盧翠玉李 炎劉慶慧呂利群（.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)部淡水種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 0306； .中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島 6607）

免疫刺激誘導(dǎo)草魚腫瘤壞死因子TNF-α的體外表達(dá)特征研究

盧翠玉1，2李 炎1劉慶慧2呂利群1
（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)部淡水種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306； 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島 266071）

摘要：為了闡明免疫刺激誘導(dǎo)草魚腫瘤壞死因子TNF-α的體外表達(dá)特征，克隆了草魚TNF-α的cDNA，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-32-TNF-α，并在大腸桿菌DH5α中表達(dá)了His6-TNF-α。利用親和層析鎳柱純化表達(dá)重組蛋白后將其作為免疫原免疫小鼠制備了抗草魚TNF-α多克隆抗體。免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示，制備的抗體能特異性識(shí)別細(xì)胞內(nèi)源性TNF-α。在此基礎(chǔ)上，分別研究了GCRV（草魚呼腸孤病毒）感染、免疫刺激物Poly（I:C）及LPS處理下不同時(shí)間點(diǎn)草魚腎細(xì)胞CIK中TNF-α的表達(dá)情況，結(jié)果表明，TNF-α在草魚腎細(xì)胞內(nèi)翻譯水平的表達(dá)量基本保持穩(wěn)定。研究顯示經(jīng)典的TNF信號(hào)通路激活因子不能引起CIK細(xì)胞內(nèi)TNF-α蛋白水平的顯著變化。

關(guān)鍵詞：草魚呼腸孤病毒； 腫瘤壞死因子TNF-α； 原核表達(dá)； 多克隆抗體

草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）是草魚病毒性出血病的致病病原。由GCRV引起的草魚出血病在中國(guó)、朝鮮、越南等亞洲國(guó)家危害嚴(yán)重［1—3］。在分類學(xué)上，草魚呼腸孤病毒屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae），水生呼腸孤病毒屬（Aquareovirus），完整的病毒粒子含11條分節(jié)段雙鏈RNA基因組和雙層蛋白質(zhì)衣殼。迄今，我國(guó)水產(chǎn)科學(xué)工作者已從發(fā)病草魚中分離出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種類型草魚呼腸孤病毒［1—4］。由于Ⅰ型呼腸孤病毒被確定并研究的時(shí)間較長(zhǎng)，特別是其感染草魚腎細(xì)胞（CIK）能出現(xiàn)快速且顯著的細(xì)胞病變現(xiàn)象，Ⅰ型GCRV和CIK細(xì)胞成為了為體外研究魚類抗病毒先天免疫的良好細(xì)胞模型，Ⅰ型GCRV也逐漸成為了國(guó)際公認(rèn)的研究水生動(dòng)物呼腸孤病毒的模式毒株［5］。有研究表明，腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）介導(dǎo)的信號(hào)通路可能與草魚呼腸孤病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)［6］。

TNF由Carswell等發(fā)現(xiàn)于1975年，因其能抑制和殺傷某些腫瘤細(xì)胞，并使體內(nèi)腫瘤發(fā)生出血壞死而得名。TNF按其結(jié)構(gòu)分兩型:TNF-α和TNF-β，Shalaby等把由活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子命名為TNF-α［7］。目前國(guó)際上對(duì)TNF-a的研究比較深入。TNF不僅對(duì)多種腫瘤具有細(xì)胞毒作用，并參與機(jī)體炎癥與免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等重要作用，與休克、發(fā)熱、多器官功能衰竭及惡病質(zhì)等均有密切關(guān)系。在分子生物學(xué)研究進(jìn)展突出，先后完成了基因定位、cDNA克隆、mRNA 表達(dá)以及分子水平的檢測(cè)，科學(xué)界對(duì)TNF作用的了解正不斷深入［7］。

目前，多種魚類的TNF-α基因已經(jīng)被克隆，如牙鲆［8］、鯉、斑馬魚、虹鱒和草魚等。草魚經(jīng)免疫刺激物L(fēng)PS體外刺激后的早期，特別是在12h之內(nèi)TNF-α轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)明顯上調(diào)［9，10］，但LPS對(duì)金頭鯛巨噬細(xì)胞的TNF-α基因的表達(dá)卻沒(méi)有刺激作用［11］。Ⅰ型GCRV感染和免疫刺激物poly（I:C）刺激CIK也能引起TNF-α轉(zhuǎn)錄水平瞬時(shí)上調(diào)。現(xiàn)有的魚類TNF-α應(yīng)激表達(dá)研究均停留在轉(zhuǎn)錄水平上。由于TNF-α的表達(dá)不但在轉(zhuǎn)錄水平受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控［12］，也存在復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制［13］，因此轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量變化的研究結(jié)果不足以說(shuō)明TNF-α信號(hào)通路的應(yīng)激反應(yīng)。不同細(xì)胞中TNF-α信號(hào)通路的反應(yīng)性也不盡相同，目前也沒(méi)有足夠生物學(xué)證據(jù)表明CIK細(xì)胞適合用于研究草魚所有細(xì)胞水平的抗病毒先天免疫反應(yīng)。本研究通過(guò)制備TNF-α多克隆抗體，從翻譯水平檢測(cè)在病毒感染過(guò)程中或不同免疫刺激劑作用下草魚CIK細(xì)胞內(nèi)TNF-α蛋白表達(dá)量的變化，旨在厘清CIK細(xì)胞是否適合于研究TNF-α信號(hào)通路的應(yīng)激反應(yīng)，并為下一步探索在草魚免疫應(yīng)答中特定免疫細(xì)胞類型或器官介導(dǎo)的TNF-α免疫應(yīng)答奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

I型草魚呼腸孤病毒JX-01株（由本實(shí)驗(yàn)室保存）；草魚腎細(xì)胞CIK（購(gòu)自武漢大學(xué)國(guó)家組織培養(yǎng)物保藏中心），在添加10%牛胚胎血清的M199 Medium培養(yǎng)基（購(gòu)自上海吉諾生物科技有限公司）中培養(yǎng)；ICR小白鼠（購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心），4周齡雌性小鼠； 聚肌胞甘酸，炎性刺激物脂多糖（LPS）（購(gòu)自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）。

1.2 GCRV感染草魚腎細(xì)胞

在75 cm2培養(yǎng)瓶中于28℃恒溫培養(yǎng)CIK細(xì)胞，48h后將培養(yǎng)至80%—90%且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CIK細(xì)胞用胰酶消化，用完全培養(yǎng)基稀釋使細(xì)胞濃度達(dá)到1×107/mL。按每孔0.5 mL細(xì)胞懸液將CIK細(xì)胞傳至含完全培養(yǎng)基（2 mL/孔）的6孔板。細(xì)胞貼壁完成后吸除培養(yǎng)液并用感染復(fù)數(shù)為1的GCRV感染細(xì)胞，1h后吸出病毒液，用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次，然后添加完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在0、4h、8h、12h和24h用NP-40裂解液收集細(xì)胞。

1.3 聚肌胞甘酸和細(xì)菌脂多糖分別刺激CIK細(xì)胞

Poly（I:C）用無(wú)菌PBS溶解，配制成1 mg/mL儲(chǔ)備液，0.22 μm濾膜過(guò)濾，取適量用PBS稀釋后（終濃度5 μg/mL）刺激CIK細(xì)胞，對(duì)照組用等量PBS處理，分別在0、4h、8h、12h和24h用NP-40裂解液收集細(xì)胞。

LPS用無(wú)菌雙蒸水溶解，配制成600 μg/mL儲(chǔ)備液，取適量稀釋后（終濃度30 μg/mL）刺激CIK細(xì)胞，分別在0、4h、8h、12h和24h用NP-40裂解液收集細(xì)胞。

1.4 pET32a（+）-TNF-α重組質(zhì)粒構(gòu)建

Trizol法提取草魚草魚腎細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中同源比對(duì)出保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，分別為sTNF-P32-F1 5′-CGCGGATCCATGAGAGATCATTTTTCAA AAGC-3′（下劃線序列為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)），sTNFP32-R1 5′-CCGCTCGAGGCAGAGCAAACAC CCCAAAAAAG-3′（下劃線序列為XhoⅠ酶切位點(diǎn)），用上述引物通過(guò)溫度梯度PCR擴(kuò)增TNF-α片段。凝膠電泳獲得目的條帶后用膠回收試劑盒回收目的片段，分別用BamH Ⅰ、XhoⅠ酶切后用T4 DNA連接酶連接TNF-α目的片段和pET-32a（+），將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆，菌液PCR鑒定為陽(yáng)性的提取質(zhì)粒，提取的重組質(zhì)粒通過(guò)雙酶切驗(yàn)證和測(cè)序（由上海生工生物工程股份有限公司完成）鑒定都正確后，命名為pET-32a（+）-TNF-α（圖 1）?；罨木阂?∶100接種于200 mL含氨芐青霉素培養(yǎng)液中，37℃，180 r/min搖床5h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.5 pET32a（+）-TNF-α蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

pET32a（+）-TNF-α蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。向菌液中加入0.1 mmol/L（終濃度）IPTG，37℃，90 r/min搖床誘導(dǎo)6h。

1.6 pET32a（+）-TNF-α蛋白純化

收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，菌液離心后棄上清，每克菌體約加10 mL Wash Buffer進(jìn)行懸浮。加入0.2 mg/mL溶菌酶處理，同時(shí)加入1 mmol/L（終濃度）PMSF、蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物，防止蛋白降解，冰浴30min后超聲破碎100次，之后12000 r/min，4℃離心20min，棄上清，沉淀用2 mol/L尿素（用PBS溶解）溶解，8500 r/min，4℃，離心15min，棄上清，繼續(xù)用4和6 mol/L尿素各洗一次，沉淀用8 mol/L的尿素溶解，8500 r/min離心25min后取上清用0.45 μm濾膜過(guò)濾，加入10 mmol/L（終濃度）DTT和1% Triton，按1∶50比例在上清中加入Resin（使用前用Wash Buffer平衡），采用親和層析柱鎳低溫結(jié)合6—12h。Wash Buffer清洗過(guò)后用Eluting Buffer洗脫。洗脫樣品分別取適量樣品，加入蛋白裂解液，SDS-PAGE檢測(cè)。

蛋白濃度檢測(cè)。用改良型Brandford法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定純化后的蛋白濃度。

1.7 TNF-α多克隆抗體制備

將純化好的pET32-TNF-α蛋白調(diào)至1 mg/mL，并且分裝至1.5 mL EP管于-80℃保存。然后將其免疫4周齡雌性ICR小鼠，抗原注射量約200 μg/只/次，共免疫4只小鼠。第1次免疫為腹腔注射，將抗原蛋白與等體積FCA（弗氏完全佐劑）（Sigma公司）用1 mL無(wú)菌注射器反復(fù)吹打，充分混和均勻，直至滴入水中呈乳白色液滴且不會(huì)擴(kuò)散時(shí)方可進(jìn)行免疫； 14d后進(jìn)行第2次腹腔注射，將抗原蛋白與等體積弗氏不完全佐劑用1 mL無(wú)菌注射器反復(fù)吹打混勻，注射； 一周之后進(jìn)行第3次免疫，將純抗原pET32a（+）-TNF-α蛋白采用小鼠背部皮下多點(diǎn)注射的方法進(jìn)行免疫，3d后斷尾取血，做Western Blot檢測(cè)； 4d后第4次加強(qiáng)免疫后3d，采用摘眼球取血的方式取血，將采集到的血液傾斜放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中1h，4℃過(guò)夜，3000 r/min離心20min，取上清分裝多個(gè)EP管-80℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.8 體外檢測(cè)草魚TNF-α蛋白表達(dá)特征

利用已制備抗pET32a（+）-TNF-α抗體作為一抗，Western Blot檢測(cè)病原或免疫刺激劑刺激條件下草魚腎細(xì)胞TNF-α蛋白表達(dá)量變化。同時(shí)采用抗GAPDH多抗作為一抗檢測(cè)GAPDH表達(dá)量作為對(duì)照。

提前將轉(zhuǎn)膜所用兩層海綿與六層濾紙浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min，并準(zhǔn)備好割膠板，剪刀，鑷子和玻璃棒。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，將凝膠切下來(lái)，并浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，同時(shí)用無(wú)水甲醇中活化PVDF膜（0.45 μm）15s，再浸泡在ddH2O中2min，之后在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡1min左右，在半干轉(zhuǎn)膜設(shè)備上制作轉(zhuǎn)膜三明治，從負(fù)極到正極依次是海綿，三層濾紙，膠，PVDF膜，三層濾紙，海綿。100 V，45min轉(zhuǎn)膜后用含5%脫脂牛奶的PBST封閉3h，用相應(yīng)一抗4℃過(guò)夜孵育，PBST清洗8次，每次5min，用1∶5000相應(yīng)二抗37℃孵育2h后用DAB顯色試劑顯色，膜晾干后在凝膠成像儀下拍照保存結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建草魚TNF-α基因編碼區(qū)序列的原核表達(dá)質(zhì)粒及His6- TNF-α的原核表達(dá)

pET32a（+）質(zhì)粒是一種常用的大腸桿菌表達(dá)載體，被用于表達(dá)攜帶6個(gè)His接頭的重組蛋白。利用RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)從草魚總RNA序列中擴(kuò)增得到草魚TNF-α基因的全長(zhǎng)cDNA（圖 1），瓊脂糖凝膠電泳分析的結(jié)果顯示該片段與預(yù)計(jì)片段大小接近。利用膠DNA回收試劑盒回收產(chǎn)物后進(jìn)行雙酶切，并選接到經(jīng)相同雙酶切的載體上。連接后的DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α，獲得的菌落經(jīng)菌落PCR初篩后，陽(yáng)性單克隆菌落送生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)來(lái)顯示該片段為草魚TNF-α，通過(guò)NCBI BLAST比對(duì)分析，該核苷酸序列與已報(bào)道的草魚TNF-α序列一致，說(shuō)明原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a（+）-TNF-α轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可以表達(dá)出目的蛋白。本研究對(duì)His6-TNF-α在細(xì)菌中的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，使用0.1 mmol/L濃度IPTG在37℃誘導(dǎo)6h即可實(shí)現(xiàn)目的蛋白高表達(dá)（圖 1）。

2.2 His6-TNF-α的純化及其His6-TNF-α多克隆抗體制備

將His6-TNF-α重組蛋白表達(dá)后，超聲波破碎分析發(fā)現(xiàn)該重組蛋白主要以包涵體的形式存在，所以將其用尿素，His-link purification resin及結(jié)合液Buffer C、漂洗液Buffer D、洗脫Buffer E溶液純化蛋白，Buffer E溶液可以添加不同濃度的咪唑。為了驗(yàn)證上述純化的His6-TNF-α重組蛋白是否含有組氨酸標(biāo)簽，利用商品化的抗組氨酸單抗檢測(cè)，結(jié)果顯示，所純化的蛋白即為His6-TNF-α（圖 2A）。利用所純化的His6-TNF-α蛋白做免疫原，免疫小鼠制備多克隆抗體。利用純化的His6-TNF-α和草魚腎細(xì)胞樣品，檢測(cè)該多克隆抗體的特異性。免疫學(xué)檢測(cè)方法顯示，所制備的多克隆抗體既能識(shí)別原核表達(dá)的His6-TNF-α，也能識(shí)別細(xì)胞內(nèi)源性的TNF-α（圖2B）。

圖 1 IPTG濃度的優(yōu)化

2.3 GCRV感染過(guò)程中CIK細(xì)胞TNF-α蛋白表達(dá)量的Western Blot檢測(cè)

為了闡明GCRV感染過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)TNF-α的表達(dá)特征表達(dá)，利用制備的抗體對(duì)細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)。利用所制備的抗TNF-α抗體檢測(cè)GCRV感染后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞TNF-α的表達(dá)水平。Western blot結(jié)果顯示，病毒感染過(guò)程中TNF-α表達(dá)水平維持穩(wěn)定（圖 3）。

2.4 Poly（I:C）刺激CIK細(xì)胞后TNF-α的應(yīng)激表達(dá)

Poly（I:C）是雙鏈RNA結(jié)構(gòu)類似物，是常用的免疫刺激劑，常用于誘導(dǎo)抗病毒先天免疫基因。為了闡明Poly（I:C）刺激下CIK細(xì)胞內(nèi)TNF-α蛋白水平的表達(dá)變化，本文利用制備的抗TNF-α多克隆抗體對(duì)poly（I:C）刺激后不同時(shí)間點(diǎn)的CIK細(xì)胞進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)。Western blot 結(jié)果顯示:CIK細(xì)胞內(nèi)的TNF-α表達(dá)量基本保持穩(wěn)定（圖 4）。

圖 2 純化His6- TNF-α及His6-TNF-α多克隆抗體在CIK細(xì)胞內(nèi)的免疫學(xué)檢測(cè)

圖 3 草魚呼腸孤病毒GCRV感染過(guò)程中細(xì)胞TNF-α表達(dá)的免疫學(xué)檢測(cè)

2.5 LPS刺激CIK細(xì)胞后TNF-α的應(yīng)激表達(dá)

LPS是細(xì)菌外膜成分，是常用的免疫刺激劑，常用于誘導(dǎo)抗細(xì)菌先天免疫基因。為了闡明LPS刺激下CIK細(xì)胞內(nèi)TNF-α蛋白水平的表達(dá)變化，本文利用制備的抗TNF-α多克隆抗體對(duì)LPS刺激后不同時(shí)間點(diǎn)的CIK細(xì)胞進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)。Western blot 結(jié)果顯示:CIK細(xì)胞內(nèi)的TNF-α表達(dá)量基本保持穩(wěn)定（圖 5）。

3 討論

哺乳動(dòng)物TNF-α作為一個(gè)在先天免疫和獲得性免疫中發(fā)揮多種功能的炎性細(xì)胞因子，通常在免疫刺激下由巨噬/單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等多種細(xì)胞表達(dá)［14］。關(guān)于多種魚類TNF-α的初步研究表明其可能具有與哺乳動(dòng)物同源蛋白相似的功能［15—17］。然而，限于魚類免疫細(xì)胞研究的滯后，很多相關(guān)研究只局限于魚體免疫組織［18］； 在細(xì)胞水平闡明草魚TNF-α的應(yīng)激表達(dá)水平的研究迄今為止只局限于草魚CIK細(xì)胞［10］或原代頭腎總白細(xì)胞［9］。而且，在草魚TNF的研究中尚無(wú)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的研究結(jié)果。為了闡明轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)是否意味著TNF-α在翻譯水平的表達(dá)也會(huì)發(fā)生上調(diào)，本文制備了高特異性的抗草魚TNF-α抗體。選取PET32載體在細(xì)菌中表達(dá)TNF-α作為免疫原制備抗體是因?yàn)樵撦d體表達(dá)真核蛋白成功的概率比較高。本文發(fā)現(xiàn)該載體表達(dá)的TNF-α在細(xì)菌中主要以包涵體存在。雖然在變形條件下可以利用鎳柱純化包涵體蛋白，并成功用于免疫小鼠制備抗體，本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果只是表明原核表達(dá)的TNF-α具有免疫原性。由于變性后的TNF-α?xí)适锘钚?，本文并沒(méi)有進(jìn)一步利用純化的重組TNF-α蛋白作為細(xì)胞因子研究其對(duì)細(xì)胞表面TNF-α受體蛋白的激活效應(yīng)。

圖 4 Poly（I:C）刺激后細(xì)胞TNF-α表達(dá)的免疫學(xué)檢測(cè)

圖 5 LPS刺激后細(xì)胞TNF-α表達(dá)的免疫學(xué)檢測(cè)

本文研究了GCRV病毒感染、Poly（I:C）處理及LPS處理等3種免疫刺激下CIK細(xì)胞內(nèi)源性TNF-α表達(dá)的變化情況。結(jié)果顯示，草魚腎細(xì)胞CIK細(xì)胞內(nèi)源性TNF-α的表達(dá)量在刺激前后基本保持穩(wěn)定。本文的研究結(jié)果表明CIK細(xì)胞可能不適合于研究草魚TNF-α信號(hào)通路，未來(lái)應(yīng)該選取魚體內(nèi)產(chǎn)生TNF-α免疫應(yīng)答的特定組織和細(xì)胞來(lái)開展研究。

盡管GCRV感染或Poly（I:C）刺激均能在CIK細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)TNF-α基因在轉(zhuǎn)錄水平瞬時(shí)顯著上升［10］；本研究表明轉(zhuǎn)錄水平的瞬時(shí)上升并沒(méi)有表現(xiàn)為翻譯水平的表達(dá)量上調(diào)。其原因可能與TNF-α的分泌表達(dá)性相關(guān)，另外也不排除草魚TNF-α基因存在復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。在哺乳動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α的轉(zhuǎn)錄受多種因子調(diào)控，包括:LITAFSTAT6、NF-kB、Ets、NF-AT、AP-1和C/EBPβ等［19］； 在轉(zhuǎn)錄后水平，TNF-α的調(diào)控因子包括Mk2/ MK3［20］、Tpl2/ERK［21］等。因此，轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控可能保證了TNF-α蛋白水平的穩(wěn)定。未來(lái)，我們計(jì)劃利用本文制備的特異性抗體建立ELISA檢測(cè)方法鑒定分泌表達(dá)的草魚TNF-α，利用免疫組化技術(shù)在魚體水平鑒定應(yīng)激表達(dá)TNF-α的免疫組織和細(xì)胞類型。

本文發(fā)現(xiàn)已有的草魚腎細(xì)胞系CIK中TNF-α表達(dá)水平在病毒等免疫刺激條件下仍然保持穩(wěn)定，顯示TNF-α介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路有可能沒(méi)有激活，這可能與該細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性相關(guān)［5］。鑒定合適的TNF-α誘導(dǎo)反應(yīng)性好的免疫類型細(xì)胞將有助于闡明TNF-α在蛋白水平的表達(dá)特征將有助于理解TNF-α信號(hào)通路與病原感染的相互關(guān)系，厘清TNF-α信號(hào)通路在抗病方面的作用機(jī)制。

參 考 文 獻(xiàn)：

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IN VITRO EXPRESSION PATTERN OF GRASS CARP TUMOR NECROSIS FACTOR（TNF-α）IN RESPONSE TO IMMUNE STIMULATION

LU Cui-Yu1，2，LI Yan1，LIU Qing-Hui2and Lü Li-Qun1
（1.Key Laboratory of Freshwater Fishery Germplasm Resources，Ministry of Agriculture，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China； 2.Yellow Sea Aquatic Research Institute of China Aquatic Institute，Qingdao 266071，China）

Abstract:Tumor necrosis factor alpha（TNF-α）is a multi-functional cytokine that plays important role in immune response，the homeostasis of the immune system，apoptosis，cell proliferation，and differentiation.Whether pathogen and immune stimulation can enhance the protein level of TNF-α is unclear.In this study，the cDNA of grass carp TNF-α was cloned into the prokaryotic expression vector pET-32 for expression of His6-tagged TNF-α.After purification through Ni2+-affinity chromotopraphy column，purified His6- TNF-α was subjected to immunize mouse to get polyclonal antibody，anti- TNF-α.Western blot analysis showed that the anti- TNF-α could specifically recognize endogenic grass carp TNF-α as well as His6- TNF-α.Furthermore，our results indicated that the CIK TNF-α level remain constant when challenged with GCRV or treated with immune stimulators in vitro.Since CIK cells seemed to be not a good cell line in investigating the response of TNF alpha signal pathway to stress，an in vivo experiment might be required to monitor the protein expression of TNF-α in specific immune organs or cells.

Key words:Grass carp reovirus； Tumor necrosis factor（TNF alpha）； Prokaryotic expression； Polyclonal antibody

中圖分類號(hào)：S941.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3207（2016）03-0481-07

doi:10.7541/2016.64

收稿日期：2015-06-11；

修訂日期：2015-12-04

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-46-12）； 國(guó)家自然科學(xué)基金（31372561）資助［Supported by the Earmarked Fund for China Agriculture Research System（No.CARS-46-12）； the National Natural Science Foundation of China（No.31372561）］

作者簡(jiǎn)介：盧翠玉（1991—），女，山西運(yùn)城人； 碩士； 主要從事水產(chǎn)動(dòng)物病原學(xué)研究。E-mail:JADE20100000@163.com

通信作者：呂利群，男，教授； 博士； 主要從事水產(chǎn)動(dòng)物病原學(xué)研究。E-mail:lqlv@shou.edu.cn