王榮華李 偉肖調義，2劉巧林，2金生振周智愚（.湖南省特色水產資源利用工程技術中心，湖南農業(yè)大學，長沙 4028； 2.水產高效健康生產湖南省協(xié)調同創(chuàng)新中心，常德 45000）

赤眼鱒MyD88基因cDNA克隆與表達特性研究

王榮華1李 偉1肖調義1，2劉巧林1，2金生振1周智愚1
（1.湖南省特色水產資源利用工程技術中心，湖南農業(yè)大學，長沙 410128； 2.水產高效健康生產湖南省協(xié)調同創(chuàng)新中心，常德 415000）

摘要：實驗使用RACE-PCR技術獲得了赤眼鱒（Squaliobarbus curriculus）髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）的cDNA全長，命名為ScMyD88。ScMyD88的cDNA全長為1779 bp，其中開放閱讀框855 bp，共編碼284個氨基酸殘基，推導的蛋白質分子量為33.053 kD，理論等電點為5.66。赤眼鱒MyD88具有典型的MyD88結構特征，包括死亡結構域和TIR結構域（Toll-IL-1 receptor domain，TIR），其氨基酸序列和鯉科魚類具有高度保守性，相似性達到了90%以上，特別是和武昌魚相比，相似性達到了98%。在檢測的9個赤眼鱒組織和器官中均有MyD88表達，其中肝臟、頭腎和體腎中表達水平最高，在腦中表達量最低。在草魚呼腸弧病毒（Grass carp reovirus，GCRV）感染初期（12h內），MyD88在赤眼鱒免疫組織中表達水平急劇上升，特別是在脾臟和體腎中尤為明顯，隨后恢復正常水平。研究表明，MyD88在赤眼鱒抵抗GCRV入侵的免疫應答反應初期發(fā)揮了重要作用。

關鍵詞：赤眼鱒； 髓樣分化因子88（MyD88）； 基因克隆； 組織表達

Toll樣受體（Toll Like Receptors，TLRs）家族是脊椎動物先天性免疫系統(tǒng)中一類重要的病原微生物模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs），能特異性識別病原微生物及其產物共有的一類或一群非特異性、高度保守的分子結構，這種結構稱為病原相關分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMP）［1］。TLRs家族識別PAMP后，TLRs通過MyD88（Myeloid differentiation factor 88）依賴信號轉導通路和非MyD88依賴信號轉導通路激活機體免疫系統(tǒng)［2］。除TLR3和TLR22外，TLRs均可介導MyD88依賴信號轉導通路［3，4］，TLRs胞內的TIR結構域（Toll-IL-1 receptor domain，TIR）通過招募My D88激活白介素相關受體激酶家族（Interleukin-1 receptor-associated kinases，IRAKs）如IRAK1、IRAK4，活化的IRAKs和腫瘤壞死因子受體相關受體6（Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）相互作用引發(fā)信號傳導的級聯(lián)反應［5—7］，進一步激活核因子（Nuclear factor-kap B，NF-κB）和促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs），誘發(fā)炎癥反應［8，9］。

1990年，MyD88首次在小鼠髓樣細胞中克隆得到［10］，但是直到1997年，其功能特別是涉及TIR結構域的信號傳導功能才發(fā)現(xiàn)［11］。目前MyD88已經在人（Homo sapiens）［12］、小鼠（Rattus norvegicus）［13］、大黃魚（Pseudosciaena crocea）［14］、中華鱉（Trionyx sinensis）［15］、鯉（Cyprinus carpio）［16］、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［17］、三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）［18］等中克隆及鑒定。MyD88由N端死亡結構域（Death domain，DD）和C端TIR結構域兩部分組成，TIR結構域在TLRs和MyD88相互作用中發(fā)揮重要作用［19］，而DD結構域主要功能是募集具有DD結構域IRAKs家族如IRAK1，IRAK2，IRAK4等［20—22］，在死亡信號轉導，誘導細胞凋亡和炎癥反應等方面具有重要的作用［23］。

赤眼鱒（Squaliobarbus curriculus），俗稱野草魚，屬于鯉形目，鯉科，雅羅魚亞科，赤眼鱒屬［24］。赤眼鱒具有抗病性強的特點，迄今為止，尚未見赤眼鱒暴發(fā)性疾病的報道。近年來的研究結果顯示，赤眼鱒具有比草魚更好的抵抗草魚呼腸弧病毒（Grass carp reovirus，GCRV）入侵的特性［25—27］，但是關于先天性免疫基因在赤眼鱒抵抗GCRV入侵中的作用研究相對較少，彭慧珍等［28］獲得了赤眼鱒Mx基因cDNA全長，并發(fā)現(xiàn)其參與了赤眼鱒抗 GCRV-104病毒的免疫反應。MyD88作為連接TLRs家族和免疫系統(tǒng)的橋梁，克隆MyD88基因并探討其結構特性和表達特性，對解析TLRs家族在機體先天性免疫反應中的作用至關重要。因此，本文克隆了赤眼鱒MyD88（ScMyD88）基因的cDNA 全長，并對其的結構特性和GCRV感染后赤眼鱒免疫組織（肝、脾、頭腎、體腎）中MyD88的表達特性進行研究，以期為深入了解赤眼鱒 MyD88 的基因結構、功能以及其在TLRs信號傳導通路的作用機制奠定分子基礎，同時也可為草魚抗病毒新品種的選育提供部分基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

赤眼鱒（13.5±2.2）cm由湖南省瀏陽市烏龍漁場提供，實驗前于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)1個月，水溫控制在（28±1）℃，每天按實驗魚體重的2%投喂。GCRV-106 由中國水產科學研究院長江水產研究所魚類病害研究室惠贈。

1.2 方法

總RNA提取及cDNA合成 取50—80 mg的赤眼鱒脾臟組織，采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction（TaKaRa，China）提取總RNA，使用核酸蛋白儀檢測總RNA的質量和濃度，使用1%的瓊脂糖電泳檢測RNA完整性，完整性好且A260/A280值為1.8—2.0的總RNA用于下一步實驗。

取2 μg總RNA，采用RevertAid? First Strand cDNA Synthesis（Fermentas，USA）逆轉錄試劑盒，利用oligo（dT）18引物合成cDNA第一鏈，用于中間序列克隆和熒光定量分析。

ScMyD88基因cDNA全長克隆 中間序列的獲得:參考GenBank中已有的物種特別是鯉科魚類的MyD88序列，使用primer6.0和oligo7.0設計引物。使用引物MyD88F和MyD88R以ScMyD88基因cDNA為模板擴增ScMyD88中間序列，1.2%的瓊脂糖電泳檢測，切膠回收，克隆至pMD19-T載體（TaKaRa，China），送上海生工生物有限公司測序。

3′末端序列獲得:根據(jù)已獲得的ScMyD88中間序列，設計MyD3′PF和MyD3′NPF上游巢式PCR反應引物，其中MyD3′PF位于MyD3′NPF的上游。cDNA合成使用3′RACE Olig（T）-Adaptor引物，第一次PCR反應使用MyD3′PF和3′RACE Adaptor為引物，擴增條件:94℃預變性3min； 94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 60s，共20個循環(huán)； 72℃延伸10min。產物稀釋50倍后，用MyD3′NPF和3′RACE Adaptor做巢式PCR，反應條件同上。PCR產物切膠回收后，克隆至pMD19-T載體，送上海生工生物有限公司測序。

5′末端序列獲得:根據(jù)已獲得的ScMyD88中間序列，設計MyD5′PF和MyD5′NPF下游巢式PCR反應引物，其中MyD5′PF位于MyD5′NPF的下游。cDNA合成使用MyD5′PF特異性引物，將獲得的cDNA用DNA純化試劑盒（TaKaRa，China）純化，使用末端脫氧核酸轉移酶（TaKaRa，China）對純化的cDNA末端加A。巢式PCR方法步驟同3′末端序列克隆。PCR產物切膠回收后，克隆至pMD19-T載體，送上海生工生物有限公司測序。

ScMyD88序列生物信息學分析 ScMyD88基因cDNA序列拼接使用DNAStar軟件模塊SeqMan 5.01； 序列的相似性使用BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）分析； cDNA序列和氨基酸序列編輯使用DNAMAN7.0； 氨基酸序列分析使用蛋白質分析系統(tǒng)Expasy（http://www.expasy.org/），結構域預測使用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de）；I-TASSER（http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu）和PYMOL 軟件對3D結構進行分析； 多序列比對使用Clustal X2.1； 使用MEGA6.0鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行1000 次自展檢驗（bootstrap）評估進化樹分支可信度。

ScMyD88的組織表達特性分析 隨機選擇3尾健康赤眼鱒，分別提取肝、脾、腎、頭腎、腦、心、肌肉、腸、鰓等組織總RNA，使用oligo（dT）18引物合成第一鏈cDNA后，選用β-actin基因最為內參基因，用特異性熒光定量引物MyD88-RTF和MyD88-RTR擴增MyD88的片段，β-actin基因的擴增引物為Actin-RTF和Actin-RTR。擴增產物使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

GCRV感染后MyD88在赤眼鱒免疫組織表達水平研究 取180尾健康赤眼鱒，隨機分為6組，設實驗組和對照組，每組3個重復，每個重復30尾魚，實驗組每尾魚腹腔注射200 μL GCRV病毒懸液，對照組注射等量無菌PBS，分別在0、6h、12h、24h、48h、72h、96h和120h提取3尾赤眼鱒肝，脾、腎和頭腎組織的總RNA，按Fermentas逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA后，以β-actin作為內參基因，使用SYBR Green I染液在CFX96熒光定量PCR儀（Bio-Rad，USA）進行定量分析。反應體系為:10 μL SYBR Green PCR master mix（CWBIO，China），上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，9 μL稀釋后的cDNA模板，反應程序為95℃ 10min； 95℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 15s，35個循環(huán)； 溶解曲線程序為從65℃升溫至95℃，每5s增加0.5℃。數(shù)據(jù)收集和分析均使用CFX manager software 3.1（Bio-Rad，USA），作圖使用GraphPad Prism 6。

表 1 本文所用的引物序列Tab.1 The primers used in this study

2 結果

2.1 赤眼鱒MyD88序列分析

ScMyD88基因cDNA全長為1779 bp（GenBank登錄號為KR604719），包括5′ 端非編碼區(qū)域（Untranslated region，UTR）302 bp，ORF編碼區(qū)域855 bp和3′端非編碼區(qū)域622 bp，編碼284個氨基酸；其中3′UTR無終止信號，有不穩(wěn)定ATTTA結構和保守的PloyA序列。ORF編碼區(qū)域共編碼284個氨基酸，推導的蛋白質分子量為33.053 kD，理論等電點為5.66。SMART結構域預測結果顯示，ScMyD88具有典型的MyD88結構特征，包含DD結構域（DD，11-101aa）和TIR結構域（TIR，148—284aa）（圖 1A）。KinasePhos磷酸化位點預測軟件顯示ScMyD88包含3個蘇氨酸，2個酪氨酸磷酸化位點。使用 ExPASy在線分析中的 SOPMA 功能對赤眼鱒MyD88氨基酸序列的二級結構進行分析，其中α 螺旋占全結構的42.96%，延伸序列占19.72%，β折疊占9.15%，不規(guī)則卷曲占28.17%。使用I-TASSER 構建的赤眼鱒MyD88蛋白3D結構如圖 2B，ScMyD88共有11個α螺旋（α-helix）和3個β折疊（β-sheet），而3個β-折疊全部分布在TIR結構域中（圖 1B）。

圖 1 ScMyD88基因的結構特征

2.2 多序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

多序列比對結果顯示，赤眼鱒 MyD88 氨基酸序列和武昌魚MyD88一致性最高，達到了98%，和其他鯉科魚類（鯉、黑鯽、斑馬魚）的一致性也達到了90%以上，和哺乳動物豚鼠、大猩猩、獼猴、人等同源性相對較低，一致性在59.5%—60.4%（表2）。硬骨魚類MyD88基因TIR結構域的多序列比對結果（圖 2）顯示，硬骨魚類MyD88基因TIR結構域氨基酸序列高度保守，同時赤眼鱒MyD88的TIR結構域包含3個高度保守的區(qū)域:Box 1（FDAFICY）； Box 2（LCVFDRDVLPG）； Box 3（FWTRL）。MyD88基因的TIR結構域氨基酸序列結果發(fā)現(xiàn)，參與比對的魚類MyD88基因TIR結構域的保守區(qū)域Box 1和2氨基酸序列完全一致，box 3氨基酸序列和鯉科魚類完全一致，而和斑點叉尾鲖、虹鱒、條石鯛存在一個位點的突變。系統(tǒng)發(fā)育樹結果（圖 3）顯示，整個系統(tǒng)發(fā)育樹分為兩支:硬骨魚類分支和哺乳動物分支。在硬骨魚類中，淡水性魚類和海洋魚類分隔明顯； 赤眼鱒MyD88和武昌魚聚為一簇，鯉和黑鯽MyD88聚為一簇，整個鯉科魚類聚為一個亞支。

2.3 MyD88在赤眼鱒不同組織的表達

MyD88在赤眼鱒檢測的9個組織和器官中均有表達（圖 4），其中頭腎、肝臟、體腎中表達水平最高，鰓、脾臟、心臟中表達量次之，肌肉和腸中的表達水平較低，腦中表達量最低。

2.4 GCRV感染后MyD88在赤眼鱒免疫組織的表達水平變化

赤眼鱒人工感染GCRV初期（0—12h），其免疫組織中MyD88的表達量均表現(xiàn)出明顯的上調，特別是在脾臟和體腎中，MyD88的表達水平急劇增高（圖 5A，B，D），而在6h，頭腎中MyD88出現(xiàn)表達下調的情況（圖 5C）； 48h赤眼鱒免疫組織中MyD88的表達量基本恢復正常水平，在120h，4個組織中MyD88的表達水平均有上調的趨勢（圖 5）。

表 2 赤眼鱒MyD88氨基酸序列和其他物種的相似性比較Tab.2 Percentage identities in amino acid sequence of ScMyD88 with other species

3 討論

TLRs家族是目前研究最多的PRRs，其接頭蛋白MyD88也得到了廣泛的關注。目前，MyD88已在哺乳動物、兩棲動物、魚類等多數(shù)動物中得到克隆，且有研究發(fā)現(xiàn)，除TLR3和TLR22外，其他TLRs蛋白均可通過MyD88依賴信號轉導通路向下游傳遞信號［9］。

本實驗克隆了赤眼鱒MyD88的cDNA全長，GenBank的登錄號為KR604719，編碼284個氨基酸。在鯉科魚類中，MyD88氨基酸序列具有高度的保守性，赤眼鱒MyD88氨基酸序列和武昌魚的相似性最高，達到了98%，和其他鯉科魚類（斑馬魚、鯉、黑鯽等）相似性也達到了90%以上。赤眼鱒MyD88具有典型的MyD88結構特性，包含DD結構域和TIR結構域。TIR結構域的多序列比對，發(fā)現(xiàn)ScMyD88基因TIR結構域包含3個保守區(qū)域box 1、2和3，且box 1和2的氨基酸序列在魚類中完全一致，box 3氨基酸序列和鯉科魚類完全一致，而和斑點叉尾鲖、虹鱒、條石鯛存在一個位點的突變。位點突變研究表明，box 1與2在MyD88和具有TIR結構域的蛋白相互作用中發(fā)揮重要作用，而box 3則通過與細胞骨架相互作用，參與受體的定位［29，30］。因此，推斷魚類MyD88在免疫調節(jié)方面的功能具有一定的相似性，同時也有一定的差異性。

圖 2 赤眼鱒MyD88基因TIR結構域和其他魚類MyD88基因氨基酸序列比對

圖 3 赤眼鱒MyD88氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹（ScMyD88加粗顯示）

對魚類MyD88研究結果顯示，MyD88在機體的各個組織中均有表達，但是不同物種，不同的組織其表達量存在差異［16，31，32］。Yao等［14］發(fā)現(xiàn)大黃魚MyD88在脾中表達最高； 歐洲鰻鱺MyD88在肝臟中表達量最高［33］； 鯉MyD88在鰓中表達水平最高［16］。在本研究中，MyD88在赤眼鱒各個檢測的9個組織中均有表達，且其在赤眼鱒頭腎、肝臟、體腎中表達水平最高，鰓、脾臟、心臟次之，肌肉和腸中的表達水平較低。

圖 4 赤眼鱒MyD88 的組織表達特性

圖 5 GCRV感染后MyD88在赤眼鱒肝、脾、頭腎和體腎中表達水平變化

MyD88在抗病原微生物先天性免疫反應中發(fā)揮重大作用，在抗細菌的先天性免疫方面，斜帶石斑魚［34］、歐洲鰻鱺［33］、大西洋鮭［35］等中均發(fā)現(xiàn)細菌病原相關分子模式（PNG、LPS）刺激后，其MyD88的表達水平要顯著升高； 病毒對MyD88表達的影響研究目前相對比較少，研究重點集中于病毒核酸類似物ploy（I:C）刺激后MyD88的表達水平變化。ploy（I:C）刺激后，除4h和12h外，凡納濱對蝦血細胞中MyD88表達水平低于對照組，而對蝦白斑病毒（雙鏈D N A病毒）能顯著提高凡納濱對蝦MyD88的表達量［36］； SAV3（單鏈RNA病毒）人工感染大 西洋鮭后，其脾臟組織中MyD88表達量在28d內都保持在較高水平［35］。在本實驗中，GCRV人工感染后，赤眼鱒免疫組織中MyD88表達量在感染初期（12h內）顯著上調，而到48h后，恢復正常水平，與凡納濱對蝦和大西洋鮭應對病毒刺激后的反應不一致。這可能和刺激機體病毒的核酸類型不同相關，同時不同的TLRs家族成員其識別配體不同，且TLRs可通過MyD88依賴信號轉導通路和非MyD88依賴信號轉導通路激活機體免疫系統(tǒng)。在病毒感染初期（12h內），TLR2和TLR4識別病毒蛋白后［19］，通過MyD88依賴信號轉導通路級聯(lián)信號擴大向下游傳遞信號，故MyD88在12h內赤眼鱒免疫組織中MyD88表達量顯著升高； 而病毒入侵細胞后，只有核酸進入細胞，TLR7/8，9分別能識別單鏈RNA和DNA，通過MyD88依賴信號轉導通路向下游傳遞信號［19］，因此，凡納濱對蝦和大西洋鮭MyD88在人工感染病毒后表達水平顯著升高，且保持較長時間； 然而，GCRV是雙鏈RNA病毒，由TLR3和TLR22發(fā)揮識別作用，通過非MyD88依賴信號轉導通路向下游傳遞信號［4］。因此，赤眼鱒免疫組織中MyD88的表達量回歸正常水平； 實際情況是否如此還需通過后續(xù)實驗進行驗證。

本實驗克隆了赤眼鱒MyD88基因的cDNA全長，且對其結構和表達特性進行了研究。赤眼鱒MyD88具有DD結構域和TIR結構域，其在赤眼鱒肝、頭腎和體腎中表達量最高； 且GCRV感染前期（12h），MyD88在赤眼鱒肝、脾、體腎和頭腎中的表達水平顯著升高，提示MyD88在赤眼鱒抵抗GCRV入侵前期發(fā)揮了重要作用。

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MOLECULAR CLONING，CHARACTERIZATION AND EXPRESSION OF MyD88 IN SQUALIOBARBUS CURRICULUS

WANG Rong-Hua1，LI Wei1，XIAO Tiao-Yi1，2，LIU Qiao-Lin1，2，JIN Sheng-Zhen1and ZHOU Zhi-Yu1
（1.Hunan Engineering，Technology Research Center of Featured Agnatic Resouces Utihzation，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China； 2.Collaborative Innouation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province，Changde 415000，China）

Abstract:The full cDNA sequence of Myeloid differentiation factor 88（MyD88）in the barbel chub Squaliobarbus curriculus（designated as ScMyD88）has been cloned by using RACE-PCRs method.The complete sequence of ScMyD88 cDNA was 1779 bp that contained 855 bp open read frame encoding 284 amino acid residues with calculated molecular weight of 33.053 kD and a theoretical isoelectric point（PI）of 5.66.The ScMyD88 protein has typical structural features of the MyD88 family with a Death domains and a TIR domain.According to the comparison with known MyD88 amino acid sequences，the putative protein of ScMyD88 showed the highest identities with cyprinid fishes（90%—98%）and other bony fishes（67%—74%）but low identities（60%）with mammalian.MyD88 expressed in all the nine tested tissues and organs with highly expressed in the liver，head kidney and trunk kidney，and lowly expressed in the brain.The ScMyD88 was obviously up-regulated in the immune tissue at 12h and returned to the normal level after 48h challenged with GCRV.These result showed that ScMyD88 might play important roles during the immune response of barbel chub against GCRV.

Key words:Squaliobarbus curriculus； Myeloid differentiation factor 88（MyD88）； Gene cloning； Tissue expression

中圖分類號：Q785； S965

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3207（2016）03-0459-08

doi:10.7541/2016.61

收稿日期：2015-06-09；

修訂日期：2015-11-24

基金項目：國家自然科學基金面上項目（31272652）資助［Supported by the National Natural Science Foundation of China（31272652）］

作者簡介：王榮華，男，湖南益陽人； 博士； 主要研究方向為水生動物遺傳育種。E-mail:ronghua_201@163.com

通信作者：肖調義，教授； 主要研究方向為水生動物遺傳育種。E-mail:tyxiao1128@163.com