夏正龍 黃雪娜 黃振遠(yuǎn) 陳雪峰 高 強(qiáng) 濮劍威 慎佩晶 彭 菲 楊國梁（浙江省淡水水產(chǎn)研究所，國家羅氏沼蝦遺傳育種中心，浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州 313001）

羅氏沼蝦Rab11基因cDNA克隆及其組織表達(dá)分析

夏正龍 黃雪娜 黃振遠(yuǎn) 陳雪峰 高 強(qiáng) 濮劍威 慎佩晶 彭 菲 楊國梁
（浙江省淡水水產(chǎn)研究所，國家羅氏沼蝦遺傳育種中心，浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州 313001）

摘要：為了發(fā)掘羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）免疫相關(guān)基因，研究Rab蛋白（Ras-related proteins in brain）在羅氏沼蝦免疫應(yīng)答中發(fā)揮的作用，研究采用RACE-PCR技術(shù)克隆了羅氏沼蝦Rab11基因全長cDNA序列，記為MrRab11。全長1381 bp，包括226 bp的5′UTR，511 bp的3′UTR和645 bp的開放閱讀框，編碼214個氨基酸，含有一個Rab結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列比對顯示，羅氏沼蝦與岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）、蚤狀溞（Daphnia pulex）、葉蟬（Homalodisca vitripennis）Rab11一致性分別為82%、83%和82%。軟件預(yù)測，MrRab11編碼的蛋白分子量約為23.75 kD，等電點(diǎn)約為5.34。實(shí)時熒光定量表達(dá)分析表明，MrRab11基因在羅氏沼蝦各組織中都有表達(dá)，肝胰腺中的表達(dá)量最高，其次是肌肉和腸道。在陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）感染12h后，羅氏沼蝦肝胰腺中MrRab11的表達(dá)量上升，顯著高于對照組（P<0.05），推測這是MrRab11對陰溝腸桿菌的應(yīng)激表達(dá)，MrRab11在肝胰腺中參與了羅氏沼蝦免疫應(yīng)答過程。

關(guān)鍵詞：羅氏沼蝦； Rab11； 組織表達(dá)； 免疫應(yīng)答

Rab蛋白（Ras-related proteins in brain）是小分子GTP結(jié)合蛋白家族中的最大亞族，分子量介于20—25 kD，由180—200個氨基酸構(gòu)成［1］。研究表明Rab蛋白存在于所有真核生物中，進(jìn)化過程比較保守，但不同物種間Rab蛋白種類差別較大:如裂殖酵母（Fission yeast）中Rab蛋白種類最少，只有7種［2］，人類基因組中Rab蛋白種類最多，有60多種［3］。不同的Rab蛋白定位于不同的細(xì)胞器上，通過結(jié)合和水解GTP來調(diào)節(jié)不同的膜泡運(yùn)輸過程［4］，是膜泡運(yùn)輸?shù)闹匾{(diào)節(jié)因子，在膜泡的形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、黏附、融合及信號傳導(dǎo)等過程起重要作用［5—7］。

目前對Rab蛋白的研究，很多集中在動植物的病害和免疫方面。轉(zhuǎn)基因水稻中高度表達(dá)的Rab11能通過誘導(dǎo)茉莉酸應(yīng)答基因的表達(dá)顯示出對病原的抗性［8］。提高Rab11的活性有助于對患有亨丁頓舞蹈癥小鼠的治療［9］。Rab11a還與人類癌細(xì)胞的增殖和運(yùn)動有關(guān)［10］，有望成為各種癌癥的檢測指標(biāo)以及惡性腫瘤新的治療靶點(diǎn)［11］。在水產(chǎn)動物中:被愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）感染的斑點(diǎn)叉尾鲖（Ietalurus Punetaus）Rab11a［12］、Rab11b［13］的表達(dá)量均顯著上調(diào)，表明這兩種Rab蛋白參與了胞吞途徑的免疫應(yīng)答。被鰻弧菌（Vibrio anguillarum）感染的中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）Rab基因表達(dá)水平也顯著上調(diào)，且在感染1.5h后達(dá)到最高水平，提示Rab蛋白可能與蝦蟹的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)［14］。RNA干擾沉默Rab基因后，吞噬細(xì)胞比率和吞噬指數(shù)都顯著下降； 而Rab基因高度表達(dá)的日本對蝦（Penaeus japonicus）吞噬細(xì)胞比例及吞噬指數(shù)都顯著上升，表明Rab蛋白在吞噬中有重要作用，推測機(jī)體中Rab蛋白主要通過調(diào)節(jié)吞噬作用來抵抗細(xì)菌感染，可以通過提高Rab蛋白表達(dá)量來達(dá)到加強(qiáng)對細(xì)菌的抵抗力［15］。而沉默Rab9和Rab11基因后，HIV病毒的繁殖會受到抑制［16，17］； 沉默Rab7基因后，可以抑制斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）感染白斑綜合征（WSSV）以及黃頭病毒（YHV）［18］。體外抗體試驗(yàn)也表明Rab7蛋白或其抗體能顯著降低對蝦感染W(wǎng)SSV后的死亡率，推測Rab蛋白是病毒在體內(nèi)復(fù)制所必需的細(xì)胞因子，可以通過沉默Rab基因抑制病毒在體內(nèi)繁殖［19］。綜上研究表明Rab基因參與了機(jī)體對細(xì)菌和病毒免疫，且Rab基因?qū)?xì)菌和病毒的免疫機(jī)制可能存在差異。

羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）為世界上個體最大的淡水蝦，是重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)品種［20，21］。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，其病害也越來越多，給養(yǎng)殖行業(yè)造成巨大的損失［22，23］。近年來多地羅氏沼蝦育苗過程中疾病頻發(fā)，幼體出膜幾天后就大批死亡，本實(shí)驗(yàn)室連續(xù)跟蹤研究發(fā)現(xiàn)，陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）是引發(fā)幼體此類病害的主要病原。發(fā)掘羅氏沼蝦免疫相關(guān)基因，研究其免疫機(jī)制，對病害防治等方面將會有重要作用。本研究克隆了羅氏沼蝦Rab11基因全長cDNA序列，分析其生物信息學(xué)特征并研究其對陰溝腸桿菌的免疫應(yīng)答，為進(jìn)一步研究該基因的功能和羅氏沼蝦免疫抗病機(jī)制等方面奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

150尾羅氏沼蝦取自浙江嘉興養(yǎng)殖戶，在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)（水溫25℃），每天換水10%，定時投喂飼料2次。試驗(yàn)用陰溝腸桿菌從高郵2014年初發(fā)病的幼體中分離得到。羅氏沼蝦暫養(yǎng)一周后進(jìn)行細(xì)菌感染試驗(yàn)，挑選健康、規(guī)格統(tǒng)一［體重:（15.5±1.1）g］的個體70尾，平均分成兩組:試驗(yàn)組在肌肉注射100 μL經(jīng)生理鹽水稀釋的陰溝腸桿菌（2.5×108cfu/ mL），對照組注射等量生理鹽水，兩組分別飼養(yǎng)在兩個相同的水箱中。注射前取樣一次，作為空白對照，記為0樣品，注射后0.5h、1.5h、3h、6h、12h、 24h、48h和96h分別從對照組和試驗(yàn)組取樣（每次每組取樣3尾），取羅氏沼蝦肝胰腺、肌肉、鰓、心臟、腸道、胃等組織立即放入液氮中，然后保存于-80℃冰箱，用于RNA提取。

1.2 總RNA提取和cDNA第一鏈合成

用柱式動物RNAout試劑盒（北京天恩澤）提取羅氏沼蝦總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，NanoDrop 2000分光光度計(jì)（Thermo）測定RNA濃度，以2 μg總RNA為模板通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）合成cDNA第一鏈。

1.3 羅氏沼蝦Rab11全長cDNA克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫獲得的羅氏沼蝦EST序列（登錄號:EL695849），和數(shù)據(jù)庫中相近物種序列比對分析保守性，用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)Rab11基因特異性引物（表 1）擴(kuò)增基因的3′末端，其中APOL和AP為通用引物。以反轉(zhuǎn)錄的c D N A第一鏈為模板，MrRab11 3′F1和AOLP分別為上下游引物進(jìn)行第一輪PCR，反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為:94℃ 3min；94℃ 45s，56℃ 30s，72℃ 1min，30個循環(huán)； 72℃8min。以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍后為模板，MrRab11 3′F2和AP為上下游引物進(jìn)行第二輪巢式PCR，退火溫度為60℃，其他條件同第一輪。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下目的條帶，用DNA 膠回收試劑盒（Axygen）回收，回收產(chǎn)物與pMDl9-T 載體（Takara）連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α敏感態(tài)細(xì)胞中，于LB Amp+平板上培養(yǎng)過夜，通過菌液PCR驗(yàn)證，陽性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.4 MrRab11 cDNA及其編碼氨基酸序列分析

用SeqMan軟件分析測序結(jié)果，去掉載體序列，拼接即得MrRab11全長cDNA 序列，查找開放閱讀框（ORF）并推測其氨基酸序列。通過Blast在線工具查找數(shù)據(jù)庫中同源序列，ClastalW2對同源序列比對分析； 用EXPASY工具分析蛋白的基本物理化學(xué)參數(shù)分析及功能結(jié)構(gòu)； SignalP 預(yù)測編碼蛋白信號肽；TMHMM 查找預(yù)測蛋白跨膜區(qū)域； PredictProtein工具預(yù)測MrRab11編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)； SWISSMODEL工具預(yù)測其三級結(jié)構(gòu)； Blastx從數(shù)據(jù)庫檢索MrRab11同源序； MAGE6.0軟件，NJ鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 MrRab11基因組織表達(dá)和免疫應(yīng)答分析

根據(jù)羅氏沼蝦β-actin基因序列（登錄號:AY62 6840.1）設(shè)計(jì)熒光定量PCR內(nèi)參引物Mrβ-actinF、Mrβ-actinR，產(chǎn)物長度為193 bp。在所得羅氏沼蝦R a b 1 1基因序列的開放閱讀框內(nèi)設(shè)計(jì)引物MrRab11-qF和MrRab11-qR，產(chǎn)物長度為197 bp。以正常羅氏沼蝦肝胰腺、肌肉、鰓、心臟、腸道和胃組織的樣品cDNA為模板，檢測Rab11基因在各個組織的表達(dá)情況； 以試驗(yàn)組和對照組在注射后不同時間點(diǎn)的組織樣品分析MrRab11對陰溝腸桿菌的免疫應(yīng)答。組織表達(dá)分析根據(jù)SYBR?Green qPCR預(yù)混液（Applied Biosystems）說明書，在ABI7300熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，40 cycles； 繪制溶解曲線。試驗(yàn)設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每個樣品進(jìn)行3個技術(shù)性重復(fù)，以2-ΔΔCt法結(jié)合SPSS19.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)比較分析。

2 結(jié)果

2.1 MrRab11 cDNA序列分析

將3′RACE獲得的Rab11片段和EST序列用SeqMan軟件進(jìn)行拼接后得到1381 bp的Rab11全長cDNA序列，經(jīng)BLAST和同源比對分析確認(rèn)為羅氏沼蝦Rab11基因。該序列包含226 bp的5′非編碼區(qū)（Untranslated Region，UTR），511 bp的3′非編碼區(qū)和645 bp的開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）。在3′UTR，有一個RNA不穩(wěn)定模體（RNA instability motif）ATTTA結(jié)構(gòu)，但沒有典型的polyA加尾信號AATAAA。

MrRab11編碼214個氨基酸，DNAstar軟件預(yù)測蛋白分子量約為23.75 kD，等電點(diǎn)約為5.34。BLASTX分析顯示該序列與GenBank中已知的岡比亞按蚊（XP_001238828.3）、蚤狀溞（EFX80521.1）、葉蟬（AAT01087.1）Rab11氨基酸序列一致性分別為82%、83%、82%。其二級結(jié)構(gòu)組成為α螺旋36.45%，β折疊17.29%，無規(guī)卷曲46.26%。SMART軟件分析顯示，MrRab11有1個Rab結(jié)構(gòu)域； SignalP軟件分析表明其不存在信號肽序列； TMHMM 軟件分析顯示MrRab11蛋白不存在跨膜區(qū)域； Swiss-Model軟件預(yù)測MrRab11的三維結(jié)構(gòu)，與其他Rab蛋白一樣，MrRab11含有一個由6個β折疊和5個α螺旋構(gòu)成的核心區(qū)域（圖 1）。

圖 1 羅氏沼蝦Rab11預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)

2.2 羅氏沼蝦Rab11系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

BLAST檢索得到MrRab11同源序列:葉蟬（Homalodisca vitripennis，AAT01087.1）、大西洋鮭（Salmo salar，ACI68958.1）、斑點(diǎn)叉尾鲖（Ictalurus furcatus，ADO28360.1）、人（Homo sapiens，CA G46492.1）、蚤狀溞（Daphnia pulex，EFX80521.1）、野牦牛（Bos mutus，ELR60022.1）、原鴿（Columba livia，EMC77353.1）、大家鼠（Rattus norvegicus，NP_116006.1）、果蠅（Drosophila melanogaster，NP_477170.1）、斑馬魚（Danio rerio，NP_0010 02555.1）、雞（Gallus gallus，NP_001005827.1）、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae，XP_001238828.3）、小蜜蜂（Apis florea，XP_003692576.1）、綠頭鴨（Anas platyrhynchos，XP_005015582.1）、揚(yáng)子鱷（Alligator sinensis，XP_006032658.1）、綠海龜（Chelonia mydas，XP_007064684.1）、葉吻銀鮫（Callorhinchus milii，XP_007906492.1）以及凡納濱對蝦部分序列（Litopenaeus vannamei，AER34937.1），用MAGE6.0軟件，以NJ鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果顯示MrRab11與凡納濱對蝦Rab11在進(jìn)化關(guān)系上最近，并和蚤狀溞Rab11聚為一支，其余Rab11以哺乳類、魚類、鳥類、昆蟲類、爬行類為單位形成5個分支，與傳統(tǒng)的分類方法所得結(jié)果一致。

2.3 MrRab11組織分布

實(shí)時熒光定量PCR 檢測了MrRab11在羅氏沼蝦肝胰腺（Hepatopancreas）、肌肉（Muscle）、鰓（Gill）、心臟（Heart）、腸道（Intestine）、胃（Stomach）、血液（Hemocytes）等組織的表達(dá)水平，結(jié)果每個擴(kuò)增曲線走勢正常，熔解曲線顯示單峰且峰值單一，說明引物的特異性較好，檢測體系比較穩(wěn)定，可靠性高。2-△△Ct法計(jì)算MrRab11的相對表達(dá)量，在檢測的組織中都有表達(dá)，肝胰腺中表達(dá)量顯著高于其他組織（P<0.05），其次是肌肉、腸道，其他組織表達(dá)量較低，無顯著差異（圖 3）。

圖 2 Rab11系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 MrRab11在不同組織對陰溝腸桿菌的應(yīng)激表達(dá)

為了探究MrRab11在細(xì)菌感染后的應(yīng)激表達(dá)，分別檢測了其在羅氏沼蝦感染陰溝腸桿菌后各組織不同時間點(diǎn)（0、0.5h、1.5h、3h、6h、12h、24h、48h和96h）的表達(dá)情況（圖 4）。與空白對照組相比0，羅氏沼蝦注射陰溝腸桿菌后，0.5h時肝胰腺中Rab11的表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.05），但試驗(yàn)組和對照組沒有顯著差異； 12h時再次升高，且試驗(yàn)組顯著高于對照組（P<0.05）。在肌肉中，0.5h時MrRab11表達(dá)量上調(diào)，3h時回到正常水平0h； 24h時再次上升，試驗(yàn)組與對照組無顯著差異。腸道中，注射0.5h后Rab11表達(dá)量顯著上升（P<0.05），試驗(yàn)組和對照組無顯著差異，48h后回到正常水平。鰓、心臟、胃等組織表達(dá)量低，注射后無顯著變化，且試驗(yàn)組與對照組也無顯著差異。

3 討論

圖 3 MrRab11在不同組織的相對表達(dá)

本研究從羅氏沼蝦基因組中成功克隆MrRab11基因，該基因序列和其他物種Rab11序列相似度在80%左右，具有較高的同源性。MrRab11含有Rab GTP酶家族所特有的5個氨基酸序列，該模體序列是鑒別Rab 蛋白一種較為準(zhǔn)確的方法［24］。預(yù)測蛋白包含有1個Rab結(jié)構(gòu)域和5個G結(jié)構(gòu)域（G1-G5），Rab結(jié)構(gòu)域是Rab蛋白家族共有的保守區(qū)，G結(jié)構(gòu)域是GTP結(jié)合和水解區(qū)域，在整個Ras小分子GTP酶超家族成員中都具有保守性。這些都印證了同源Rab基因結(jié)構(gòu)上高度保守［25］。同其他Rab11一樣，MrRab11上有兩個分別稱作開關(guān)Ⅰ和開關(guān)Ⅱ的區(qū)域，是Rab11與GDP、GTP結(jié)合的兩種狀態(tài)之間構(gòu)像發(fā)生變化的位置，當(dāng) Rab11和GTP結(jié)合時處于活化狀態(tài)，可以識別其效應(yīng)因子并執(zhí)行各種功能，GTP水解變?yōu)镚DP后變?yōu)闊o活性狀態(tài)，這在Rab11與其調(diào)節(jié)蛋白的相互作用、免疫防御等發(fā)揮關(guān)鍵作用［26］。蛋白預(yù)測分析表明MrRab11不存在跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，推測這是因?yàn)镽ab11是一種胞內(nèi)GTP酶，在細(xì)胞膜內(nèi)調(diào)節(jié)生命活動。

圖 4 陰溝腸桿菌感染后Rab11在各組織的表達(dá)情況

多數(shù)Rab蛋白沒有組織特異性，但也有研究發(fā)現(xiàn)少數(shù)Rab蛋白僅在特定的組織表達(dá)，如家蠶Rab7只在腦、卵巢、精巢表達(dá)［27］，Rab3A只在神經(jīng)分泌細(xì)胞表達(dá)［28］，組織特異性表達(dá)暗示這些Rab蛋白具有獨(dú)特的作用。本研究對MrRab11在羅氏沼蝦各組織表達(dá)分析表明:MrRab11在肝胰腺、肌肉、腸道等組織表達(dá)量相對較高，在鰓、心臟、胃、血液等組織少量表達(dá)，沒有明顯組織特異性。類似的，Rab基因在日本對蝦血淋巴、肝胰腺、肌肉、鰓、心臟、腸道等組織都有廣泛表達(dá)［29］。肝胰腺是蝦類體液免疫和細(xì)胞免疫的重要場所［30，31］，很多與免疫相關(guān)基因已經(jīng)被證實(shí)在肝胰腺中有很高的表達(dá)量［32］。腸道是消化吸收的器官，會有各種包含病原體的微生物隨著食物進(jìn)入，同時Rab蛋白參與吞噬體的形成及成熟過程［33］，因此推測MrRab 11在羅氏沼蝦肝胰腺、肌肉和腸道的高表達(dá)量與其先天性免疫過程有關(guān)。

在研究免疫應(yīng)答試驗(yàn)中，注射器及其他因素對生物體刺激都可能顯著影響基因的表達(dá)水平［34］，為了避免這些刺激帶來的影響，本試驗(yàn)設(shè)置了對照組，相同時間分別對試驗(yàn)組和對照組取樣。熒光定量PCR檢測了羅氏沼蝦注射陰溝腸桿菌后MrRab11的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對照相比0.5h，注射0.5—1.5h后，在肝胰腺、肌肉、腸道中Rab11的表達(dá)量都有一個先上升后下降的趨勢，在肌肉中24h時又顯著上升，但試驗(yàn)組和對照組變化同步，沒有顯著差異，推測這是由于MrRab11對注射時的刺激及生理鹽水的應(yīng)激反應(yīng)，從而試驗(yàn)組和對照組變化沒有差異。而在注射后12h時，試驗(yàn)組肝胰腺中MrRab11的表達(dá)量上升，顯著高于對照組（P<0.05），推測這是MrRab11對細(xì)菌感染的應(yīng)激表達(dá)，因?yàn)楦我认偈侵匾拿庖咂鞴伲?5］，對細(xì)菌等病原感染會有明顯的免疫應(yīng)答反應(yīng)； 而其他組織對外來病原的免疫應(yīng)答功能可能不如肝胰腺，只對針頭注射等生理刺激才會有應(yīng)答反應(yīng)，因此，本試驗(yàn)在注射陰溝腸桿菌后，肌肉、鰓、心臟等組織中試驗(yàn)組和對照組MrRab11的表達(dá)量沒有顯著差異。試驗(yàn)結(jié)果與斑點(diǎn)叉尾鲖［12，13］、中華絨螯蟹［14］、日本對蝦［15］等感染細(xì)菌后Rab基因的應(yīng)激表達(dá)結(jié)果相似，推測在本試驗(yàn)中MrRab11參與了羅氏沼蝦對陰溝腸桿菌的免疫應(yīng)答，下一步可以利用基因敲除等手段來驗(yàn)證其功能，并展開對Rab家族其他相關(guān)基因的研究，弄清它們在羅氏沼蝦免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制和地位。

本研究根據(jù)EST序列，以RACE-PCR方法克隆獲得羅氏沼蝦MrRab11全長cDNA序列，該序列含有Rab家族特有的結(jié)構(gòu)特征。以qRT-PCR方法分析了MrRab11的組織表達(dá)情況，結(jié)果顯示MrRab11在肝胰腺的表達(dá)量最高，其次是肌肉和腸道。通過病原刺激的方法，誘導(dǎo)MrRab11的免疫應(yīng)答，結(jié)果顯示注射12h后，試驗(yàn)組肝胰臟中MrRab11相對表達(dá)量顯著上調(diào)，推測MrRab11參與了羅氏沼蝦感染陰溝腸桿菌后的免疫應(yīng)答過程。對于主要依賴自身的先天非特異免疫機(jī)制進(jìn)行免疫防御的蝦蟹來講，這在今后病害防治、良種培育等方面都有重要參考價值。

參 考 文 獻(xiàn)：

［1］Schwartz L，Canhong C，Olena P，et al.Alexey Rak and Angela Wandinger-Ness.Rab GTPases at a glance［J］.Journal of Cell Science，2007，120（22）:3905—3910

［2］Pereira-Leal J B，Seabra M C.Evolution of the Rab family of small GTP-binding proteins［J］.Journal of Molecular Biology，2001，313（4）:889—901

［3］Schwartz S L，Cao C，Pylypenko O，et al.Rab GTPases at a glance［J］.Journal of Cell Science，2007，120（22）:3905—3910

［4］Welter B H，Temesvari L A.A unique Rab GTPase，EhRabA，of Entamoeba histolytica，localizes to the leading edge of motile cells［J］.Molecular and Biochemical Parasitology，2004，135（2）:185—195

［5］Ali B R，Seabra M C.Targeting of Rab GTPases to cellular membranes［J］.Biochemical Society Transactions，2005，33（4）:652—656

［6］Pfeffer S.A model for Rab GTPase localization［J］.Biochemical Society Transactions，2005，33（4）:627—630

［7］Jordens I，Marsman M，Kuijl C，et al.Rab proteins，connecting transport and vesicle fusion［J］.Traffic，2005，6（12）:1070—1077

［8］Hong M J，Lee Y M，Son Y S，et al.Rice Rab11 is required for JA-mediated defense signaling［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2013，434（4）:797—802

［9］Li X，Valencia A，McClory H，et al.Deficient Rab11 activity underlies glucose hypometabolism in primary neurons of Huntington's disease mice［J］.Biophysical Research Communications，2012，421（4）:727—730

［10］Palmieri D，Bouadis A，Ronchetti R，et al.Rab11a differentially modulates epidermal growth factor-induced proliferation and motility in immortal breast cells［J］.Breast Cancer Research and Treatment，2006，100（2）:127—137

［11］Chia W J，Tang B L.Emerging roles for Rab family GTPases in human cancer［J］.Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics，2009，1795（2）:110—116

［12］Sun F，Peatman E，Li C，et al.Transcriptomic signatures of attachment，NF-κB suppression and IFN stimulation in the catfish gill following columnaris bacterial infection［J］.Developmental and Comparative Immunology，2012，38（1）:169—80

［13］Liu S，Zhang Y，Zhou Z，et al.Efficient assembly and annotation of the transcriptome of catfish by RNA-Seq analysis of a doubled haploid homozygote［J］.BioMed Central Genomics，2012，13:595

［14］Wang L，Li L，Wang L，et al.Two Rab GTPases，EsRab-1 and EsRab-3，involved in anti-bacterial response of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis［J］.Fish & Shellfish Immunology，2013，35（3）:1007—1015

［15］Zong R，Wu W，Xu J，et al.Regulation of phagocytosis against bacterium by Rab GTPase in shrimp Marsupenaeus japonicus［J］.Fish & Shellfish Immunology，2008，25（3）:258—263

［16］Murray J L，Mavrakis M，McDonald N J，et al.Rab9 GTPase is required for replication of human immunodeficiency virus type 1，filoviruses，and measles virus［J］.Journal of Virology，2005，79（18）:11742—11751

［17］Krzewski K，Cullinane A R.Evidence for defective Rab GTPase-dependent cargo traffic in immune disorders［J］.Experimental Cell Research，2013，319（15）:2360—2367

［18］Ongvarrasopone C，Chanasakulniyom M，Sritunyalucksana K，et al.Suppression of PmRab7 by dsRNA inhibits WSSV or YHV infection in shrimp［J］.Marine Biotechnology，2008，10（4）:374—381

［19］Sritunyalucksana K，Wannapapho W，Lo C F，et al.Pm-Rab7 is a VP28-binding protein involved in white spot syndrome virus infection in shrimp［J］.Journal of Virology，2006，80（21）:10734—10742

［20］Yang G L，Luo K，Kong J，et al.Correlation of growth and survivorship for Macrobrachium rosenbergii in different culture conditions［J］.Marine Fisheries Research，2008，29（3）:74—79［楊國梁，王軍毅，孔杰，等.羅氏沼蝦大規(guī)模家系構(gòu)建與培育技術(shù)研究.海洋水產(chǎn)研究，2008，29（3）:74—79］

［21］Yang G L，Chen X F，Wang J Y，et al.Social and economical factors of sustained growth of Macrobrachium rosenbergii industry in mainland China［J］.Journal of Zhejiang Ocean University（Natural Science），2011，30（5）:450—457［楊國梁，陳雪峰，王軍毅，等.羅氏沼蝦產(chǎn)業(yè)在中國持續(xù)增長的經(jīng)濟(jì)與社會原因分析.2011，浙江海洋學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），30（5）:450—457］

［22］Qian D，Shi Z L，Zhang S Y，et al.Extra small virus-like particles（XSV）and nodavirus associated with whitish muscle disease in the giant freshwater prawn，Macrobrachium rosenbergii［J］.Journal of Fish Diseases，2003，26（9）:521—527

［23］Qian D，Shi Z L，Cao Z，et al.Isolation and characterization of Nodavirus caused whitish muscle diseases in Macrobrachium rosenbergii larvae［J］.Journal of Fishery Sciences of China，2003，10（6）:457—461［錢冬，石正麗，曹錚，等.羅氏沼蝦苗種肌肉白濁病諾達(dá)病毒的分離和特性研究.中國水產(chǎn)科學(xué)，2003，10（6）:457—461］

［24］Pereira-Leal J B，Seabra M C.The mammalian Rab family of small GTPases:definition of family and subfamily sequence motifs suggests a mechanism for functional specificity in the Ras superfamily［J］.Journal of Molecular Biology，2000，301（4）:1077—1087

［25］Kelly E E，Horgan C P，Goud B，et al.The Rab family of proteins:25 years on［J］.Biochemical Society Transactions，2012，40（6）:1337—1347

［26］Pasqualato S，Senic-Matuglia F，Renault L，et al.The structural GDP/GTP cycle of Rab11 reveals a novel interface involved in the dynamics of recycling endosomes［J］.The Journal of Biological Chemistry，2004，279（12）:11480—11488

［27］Uno T，Hata K，Hiragaki S，et al.Small GTPases of the Rab family in the brain of Bombyx mori［J］.Histochemistry and Cell Biology，2010，134（6）:615—622

［28］Stenmark H，Olkkonen V M.The Rab GTPase family［J］.Genome Biology，2001，2（5）:1—7

［29］Wu W L，Zhang X B.Characterization of a Rab GTPase up-regulated in the shrimp Peneaus japonicus by virus infection［J］.Fish & Shellfish Immunology，2007，23:438—445

［30］Lee S Y，Wang R，Soderhall K.A lipopolysaccharide and b-1，3-glucan binding protein from hemocytes of the freshwater crayfish Pacifastacus leniusculus.Purification，characterization and cDNA cloning［J］.Journal of Biological Chemistry，2000，275:1337—1343

［31］Sritunyalucksana K，Wongsuebsantati K，Johansson M W，et al.Peroxinectin，a cell adhesive protein associated with the proPO system from the black tiger shrimp，Penaeus monodon［J］.Developmental and Comparative Immunology，2001，25:353—363

［32］Gross P S，Bartlett T C，Browdy C L，et al.Immune gene discovery by expressed sequence tag analysis of haemocytes and hepatopancreas in the Pacific White Shrimp，Litopenaeus vannamei，and the Atlantic White Shrimp，Litopenaeus setiferus［J］.Developmental and Comparative Immunology，2001，25（7）:565—577

［33］Rupper A，Cardelli J.Regulation of phagocytosis andendo-phagosomal trafficking pathways in Dictyostelium discoideum［J］.Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects，2001，1525（3）:205—216

［34］Chutima S，Siwaporn L，Saengchan S，et al.Molecular cloning and characterization of a Toll receptor gene from Macrobrachium rosenbergii［J］.Fish & Shellfish Immunology，2014，36（2）:552—562

［35］Ji P F，Yao C L，Wang Z Y.Immune response and gene expression in shrimp（Litopenaeus vannamei）hemocytes and hepatopancreas against some pathogen-associated molecular patterns［J］.Fish & Shellfish Immunology，2009，27（4）:563—570

MOLECULAR CHARACTERIZATION AND EXPRESSION RESEARCH OF RAB11 FROM GIANT FRESHWATER PRAWN，MACROBRACHIUM ROSENBERGII

XIA Zheng-Long，HUANG Xue-Na，HUANG Zhen-Yuan，CHEN Xue-Feng，GAO Qiang，PU Jian-Wei，SHEN Pei-Jing，PENG Fei and YANG Guo-Liang
（Key Laboratory of Freshwater Aquatic Animal Genetic Breeding of Zhejiang Province，National Genetic Breeding Center for Macrobrachium Rosenbergii，Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries，Huzhou 313001，China）

Abstract:Rabs play important role in vesicular transport in all eukaryotic cells.The current study successfully cloned the full-length cDNA of a Rab gene of Macrobrachium rosenbergii（named MrRab11）by the rapid amplification of cDNA ends（RACE）techniques.The full-length of MrRab11 cDNA was 1381 bp，including a 226 bp 5′-terminal untranslated region（UTR），a 511 bp 3′UTR and a 645 bp open reading frame（ORF）encoding a polypeptide of 214 amino acids residues that contain a Rab domain.The calculated molecular mass of deduced MrRab11 polypeptide was 23.75 kD and the isoelectric point was 5.34.BLASTX analysis revealed that MrRab11 had significant homology to Anopheles gambiae，Daphnia pulex and Homalodisca vitripennis with the identity of 82%，83% and 82%，respectively.Quantitative real-time reverse transcription PCR analysis demonstrated a broad expression of MrRab11 in many tissues with the highest level in hepatopancreas and then muscle and intestine.The expression level of MrRab11 in hepatopancreas was significantly（P<0.05）induced by Enterobacter cloacae at 12h.These results suggest that MrRab11 may play a role in the innate immunity of M.rosenbergii.

Key words:Macrobrachium rosenbergii； Rab11； Tissue expressions； Immunological response

中圖分類號：Q344+.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3207（2016）03-0443-08

doi:10.7541/2016.59

收稿日期：2015-04-30；

修訂日期：2016-01-20

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金（LY12C19008）； 國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD26B04）； 浙江省重大科技專項(xiàng)（2012C12907）； 浙江省科研院所專項(xiàng)（2014F50002）資助［Supported by Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China（LY12C19008）； National Key Technologies R & D Program of China（2012BAD26B04）； Major Science and Technology Projects of Zhejiang Province（2012C12907）； Scientific Research Institutes Special Project of Zhejiang Province（2014F50002）］

作者簡介：夏正龍（1987—），男，浙江龍泉人； 碩士研究生； 主要從事水產(chǎn)遺傳育種工作。E-mail:zjhill@126.com

通信作者：楊國梁，E-mail:ygl0572@163.com