還有些蛋白帶含量出現(xiàn)變化，如45 kD條帶在CM中占總蛋白量的19.3%，而在AM中僅占總蛋白的3.8%。研究證實(shí)蛙病毒感染能導(dǎo)致大鯢黏液和血清蛋白圖譜發(fā)生變化，也為深入探尋兩棲類抗病毒相關(guān)的蛋白生物標(biāo)記提供了有價(jià)值的信息。

關(guān)鍵詞：大鯢； 血清； 黏液； 蛙病毒感染； 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳； 密度分析； 蛋白圖譜

大鯢（Chinese giant salamander Andrias davidianus）屬于有尾目隱鰓鯢科，是我國特有、也是世界現(xiàn)存最大的兩棲動(dòng)物［1］。這種兩棲動(dòng)物具有壽命長、自我修復(fù)能力強(qiáng)、能產(chǎn)生特殊體表黏液等特點(diǎn)，具有相當(dāng)高的經(jīng)濟(jì)和科研價(jià)值。在人工繁養(yǎng)技術(shù)建立后，大鯢養(yǎng)殖已初具規(guī)模［2］。學(xué)者們圍繞大鯢資源保護(hù)、營養(yǎng)成分、遺傳變異、分子生物學(xué)等相繼開展了多方面研究［3—7］。蛙病毒Ranavirus是一類能感染包括大鯢在內(nèi)的14 個(gè)科70 多種兩棲動(dòng)物、上百種魚等的水生動(dòng)物病毒病原［8］。但近些年人們注意到蛙病毒感染會(huì)使野生大鯢等兩棲類種群下降［9，10］，使養(yǎng)殖大鯢產(chǎn)量銳減［11，12］。本實(shí)驗(yàn)室已從患系統(tǒng)性出血病的大鯢組織中，分離鑒定了蛙病毒（Andrias davidianus ranavirus，ADRV）［13］。但限于大鯢生理、生化及免疫學(xué)基礎(chǔ)薄弱，對(duì)蛙病毒引起大鯢流行病的機(jī)理及其防控研究難以深入。

血清和黏液具有為動(dòng)物提供基本生活物質(zhì)（包括激素、生長因子、蛋白等）、保護(hù)機(jī)體免受損害與侵染等重要的生理生化及免疫保護(hù)作用［14—16］。血清或其他體液蛋白的電泳已作為一種技術(shù)，運(yùn)用于機(jī)體生理生化指標(biāo)的評(píng)估或某些疾病的診斷［17—19］。先前還經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）測(cè)定了不同水生脊椎動(dòng)物的血清黏液的相關(guān)報(bào)道，顯示出它們具有特定的蛋白組分和圖譜［20］。為此，本文擬利用SDS-PAGE 測(cè)試，輔以光密度分析，對(duì)受病毒攻擊前后的大鯢黏液與血清蛋白組分進(jìn)行比較分析，試圖為篩選抗病毒應(yīng)答或免疫相關(guān)組分提供信息。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

正常大鯢，體重約120 g，體長約30 cm，由某大鯢養(yǎng)殖場提供的養(yǎng)殖子代大鯢，符合國家相關(guān) 法律法規(guī)。大鯢運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，用曝氣的自來水暫養(yǎng)一周，水溫保持在15—20℃，無任何病癥。隨機(jī)取正常大鯢2尾，以0.7 mL/尾的體積，腹腔注射滴度為106.5TCID50/mL的大鯢蛙病毒懸液，注射12d后作為人工感染大鯢采樣。自然感染大鯢是從自然發(fā)病的大鯢群體中采集，體重約2000 g，體長約70 cm，并已鑒定是因大鯢蛙病毒感染所致［13］。分別按下述方法采集制備大鯢血清和黏液樣品。

1.2 血清樣品的采集和制備

通過心臟取血方式采集大鯢血液，室溫靜置0.5h，4℃過夜析出血清。以3000 r/min，離心20min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，分裝，-20℃保存。采用與此同樣的方法和過程，分別制備大鯢正常血清Control serum（CS）、自然感染血清Natural infected serum（NS）和人工感染血清Artificial infected serum（AS），分裝后置于冰箱保存、備用。

1.3 黏液樣品的采集和制備

先用蒸餾水將大鯢沖洗3次，使其體表干凈，用滅菌塑料薄片輕觸大鯢體表并刮取黏液，置于離心管中，加入4倍體積的PBS，輕輕搖動(dòng)與黏液混勻，4℃，9700 r/min 離心30min，收集上清，-80℃過夜，凍干。在凍干黏液樣中，再加入凍干之前1/10體積的PBS重溶，4℃，9700 r/min離心30min，重新收集上清分裝，保存于-20℃，備用。采用相同的方法和過程，分別制備大鯢正常黏液（Control mucus，CM）、自然感染黏液（Natural infected mucus，NM）和人工感染黏液（Artificial infected mucus，AM），分裝后置于冰箱保存、備用。

1.4 SDS-PAGE電泳

先繪制牛血清白蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照本實(shí)驗(yàn)室已報(bào)道的方法［20］。分別解凍、稀釋上述待測(cè)樣品，并參考所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線和蛋白濃度，選擇適當(dāng)稀釋倍數(shù)盡量使蛋白總量相近，便于比較。電泳所加樣品的最終含量及體積分別為:血清蛋白含量為1.3—1.6 mg/mL，上樣量為10 mL/孔； 黏液蛋白含量為2—3 mg/mL，上樣量也為10 mL/孔。

將樣品與上樣液等體積混勻后，95℃煮沸5min，置冰上冷卻，加樣。再經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。同時(shí)，比較了不同分離膠濃度（10%、12%、13%、13.5%、14%和15%）電泳效果。確定能獲得較完整清晰圖譜的膠濃度為13.5%，并以此作為分離膠，濃縮膠濃度為5%。先用90 V電壓電泳，待樣品電泳至濃縮膠與分離膠的交界處，再調(diào)至120 V電壓電泳，至溴酚藍(lán)指示劑接近膠的底部時(shí)，停止電泳，用考馬斯亮藍(lán)染色過夜，然后脫色，掃描成像，記錄數(shù)據(jù)。

1.5 圖像分析

用Syngene GeneTools Analysis Software-Version 3.02圖像分析軟件，對(duì)血清和黏液蛋白圖譜逐一進(jìn)行條帶組成、分子量及蛋白含量數(shù)據(jù)分析。參照標(biāo)準(zhǔn)分子量，可獲得各條帶相對(duì)分子量、峰值高度（Height）和條帶光密度值（Raw volume）等系列數(shù)據(jù)。各蛋白組分占總蛋白量的百分比與光密度值、總蛋白量成比例關(guān)系。因此可根據(jù)各條帶光密度值及總蛋白光密度值（同一泳道中各蛋白條帶光密度值之和Σ）來計(jì)算各條帶的蛋白含量百分比［http://www.doc88.com/p-6971136802575.html］。計(jì)算公式為:百分比（Ratio，%）=各條帶光密度值（Raw volume）/泳道所有條帶光密度值之和。

2 結(jié)果

2.1 正常血清與感染血清蛋白圖譜的異同

正常血清（CS）和感染?。∟S和AS）血清蛋白在60—80 kD都有濃密的蛋白條帶，超過血清蛋白總量的42%。正常血清還在14—57 kD有16條蛋白帶:57、53、50、43、40、38、36、31、27、26、25、22、16、15.5、15 和14 kD，其中可分辨出10條與感染血清共有蛋白帶:57、43、40、31、27、26、25、15.5、15和14 kD。但正常與感染血清（包括NS和AS）之間的差異蛋白帶有4條:53、33、22 和16 kD，另外，還與自然感病血清（NS）之間有50和36 kD這2條差異帶（圖 1）。

圖 1 經(jīng)SDS-PAGE的正常與感染大鯢血清蛋白圖譜

2.2 正常與感染黏液蛋白圖譜的異同

正常黏液（CM）和感染黏液（NM或AM）共同都有11條蛋白帶:116、100、75、57、53、45、27、18、17、16和15 kD，而感染黏液多出7條蛋白帶:90、52、43、32、26、20 和13 kD（圖 2）。經(jīng)光密度掃描數(shù)據(jù)和曲線分析，顯示感染黏液中還有些蛋白帶，如45和16 kD與正常黏液相比含量發(fā)生了變化，如45 kD條帶占正常黏液（CM）總蛋白量的19.3%，而在感染黏液中分別降至9.5%（NM）和3.8%（AM）。16 kD條帶占正常黏液（CM）總蛋白量的6.0%，而在感染黏液中升至12.6%（NM）和16.4%（AM）（圖 3）。從整體來看，正常黏液蛋白帶總數(shù)要低于感病黏液（表 1）。

2.3 正常血清與黏液蛋白圖譜的比較

正常血清圖譜中蛋白帶主要分布在40—135 kD，超過總蛋白量的70%，尤其集中在60—80 kD，占總蛋白量45.2%。而在正常黏液圖譜中，蛋白條帶分布均勻，與正常血清蛋白帶濃密的60—80 kD對(duì)應(yīng)區(qū)域卻沒有蛋白帶（圖 1、圖 2、表1）。因此，無論是從相同區(qū)域蛋白帶的分布，或是主要蛋白含量來看，正常血清和黏液之間都存在顯著差異。

圖 2 經(jīng)SDS-PAGE的正常與感染大鯢黏液蛋白圖譜

3 討論

圖 3 正常與感染大鯢黏液蛋白的光密度曲線圖

血清蛋白電泳（Serum protein electrophoresis，SPE）是一種可用于了解血清蛋白質(zhì)組分、對(duì)不同生理及病理?xiàng)l件下血清蛋白成分變化進(jìn)行定量的有效方法，被運(yùn)用于不同指標(biāo)的測(cè)試分析［21，22］。大鯢黏液為高度黏稠的乳白色凝膠樣物質(zhì)，與常見的魚類黏液具有透明易溶于水的性狀不同，大鯢黏液很難溶于水、生理鹽或磷酸鹽緩沖液（PBS）等。因此，在用于電泳的大鯢黏液樣品采集和制備過程中，需經(jīng)凍干、溶解和離心處理，才能使黏液樣品較充分溶解，以獲得質(zhì)量較好的電泳圖譜。大鯢血清中部分蛋白帶集中，不同組分的含量差異大，選配適當(dāng)膠濃度是獲得較高分辨率、組分完整、清晰的電泳圖譜的關(guān)鍵條件之一。因此，在制備和稀釋黏液樣及選擇適宜電泳膠濃度條件時(shí)都經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)和比較。

表 1 大鯢血清和黏液蛋白圖譜各條帶峰值（Height）及含量百分比（Ratio）Tab.1 The peak values（Height）and percentage contents（Ratio）of serum and skin mucus protein from normal（control）and infected Chinese giant salamander on SDS-PAGE

大鯢正常血清與正常黏液圖譜有顯著差異，且病毒感染后，它們的組分變化也明顯不同。當(dāng)與不同水生脊椎動(dòng)物的血清與黏液蛋白圖譜比較，大鯢黏液的蛋白圖譜與無鱗的黃鱔（Monopterus albus）更接近些，而與草魚（Ctenopharungodon idellus）、鯽（Carassius auratus）和江豚（Neophocaena phocaenoides）差異較大［20］。大鯢血清蛋白圖譜更接近水生哺乳動(dòng)物江豚，而與草魚、鯽、鱖（Siniperca chuatsi）、赤點(diǎn)石斑魚（Epinephelus akaara）、狗魚（Esox reicherti）等差異大些。這似乎與我們先前在對(duì)從ADRV誘導(dǎo)的大鯢胸腺cDNA文庫中，篩選鑒定免疫相關(guān)基因的結(jié)果有某種程度相吻合，部分大鯢抗體基因結(jié)構(gòu)更接近進(jìn)化地位較高級(jí)的動(dòng)物，而不是相同或進(jìn)化地位較低的動(dòng)物［23］。正常與感染血清或黏液都出現(xiàn)了不同的差異蛋白帶，這證實(shí)蛙病毒感染的確能導(dǎo)致大鯢血清和黏液蛋白組分發(fā)生變化，如蛙病毒感染能使黏液蛋白組分增加； 雖然感染血清蛋白帶總數(shù)變化不大，但與正常血清相比至少有5條差異帶。這提示大鯢血清與黏液的來源、抗病毒作用不同，因此大鯢血清和黏液對(duì)蛙病毒感染的應(yīng)答存方式也有異。另外我們還注意到:自然感染和人工感染的大鯢黏液蛋白組分之間也存在一些差異條帶，這可能與自然感染大鯢的年齡和體重差別較大、生存時(shí)間長短不一、或不同個(gè)體的生理和免疫狀況也不同有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，大鯢血清條帶在60—80 kD有很強(qiáng)的蛋白帶，預(yù)示這部分在血清中含量很高的蛋白是具有重要生理功能的成分。參照人類白蛋白分子量約為69 kD，占血清蛋白總量的50%—60%，具有結(jié)合和運(yùn)輸、維持血液膠體滲透壓、清除自由基、抑制血小板聚集和抗凝血等作用［24，25］及其他血清蛋白及分子量，推測(cè)這一組分可能是大鯢血清白蛋白［26］。

迄今關(guān)于有尾兩棲類黏液中與病毒侵染應(yīng)答相關(guān)蛋白的研究僅見有少量報(bào)道［27］，而大鯢皮膚蛋白組的研究最近才開始［28］。為何會(huì)產(chǎn)生上述現(xiàn)象？哪些蛋白組分的變化是與蛙病毒感染的免疫應(yīng)答有關(guān)呢？還有待運(yùn)用更精準(zhǔn)的方法對(duì)其進(jìn)行篩選與鑒定。隨著這些問題的解答，無疑將為尋找兩棲類血清和皮膚黏液中抗病毒相關(guān)蛋白提供新思路。

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COMPARATIVE ANALYSIS OF SERUM AND SKIN MUCUS PROTEIN PROFILES BETWEEN RANAVIRUS-INFECTUD AND NORMAL CHINESE GIANT SALAMANDER ANDRIAS DAVIDIANUS

YUAN Jiang-Di1，2，CHEN Zhong-Yuan1and ZHANG Qi-Ya1
（1.State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology，Institute of Hydrobiology，Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430072，China； 2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

Abstract:The Chinese giant salam Andrias davidianus is endemic to China and is the largest remaining amphibian in the world，which has considerable economic and scientific significance.However，epidemic of ranavirus disease have been responsible for the wild population continued to decline a sharp drop in giant salamander production.For better understanding of the physiological and biochemical reactions，and antiviral responses of Chinese giant salamander，the protein profiles of serum and mucus from control and infected giant salamanders were analysized and compared by sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）and the densitometric analysis.The results show that protein bands from control serum（CS）and infected serum（including natural infected serum，NS and artificial infected serum，AS）were enriched at 60—80 kD，the contents were more than 42% of total protein.Besides，sixteen protein bands were present among 14—57 kD in CS:57，53，50，43，40，38，36，31，27，26，25，22，16，15.5，15 and 14 kD.Four protein bands 53，33，22 and 16 kD were different between CS and NS，AS.Control mucus（CM）and infected mucus（including natural infection mucus，NM and artificial infected mucus，AM）have eleven common protein bands 116，100，75，57，53，45，27，18，17，16 and 15 kD.But infected giant salamander mucus NM and AM have seven other protein bands 90，52，43，32，26，20 and 13 kD.Furthermore，the protein contents of some bands have changed，for example，the 45 kD band in CM makes up 19.3% of total protein.However，it only makes up 3.8% in AM.This study has demonstrated that ranavirus infection can lead to protein components change in Chinese giant salamander's mucus and serum，which provided valuable information for explore antiviral associated protein biomarkers in amphibians.

Key words:Chinese giant salamander Andrias davidianus； Serum； Mucus； Ranavirus infection； SDS-PAGE；Densitometric analysis； Protein profiles

中圖分類號(hào)：S941.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3207（2016）03-0594-07

doi:10.7541/2016.80

收稿日期：2015-03-23；

修訂日期：2015-08-14

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（31430091）； 四川省科技支撐計(jì)劃（13ZC2065省院科技合作課題）資助［Supported by the National Natural Science Foundation of China（31430091）； the Science and Technolology Support Project of Sichuan Province（BZC2065）］

作者簡介：袁江迪（1989—），男，湖北荊州人； 碩士研究生； 主要從事水生病毒及分子生物學(xué)學(xué)研究。E-mail:yuanjiangdi@ihb.ac.cn

通信作者：張奇亞； E-mail:zhangqy@ihb.ac.cn