彭金霞呂麗虹韋嬪媛何蘋萍陳曉漢（.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，南寧 53002； 2.廣西水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，南寧 53002）

低溫誘導(dǎo)型凡納濱對(duì)蝦DEAD-box RNA解旋酶基因的克隆與表達(dá)分析

彭金霞1 *呂麗虹2 *韋嬪媛1何蘋萍1陳曉漢1
（1.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，南寧 530021； 2.廣西水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，南寧 530021）

摘要：為研究凡納濱對(duì)蝦耐寒性狀的分子基礎(chǔ)，克隆鑒定了凡納濱對(duì)蝦DEAD-box RNA解旋酶的同源基因。根據(jù)差減文庫(kù)中篩選到的一個(gè)低溫上調(diào)表達(dá)的DEAD-box RNA解旋酶基因片段，通過RACE PCR擴(kuò)增獲得兩條高度相似的cDNA全長(zhǎng)序列，兩條cDNA均為1430 bp，包含139 bp 5′UTR、79 bp 3′UTR和1212 bp 開放閱讀框，編碼403個(gè)氨基酸殘基。Blast比對(duì)結(jié)果顯示，兩條cDNA與其他物種的DDX5相似性最高，推測(cè)為凡納濱對(duì)蝦DDX5基因的兩個(gè)變異體，分別命名為L(zhǎng)vDDX5variant A（LvDDX5A）和LvDDX5variant B（LvDDX5B），在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，LvDDX5A和LvDDX5B聚為最近的一支，并與蝦類DDX5、文昌魚DDX、貝類的DDX5距離較近。Real-time PCR分析結(jié)果顯示，LvDDX5A和LvDDX5B都呈多組織遍在表達(dá)，在精巢、鰓、腸、肌肉和卵巢中，LvDDX5B表達(dá)量高于LvDDX5A，而在肝胰腺中LvDDX5A表達(dá)量高于LvDDX5B。在低溫脅迫對(duì)蝦肝胰腺和心中，LvDDX5A呈上調(diào)表達(dá)而LvDDX5B表達(dá)量無(wú)明顯變化。進(jìn)一步對(duì)LvDDX5A在不同低溫條件脅迫對(duì)蝦的肝胰腺中表達(dá)變化進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，LvDDX5A在18℃、15℃、13℃和11℃低溫脅迫36h均被誘導(dǎo)表達(dá)，并隨著15℃和13℃低溫脅迫時(shí)間的增加呈先上升后下降的表達(dá)模式，在48h達(dá)到峰值，LvDDX5A的低溫誘導(dǎo)表達(dá)模式暗示其可能是在凡納濱對(duì)蝦低溫適應(yīng)中發(fā)揮作用的剪接體。

關(guān)鍵詞：凡納濱對(duì)蝦； 低溫誘導(dǎo)； DEAD-box； RNA解旋酶； 耐寒

低溫誘導(dǎo)型DEAD-box RNA解旋酶（DEAD-box RNA helicase）基因是目前發(fā)現(xiàn)在古細(xì)菌、原核生物、植物等生物中廣泛存在的耐寒調(diào)控因子。在對(duì)15種嗜熱古細(xì)菌的比較中發(fā)現(xiàn)，9種具有低溫誘導(dǎo)型DEAD-box RNA解旋酶基因的菌種的生存溫度明顯低于6種不具低溫誘導(dǎo)型DEAD-box RNA解旋酶的菌種； DEAD-box RNA 解旋酶基因也能使嗜冷古細(xì)菌Methanococcoides burtonii的生存溫度從23℃降低到4℃，表明DEAD-box RNA解旋酶基因可提高古細(xì)菌耐受相對(duì)低溫的能力，從而降低其生存溫度的下限［1—4］。通過低溫誘導(dǎo)型DEAD-box RNA解旋酶基因的表達(dá)提高耐寒能力是也原核生物通用的機(jī)制，如大腸桿菌CsdA和 SrmB、枯草桿菌CshA和CshB、藍(lán)細(xì)菌的CrhC等均能通過低溫誘導(dǎo)表達(dá)提高機(jī)體耐寒能力［5—10］，且大腸桿菌CsdA的研究表明，DEAD-box RNA解旋酶基因通過調(diào)控RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和翻譯過程，使機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)低溫環(huán)境的適應(yīng)［11—15］。

在擬藍(lán)芥（Arabidopsis）LOS4基因的研究中則找到了低溫誘導(dǎo)型DEAD-box RNA解旋酶基因單核苷酸突變（第五外顯子G→A突變，對(duì)應(yīng)氨基酸突變?yōu)镚ly-364-Arg）與耐寒能力的關(guān)系。并發(fā)現(xiàn)LOS4基因通過誘導(dǎo)CBF等下游效應(yīng)基因的表達(dá)，提高機(jī)體耐寒能力，使22℃生長(zhǎng)的植株在4℃正常生長(zhǎng)［16—18］。另外2個(gè)低溫誘導(dǎo)型擬藍(lán)芥DEAD-box RNA解旋酶基因AtRH9和AtRH25，則可以挽救大腸桿菌冷休克蛋白的缺失突變，使其從低溫敏感型變?yōu)榈蜏啬褪苄停?9］，說明DEAD-box RNA解旋酶基因在提高耐寒能力方面的保守性。

Boudet等［20］從基因進(jìn)化角度分析了擬藍(lán)芥和果蠅、線蟲等動(dòng)物在DEAD-box RNA解旋酶基因結(jié)構(gòu)上的異同及基因進(jìn)化規(guī)律，但動(dòng)物中關(guān)于DEAD-box RNA解旋酶基因功能的研究主要涉及細(xì)胞增殖、癌癥的發(fā)生、生殖發(fā)育等，目前尚未見與耐寒相關(guān)的報(bào)道。

凡納濱對(duì)蝦是我國(guó)主導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，但凡納濱對(duì)蝦為暖水性物種，耐寒能力差是制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要原因之一。因此，解析耐寒性狀的分子調(diào)控機(jī)制，通過分子輔助耐寒新品種選育是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需求［21，22］。本研究對(duì)差減文庫(kù)中篩選到一個(gè)低溫上調(diào)表達(dá)的DEAD-box RNA解旋酶基因進(jìn)行了全長(zhǎng)序列克隆分析，并對(duì)其在低溫脅迫條件下的表達(dá)特征進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步開展功能研究和應(yīng)用于分子輔助耐寒品種選育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所使用凡納濱對(duì)蝦均為廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院下屬?gòu)V西SPF南美白對(duì)蝦遺傳育種中心培育的2—3月齡快速生長(zhǎng)期家系對(duì)蝦，規(guī)格8—12 g。將實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦運(yùn)至水族實(shí)驗(yàn)室后，在40 cm×160 cm 可控溫的玻璃容器中通氣養(yǎng)殖，水溫為28℃，鹽度為22‰。暫養(yǎng)7d后隨機(jī)分為均等的5組，一組保持常溫養(yǎng)殖，另外4組根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的目的溫度（18℃、15℃、13℃和11℃）和降溫速率（4h/1℃）進(jìn)行降溫。15℃和13℃組降至目的溫度后的12h、24h、36h、48h、60h和72h采集對(duì)蝦的肝胰腺組織，18℃和11℃組僅采集了處理36h對(duì)蝦肝胰腺。降溫處理組及同批次的常溫組各取樣點(diǎn)分別取3—5尾，采集的組織液氮速凍，隨后移入-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩３亟M另取對(duì)蝦的心、鰓、腸、肌肉、精巢、卵巢等組織用于組織表達(dá)譜分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

基因克隆 對(duì)低溫差減文庫(kù)測(cè)序獲得的表達(dá)序列（ESTs）用DNAStar軟件進(jìn)行拼接獲得Contig，然后進(jìn)行在線blast同源性比對(duì)分析。選擇低溫表達(dá)豐度高的DDX同源片段設(shè)計(jì)上下游引物WK5F/WK5R。根據(jù)定向插入pBluescript lI SK載體的SMART全長(zhǎng)文庫(kù)插入位點(diǎn)上下游序列設(shè)計(jì)M13+/M13-引物。以低溫脅迫仔蝦SMART全長(zhǎng)文庫(kù)［23］為模板，用M13+/WK5R和WK5F/M13-引物對(duì)分別進(jìn)行5′和3′RACE擴(kuò)增。擴(kuò)增片段經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收目的片段，克隆至PGEMTeasy載體，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞后，每個(gè)片段挑取10個(gè)克隆測(cè)序。

序列分析 測(cè)序結(jié)果去除載體和文庫(kù)接頭序列后，用DNAstar軟件中的Seqman程序進(jìn)行拼接，將拼接后所得序列使用EdiSeq程序進(jìn)行開放閱讀框（ORF）的搜索，使用NCBI網(wǎng)站（http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）的BLASTX軟件進(jìn)行同源比對(duì)并下載相關(guān)蛋白序列。

熒光定量PCR 用TRizol試劑盒（Invitrogen公司）進(jìn)行總RNA的抽提，然后取部分RNA溶液通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的A260/A280的值，判斷RNA的純度并計(jì)算其濃度，通過1%的瓊脂糖電泳分析RNA的完整性。以Random引物（隨機(jī)6核苷酸序列，Promega C1181），在M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，將cDNA產(chǎn)物稀釋10倍，以β-actin基因作內(nèi)參，采用含SYBR Green I Dye熒光染料的THUNDERBIRD qPCR Mix（TOYOBO）進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，儀器為ABI 7500-fast。反應(yīng)體系:1.0 μL cDNA，10 μL 2×THUNDERBIRD qPCR Mix，上下游引物各0.5 μL，補(bǔ)足水至總體積20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?95℃ 20s預(yù)變性； 95℃ 3s、60℃ 30s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)?；虻囊镄蛄幸姳?，DDX1F2/R2用于擴(kuò)增LvDDX5A，DDX2F/2R用于擴(kuò)增LvDDX5B，?；虻南鄬?duì)表達(dá)量按照2-ΔΔCt法對(duì)本試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析獲得［24］。

表 1 引物及序列Tab.1 Primer name and sequence

2 結(jié)果

2.1 LvDDX5基因的克隆與序列分析

通過凡納濱對(duì)蝦低溫差減文庫(kù)篩選，獲得1條851 bp的低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)型contig序列。Blast比對(duì)結(jié)果顯示，該序列與其他物種的DEAD-box RNAhelicase 基因家族的成員DDX5和DDX17同源性最高。根據(jù)已獲得的contig序列通過5′和3′-RACE擴(kuò)增，分別獲得一條300 bp左右的5′片段和一條1.2 kb 的3′片段?？寺y(cè)序結(jié)果顯示，5′片段為342 bp，3′片段為1252 bp，且3′ 1252 bp序列中存在兩種不同的變異體，兩個(gè)變異體間除了一個(gè)109 bp 片段差異，其他位置堿基完全一致。將5′序列與兩條3′序列分別拼接獲得兩條cDNA序列，Blast比對(duì)結(jié)果顯示，兩條cDNA與其他物種的DDX5和DDX17相似性都很高，但blastn和blastx比對(duì)結(jié)果中，相似性最高的都是DDX5同源基因，推測(cè)擴(kuò)增獲得的是凡納濱對(duì)蝦DDX5的兩個(gè)變異體，分別命名為L(zhǎng)vDDX5A（GenBank登錄號(hào):KT122790）和LvDDX5B（GenBank登錄號(hào):KT122791）。LvDDX5A和LvDDX5B cDNA全長(zhǎng)均為1430 bp，包含139 bp 5′UTR、79 bp 3′UTR和1212 bp開放閱讀框，編碼403個(gè)氨基酸殘基。

然后從GenBank下載不同分類地位物種的同源蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建。如圖 1所示，LvDDX5A和LvDDX5B聚為最近的一支，與LvDDX5遺傳距離較近的分別為蝦類DDX5、文昌魚DDX、貝類的DDX5。昆蟲的DDX5和DDX17分別聚為兩支，哺乳動(dòng)物、鳥類、兩棲類和魚類的DDX5和DDX17分別聚為另外兩支，LvDDX5A和LvDDX5B與哺乳動(dòng)物、鳥類、兩棲類和魚類的DDX5距離較近，卻與昆蟲類的DDX17較近。南美白對(duì)蝦另一個(gè)DEAD-box RNA helicase基因PL10作為外類群，獨(dú)立于DDX5 和DDX17單獨(dú)聚為一支。

2.2 LvDDX5基因的表達(dá)譜分析

圖 1 利用MEGA4.1 軟件構(gòu)建的基于DDX 氨基酸序列的NJ系統(tǒng)樹

根據(jù)差異序列分別設(shè)計(jì)特異于LvDDX5A和LvDDX5B的兩對(duì)引物，比較分析兩個(gè)變異體的表達(dá)模式。首先，將正常對(duì)蝦心中的表達(dá)量定義為1，分析組織表達(dá)譜，兩個(gè)變異體都呈多組織遍在表達(dá)，且在肌肉中表達(dá)量最高，在精巢、卵巢、腸和鰓中表達(dá)量較高，心中最低。比較兩個(gè)變異體的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，在精巢、鰓、腸、肌肉和卵巢中，LvDDX5B表達(dá)量高于LvDDX5A，而在肝胰腺中LvDDX5A表達(dá)量高于LvDDX5B（圖 2）。

圖 2 LvDDX5基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)分析

然后選擇在低溫脅迫應(yīng)答中比較重要的組織肝胰腺、心、鰓和肌肉進(jìn)行兩個(gè)變異體的低溫表達(dá)分析。結(jié)果如圖 3所示，LvDDX5A在肝胰腺和心中呈低溫上調(diào)表達(dá)，在肌肉和鰓中下調(diào)表達(dá)，而LvDDX5B在低溫脅迫對(duì)蝦肝胰腺和心中表達(dá)量無(wú)明顯變化，在肌肉和鰓中下調(diào)表達(dá)。

圖 3 LvDDX5基因在不同組織中的低溫表達(dá)分析

進(jìn)一步對(duì)LvDDX5A在不同低溫條件脅迫對(duì)蝦的肝胰腺中表達(dá)變化進(jìn)行了分析。首先，在不同強(qiáng)度的低溫脅迫下，LvDDX5A均被誘導(dǎo)表達(dá)，18℃、15℃、13℃和11℃低溫脅迫36h的表達(dá)量分別為常溫的2.3、1.5、2.1和1.9倍。然后分析了15℃和13℃低溫脅迫不同時(shí)間下的表達(dá)變化。在15℃和13℃低溫脅迫的各時(shí)間點(diǎn)LvDDX5A的表達(dá)量均高于常溫對(duì)照，兩組都隨著處理時(shí)間的增加呈先上升后下降的表達(dá)模式，且都在48h達(dá)到峰值（15℃組:常溫的3.1倍； 13℃組:常溫的5.2倍）（圖 4）。

圖 4 LvDDX5A在肝胰腺中的低溫表達(dá)分析

3 討論

3.1 LvDDX5基因序列特征分析

DEAD-box RNA解旋酶基因（DDX）是RNA解旋酶的一個(gè)亞家族，具有與ATP水解相關(guān)的Asp-Glu-Ala-Asp結(jié)構(gòu)域和保守的催化結(jié)構(gòu)域，而其他側(cè)翼序列在不同的DEAD-box RNA解旋酶家族成員之間差異很大，以適應(yīng)不同功能［25］。在細(xì)胞活動(dòng)中，RNA分子容易形成非功能性的二級(jí)結(jié)構(gòu)，往往需要在分子伴侶的協(xié)助下形成正確的二級(jí)結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮功能。在逆境脅迫條件下，細(xì)胞中的翻譯起始受阻，導(dǎo)致更多的錯(cuò)誤的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)形成，而這些二級(jí)結(jié)構(gòu)反過來進(jìn)一步抑制了翻譯活動(dòng)。DEAD-box RNA解旋酶是一類重要的分子伴侶，它們可借助ATP水解釋放的能量解開mRNA錯(cuò)誤二級(jí)結(jié)構(gòu)，引導(dǎo)正確結(jié)構(gòu)的形成，從而啟動(dòng)低溫下的正常翻譯活動(dòng)［10，14］。DEAD-box RNA解旋酶基因還可以通過激活轉(zhuǎn)錄因子和通過自身磷酸化在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平調(diào)控下游低溫效應(yīng)基因的表達(dá)［16，17，26］。

Blast比對(duì)結(jié)果表明，LvDDX5與DDX5、DDX17的相似性都很高，但與DDX5的相似性最高。DDX5 和DDX17在其核心催化結(jié)構(gòu)域具有92%相似性，在N端和C端可變區(qū)仍有72%和44%相似性，兩個(gè)基因均具有RNA解旋酶活性并參與基因剪接和轉(zhuǎn)錄調(diào)控［27］。在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，LvDDX5A和LvDDX5B與哺乳動(dòng)物、鳥類、兩棲類和魚類的DDX5距離較近，卻與昆蟲類的DDX17較近，因此，通過序列比對(duì)推測(cè)本研究克隆的是凡納濱對(duì)蝦DDX5直系同源基因，但從進(jìn)化分析結(jié)果難以確定LvDDX5 到底是DDX5還是DDX17，這可能是因?yàn)闊o(wú)脊椎動(dòng)物中DDX5/DDX17同源基因序列還不夠多，而兩個(gè)基因的相似性又很高，導(dǎo)致進(jìn)化分析聚類時(shí)出現(xiàn)偏差。

基因的選擇性剪接是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要部分，在生物的逆境適應(yīng)中被廣泛應(yīng)用，逆境下選擇性剪接使蛋白的定位、結(jié)合特性、活性及穩(wěn)定性發(fā)生改變，從而適應(yīng)新的環(huán)境［28］。在斑馬魚的低溫轉(zhuǎn)錄組研究中，作者發(fā)現(xiàn)197個(gè)功能基因在低溫脅迫時(shí)發(fā)生了選擇性剪接，主要涉及蛋白酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、剪接調(diào)控因子和抗病因子等［29］。DEAD-box RNA解旋酶是一類重要的低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，很可能通過選擇性剪接實(shí)現(xiàn)功能，在斑馬魚中，DDX5基因也在編碼區(qū)的3′端發(fā)生選擇性剪接，產(chǎn)生2條mRNA序列（NM_212612，NM_001309525），但兩個(gè)剪接體的具體功能分歧尚未見報(bào)道。通過LvDDX5基因兩個(gè)變異體的序列比較分析，推測(cè)109 bp外顯子的選擇與其耐寒功能相關(guān)，LvDDX5A在肝胰腺和心中呈低溫誘導(dǎo)表達(dá)，而LvDDX5B在低溫下表達(dá)無(wú)上調(diào)，因此LvDDX5A變異體可能在凡納濱對(duì)蝦的耐寒中發(fā)揮作用。

3.2 LvDDX5基因的表達(dá)特征分析

各物種的研究結(jié)果均顯示，低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)是RNA解旋酶基因發(fā)揮功能提高機(jī)體耐寒能力的基礎(chǔ)［2，15］。為了解LvDDX5A基因在對(duì)蝦低溫適應(yīng)中的可能作用，本研究通過熒光定量PCR對(duì)其低溫表達(dá)譜進(jìn)行了詳細(xì)的分析。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦的低溫行為反應(yīng)，本研究設(shè)置了一系列低溫脅迫條件和取樣點(diǎn)，如18℃雖然已經(jīng)低于對(duì)蝦適宜生存溫度，但并不影響其活動(dòng)，攝食也基本正常，推測(cè)不會(huì)引起基因表達(dá)的變化，因而只設(shè)置一個(gè)取樣點(diǎn)； 在15℃低溫時(shí)，對(duì)蝦攝食明顯減少且活動(dòng)減弱，在13℃低溫脅迫后，對(duì)蝦聚集于缸底活動(dòng)很少，少數(shù)個(gè)體身體失去平衡呈側(cè)躺狀態(tài)，15℃和13℃低溫對(duì)對(duì)蝦造成了較明顯的行為影響，但在其可忍受的范圍內(nèi)，推測(cè)此時(shí)基因的表達(dá)調(diào)控起到重要作用，因此設(shè)置了不同脅迫時(shí)間的取樣點(diǎn)進(jìn)行基因表達(dá)量分析； 而當(dāng)溫度降到11℃時(shí)，對(duì)蝦全部側(cè)躺，活動(dòng)微弱，部分個(gè)體在脅迫36h死亡，低溫對(duì)大部分蝦體造成不可逆損傷，推測(cè)此時(shí)對(duì)蝦應(yīng)難以通過調(diào)整自身的基因表達(dá)應(yīng)對(duì)低溫。但LvDDX5A基因的低溫表達(dá)譜結(jié)果與我們的推測(cè)不盡相同，LvDDX5A基因在較低強(qiáng)度低溫（18℃）脅迫時(shí)即上調(diào)表達(dá)，并在11℃極度低溫時(shí)仍維持與13℃基本相當(dāng)?shù)母弑磉_(dá)水平。

在甲殼動(dòng)物中，肝胰腺是反應(yīng)機(jī)體健康、營(yíng)養(yǎng)、疾病、重金屬積累等狀況的重要器官［30］，而且LvDDX5基因也呈現(xiàn)肝胰腺低溫誘導(dǎo)表達(dá)現(xiàn)象，因此本研究著眼于肝胰腺中基因表達(dá)的量的變化，而肌肉和鰓中的下調(diào)表達(dá)可能與基因的多功能性相關(guān)。LvDDX5A和LvDDX5B呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式可能與兩個(gè)剪接體功能的分歧有關(guān)，如在高山離子芥中發(fā)現(xiàn)，DEAD-box RNA解旋酶基因CbGRP通過選擇性剪接產(chǎn)生mRNA CbDRH.2 和CbDRH.1，其中CbDRH.2可與已知的低溫效應(yīng)蛋白結(jié)合參與提高耐寒性狀，而CbDRH.1則參與無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解［31］。15℃和13℃低溫處理不同時(shí)間的表達(dá)譜分析表明，LvDDX5A mRNA都是呈先上升后下降，并在低溫下一直維持高表達(dá)水平，與已報(bào)道的低溫應(yīng)答基因AtRH9、RCF1、CBF2、RD29A等的表達(dá)模式相一致［18，19，32］。LvDDX5A的表達(dá)模式也與實(shí)驗(yàn)中觀察到的對(duì)蝦狀態(tài)一致，在15℃和13℃低溫處理組，開始低溫脅迫時(shí)對(duì)蝦活動(dòng)很少且側(cè)躺的個(gè)體較多，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，13℃組對(duì)蝦基本都能逐漸恢復(fù)直立狀態(tài)，而15℃組對(duì)蝦能恢復(fù)到正常游泳狀態(tài)?？赡芤?yàn)榈蜏孛{迫早期，細(xì)胞需要大量合成LvDDX5A mRNA并不斷翻譯成蛋白，糾正低溫引起的RNA錯(cuò)誤折疊，而隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中翻譯等活動(dòng)新的穩(wěn)態(tài)逐漸建立，LvDDX5A mRNA表達(dá)量逐漸降低并維持在較高水平以維護(hù)細(xì)胞低溫條件下的正常翻譯活動(dòng)。

參 考 文 獻(xiàn)：

［1］Shimada Y，F(xiàn)ukuda W，Akada Y，et al.Property of cold inducible DEAD-box RNA helicase in hyperthermophilic archaea［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2009，389（4）:622—627

［2］Lim J，Thomas T，Cavicchioli R.Low temperature regulated DEAD-box RNA helicase from the Antarctic archaeon，Methanococcoides burtonii［J］.Journal of Molecular Biology，2000，297（3）:553—567

［3］Fukui T，Atomi H，Kanai T，et al.Complete genome sequence of the hyperthermophilic archaeon The rmococcus kodakaraensis KOD1 and comparison with Pyrococcus genomes［J］.Genome Research，2005，15（3）:352—363

［4］Boonyaratanakornkit B B，Simpson A J，Whitehead T A，et al.Transcriptional profiling of the hyperthermophilic methanarchaeon Methanococcus jannaschii in response to lethal heat and non-lethal cold shock［J］.Environmental Microbiology，2005，7（6）:789—797

［5］Cartier G，Lorieux F，Allemand F，et al.Cold adaptation in DEAD-box proteins［J］.Biochemistry，2010，49（12）:2636—2646

［6］Hunger K，Beckering C L，Wiegeshoff F，et al.Cold-induced putative DEAD box RNA helicases CshA and CshB are essential for cold adaptation and interact with cold shock protein B in Bacillus subtilis［J］.Journal of Bacteriology，2006，188（1）:240—248

［7］Owttrim G W.RNA helicases and abiotic stress［J］.Nucleic Acids Research，2006，34（11）:3220—3230

［8］Yu E，Owttrim G W.Characterization of the cold stressinduced cyanobacterial DEAD-box protein CrhC as an RNA helicase［J］.Nucleic Acids Research，2000，28（20）:3926—3934

［9］Broussolle V，Pandiani F，Haddad N，et al.Insertional mutagenesis reveals genes involved in Bacillus cereus ATCC 14579 growth at low temperature［J］.FEMS Microbiology Letters，306（2）:177—183

［10］Chamot D，Owttrim G W.Regulation of cold shock-induced RNA helicase gene expression in the Cyanobacterium anabaena sp.strain PCC 7120［J］.Journal of Bacteriology，2000，182（5）:1251—1256

［11］Jones P G，Mitta M，Kim Y，et al.Cold shock induces a major ribosomal-associated protein that unwinds doublestranded RNA in Escherichia coli［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996，93（1）:76—80

［12］Charollais J，Pflieger D，Vinh J，et al.The DEAD-box RNA helicase SrmB is involved in the assembly of 50S ribosomal subunits in Escherichia coli［J］.Molecular Microbiology，2003，48（5）:1253—1265

［13］Prud'homme-Genereux A，Beran R K，Iost I，et al.Physical and functional interactions among RNase E，polynucleotide phosphorylase and the cold-shock protein，CsdA:evidence for a cold shock degradosome［J］.Molecular Microbiology，2004，54（5）:1409—1421

［14］Chamot D，Colvin K R，Kujat-Choy S L，et al.RNA structural rearrangement via unwinding and annealing by the cyanobacterial RNA helicase，CrhR［J］.The Journal of Biological Chemistry，2005，280（3）:2036—2044

［15］Charollais J，Dreyfus M，Iost I.CsdA，a cold-shock RNA helicase from Escherichia coli，is involved in the biogenesis of 50S ribosomal subunit［J］.Nucleic Acids Research，2004，32（9）:2751—2759

［16］Vashisht A A，Tuteja N.Stress responsive DEAD-box helicases:a new pathway to engineer plant stress tolerance［J］.Journal of Photochemisty and Photobiology B，2006，84（2）:150—160

［17］Gong Z，Lee H，Xiong L，et al.RNA helicase-like protein as an early regulator of transcription factors for plant chilling and freezing tolerance［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2002，99（17）:11507—11512

［18］Gong Z，Dong C H，Lee H，et al.A DEAD box RNA helicase is essential for mRNA export and important for development and stress responses in Arabidopsis［J］.Plant Cell，2005，17（1）:256—267

［19］Kim J S，Kim K A，Oh T R，et al.Functional characterization of DEAD-box RNA helicases in Arabidopsis thaliana under abiotic stress conditions［J］.Plant Cell Physiology，2008，49（10）:1563—1571

［20］Boudet N，Aubourg S，Toffano-Nioche C，et al.Evolution of intron/exon structure of DEAD helicase family genes in Arabidopsis，Caenorhabditis，and Drosophila［J］.Genome Research，2001，11（12）:2101—2114

［21］Peng J X，F(xiàn)ang Z F，Wei P Y，et al.Sequence and expression analysis of metallothionein from Litopenaeus vannamei［J］.Acta Hydrobiologica Sinica，2013，37（4）:24—28［彭金霞，房振峰，韋嬪媛，等.凡納濱對(duì)蝦MT基因序列及其在卵巢發(fā)育和低溫脅迫中的表達(dá)分析.水生生物學(xué)報(bào)，2013，37（4）:24—28］

［22］Yin Q，Cui L，Peng J X，et al.Molecular cloning of LVANT2 gene and its expression pattern by cold induction［J］.Acta Hydrobiologica Sinica，2012，36（1）:678—683［殷勤，崔亮，彭金霞，等.凡納濱對(duì)蝦ANT2基因的克隆及低溫表達(dá)譜分析.水生生物學(xué)報(bào)，2012，36（1）:678—683］

［23］Peng J，F(xiàn)ang Z，Wei B，et al.Analysis of A cDNA library and 3 copies of troponin i genes in juvenile pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei exposed to low temperature［J］.Fisheries Science，2013，32（2）:73—79

［24］Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））method［J］.Methods，2001，25（4）:402—408

［25］Fukuda T，Yamagata K，F(xiàn)ujiyama S，et al.DEAD-boxRNA helicase subunits of the Drosha complex are required for processing of rRNA and a subset of microRNAs［J］.Nature Cell Biology，2007，9（5）:604—611

［26］Intile P J，Balzer G J，Wolfgang M C，et al.The RNA helicase DeaD stimulates ExsA translation to promote expression of the Pseudomonas aeruginosa type III secretion system［J］.Journal of Bacteriology，2015，197（16）:2664—2674

［27］Fuller-Pace F V.DExD/H box RNA helicases:multifunctional proteins with important roles in transcriptional regulation［J］.Nucleic Acids Research，2006，34（15）:4206—4215

［28］Mastrangelo A M，Marone D，Laido G，et al.Alternative splicing:enhancing ability to cope with stress via transcriptome plasticity［J］.Plant Science，2012，185—186:40—49

［29］Long Y，Song G l，Yan J J，et al.Transcriptomic characterization of cold acclimation in larval zebrafish［J］.BMC Genomics，2013，14:612

［30］Guo T F，Huang X X，Su M，et al.Effect of dietary copper level on the immunity，vibrio-resistant ability，lysozyme mRNA and toll receptor mRNA expressions in the white shrimp Litopenaeus vannamei［J］.Acta Hydrobiologica Sinica，2012，36（5）:809—816［郭騰飛，黃旭雄，蘇明，等.飼料中銅水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫相關(guān)基因表達(dá)和抗菌能力的影響.水生生物學(xué)報(bào)，2012，36（5）:809—816］

［31］Yang Y，Sun Z L，Ding C C，et al.A DEAD-box RNA helicase produces two forms of transcript that differentially respond to cold stress in a cryophyte（Chorispora bungeana）［J］.Planta，2014，240（2）:369—380

［32］Guan Q M，Wu J M，Zhang Y Y，et al.A DEAD Box RNA helicase is critical for pre-mRNA splicing，cold-responsive gene regulation，and cold tolerance in arabidopsis［J］.Plant Cell，2013，25（1）:342—356

CLONING，CHARACTERIZATION AND EXPRESSION ANALYSIS OF A COLDINDUCIBLE DEAD-BOX RNA HELICASE GENE IN LITOPENAEUS VANNAMEI

PENG Jing-Xia1，Lü Li-Hong2，WEI Pin-Yuan1，HE Ping-Ping1and CHEN Xiao-Han1
（1.Guangxi Academy of Fisheries Science，Nanning 530021，China； 2.Guangxi Fisheries Extension Center，Nanning 530021，China）

Abstract:Cold-inducible DEAD-box RNA helicases are conservative regulator of cold tolerance in archaea，prokaryote and eukaryote.We have got a cold-inducible DEAD-box RNA helicase EST from cold tolerant shrimps.In this study，two cDNA sequence of the DEAD-box RNA helicase gene were obtained by RACR PCR.The two cDNAs were 1430 bp in length including a 139 bp 5′UTR，a 79 bp 3′UTR and a 1212 bp open reading frame，encoding a peptide of 403 aa.Blast analysis showed that the two cDNAs had top hit of DDX homologous，thus named LvDDX5 variant A（LvDDX5A）and LvDDX5 variant B（LvDDX5B）.Phylogenetic analysis revealed that LvDDX was related closely to shrimp DDX5，Branchiostoma floridae DDX and Aplysia californica DDX5.LvDDX5A and LvDDX5B were widely expressed，and LvDDX5B was higher in testis，gill，intestine，muscle and ovary，whereas LvDDX5A was higher in hepatopancreas.LvDDX5A but not LvDDX5B was up-regulated in hepatopancreas and heart by cold induction.LvDDX5A can be induced by various low temperatures including 18，15，13 and 11℃.With different time treatment at 15 and 13℃，LvDDX5A increased firstly，reached to the peak at 48h，and decreased afterward.These results suggest that LvDDX5A may play an important role in cold tolerance of Litopenaeus vannamei.

Key words:Litopenaeus vannamei； Cold-inducible； DEAD-box； RNA helicases； Cold tolerant

中圖分類號(hào)：Q344+.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3207（2016）03-0474-07

doi:10.7541/2016.63

收稿日期：2015-06-24；

修訂日期：2015-12-12

基金項(xiàng)目：廣西壯族自治區(qū)直屬公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（編號(hào):GXIF-2014-002），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào):31460690）； 八桂學(xué)者建設(shè)專項(xiàng)資金（編號(hào):BGXZ-NMBDX-05）； 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào):CARS-47）資助［Supported by the Fundamental Research Funds for Nonprofit Research Institutes under Guangxi Zhuang Autonomous Region（Grant No.GXIF-2014-002）； the National Natural Science Foundation of China（Grant No.31460690），the Special Funds for Ba Gui Scholars Project Construction（Grant No.BGXZ-NMBDX-05）； the China Agriculture Research System（Grant No.CARS-47）］

作者簡(jiǎn)介：彭金霞（1981—），女，安徽潛山縣人； 遺傳學(xué)博士； 主要從事水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種與分子輔助育種研究。E-mail:pengjinxia@gmail.com； 呂麗虹（1970—），女，廣西北流人； 主要從事水產(chǎn)技術(shù)推廣工作。E-mail:Lvlihong5829857@163.com.*共同第一作者

通信作者：陳曉漢，E-mail:chnxhn@163.com