張良　王永春　朱文娟（浙江省湖州市第一人民醫(yī)院，浙江　湖州　313000）

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姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠小腸功能保護(hù)作用的研究*

張良王永春朱文娟
（浙江省湖州市第一人民醫(yī)院，浙江湖州313000）

【摘要】目的探索姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠小腸功能的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法30只SD大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、膿毒癥組和姜黃素治療組，每組10只。采用改良盲腸結(jié)扎穿孔方法建立大鼠膿毒癥模型，假手術(shù)組除不結(jié)扎刺穿盲腸外，其余操作同膿毒癥組，姜黃素治療組模型建立后1 h腹腔注射姜黃素（二甲亞砜作為溶劑），假手術(shù)組及膿毒癥組注射同樣劑量的二甲亞砜。于手術(shù)后24 h、48 h處死大鼠，測(cè)定小腸黏膜組織的含水量；小腸黏膜組織中三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、單磷酸腺苷（AMP）含量；觀察并比較各組小腸黏膜上皮組織病理改變。結(jié)果姜黃素治療組的小腸組織水腫程度較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05），較膿毒癥組明顯降低（P＜0.05）；姜黃素治療組的小腸黏膜ATP、ADP含量較膿毒癥組均有明顯升高（P＜0.05）。AMP含量明顯下降（P＜0.05）；小腸黏膜上皮組織病理學(xué)提示姜黃素治療組的組織損傷明顯輕于膿毒癥組。結(jié)論姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠小腸組織水腫和能量代謝的抑制狀態(tài)具有一定程度的改善作用。

【關(guān)鍵詞】姜黃素膿毒癥大鼠小腸功能保護(hù)

膿毒癥發(fā)病率高，病死率高，病死率可達(dá)28%～50%，目前認(rèn)為膿毒癥是由感染引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），通常認(rèn)為是由機(jī)體過度炎癥反應(yīng)或炎癥失控所致［1］。近年認(rèn)識(shí)到胃腸道在膿毒癥中的重要性，小腸作為膿毒癥的始動(dòng)器官［2-3］，更是成為新的治療靶點(diǎn)。膿毒癥時(shí)最常累及腸道，造成腸黏膜上皮水腫，上皮細(xì)胞膜及細(xì)胞間連接斷裂，細(xì)胞壞死，上皮從絨毛頂端開始脫落，甚至黏膜全層脫落而形成潰瘍，造成腸道通透性增加、腸屏障功能受損，腸道細(xì)菌及其毒素得以吸收進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)而發(fā)生細(xì)菌移位，使SIRS加劇、失控，嚴(yán)重時(shí)誘發(fā)多器官功能障礙綜合征（MODS），甚至危及患者生命［4］。有研究表明，小腸黏膜對(duì)于缺血再灌注、能量代謝障礙尤其易致屏障功能損傷進(jìn)而通透性增加，細(xì)菌過度生長(zhǎng)且發(fā)生腸道易位、毒素產(chǎn)生增多，從而加重膿毒癥，繼而又進(jìn)一步加重小腸黏膜的損傷，形成惡性循環(huán)。近年發(fā)現(xiàn)，姜黃素能起到對(duì)組織器官的保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)以膿毒癥大鼠為研究對(duì)象，觀察大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的腸組織含水量、小腸黏膜三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、單磷酸腺苷（AMP）含量表達(dá)變化，探討姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠腹腔感染所致腸損傷的保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物及分組清潔健康的SD雄性大鼠30只，鼠齡3～4個(gè)月，體質(zhì)量（300±50）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組、膿毒癥組和姜黃素治療組，每組均為10只。

1.2試劑與儀器姜黃素（curcumin）購自美國Sigma公司（批號(hào)C7727）；二甲基肼（DMH）（Sigma，D161608），HPLC液相色譜儀購自美國Waters公司；PM－10AD型光學(xué)顯微鏡，Olympus Optical Co．LTD產(chǎn)品；JA1203型電子天平，上海精科天平廠產(chǎn)品。

1.3造模方法采用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）方法建立大鼠膿毒癥模型。以乙醚間斷吸入法麻醉大鼠；待完全麻醉后，仰臥位固定大鼠，頸部皮膚常規(guī)備皮、消毒；于頸外側(cè)下頜至心臟的中點(diǎn)作1個(gè)約1 cm的橫切口，鈍性分離皮下組織，暴露右側(cè)頸外靜脈；沿血管向近心端方向插入留置針約1 cm，將導(dǎo)管從留置針管與頸外靜脈夾孔中把心導(dǎo)管慢慢置入達(dá)右心房，結(jié)扎固定，導(dǎo)管末端經(jīng)皮下隧道從頸后中央引出并固定于皮膚；管內(nèi)注射125 U/mL肝素0．5 mL抗凝，插入置管針封閉導(dǎo)管。然后沿腹白線中段作3 cm切口，探查取出盲腸；用12號(hào)針穿刺4個(gè)孔，擠出少許糞便于腹腔內(nèi)，回納盲腸，分層縫合腹腔。假手術(shù)組僅在頸部及腹部各做1個(gè)切口，不施行CLP。膿毒癥組頸部?jī)H切開，而不放置管針，其余同姜黃素治療組。手術(shù)過程中保持大鼠肛溫（37.0±0.5）℃，保持室溫（26.0±1.0）℃。

1.4給藥方法在造模成功后1 h分別給姜黃素治療組按100 mg/kg腹腔注射姜黃素（二甲亞砜作為溶劑），假手術(shù)組及膿毒癥組注射同樣劑量的二甲亞砜。1.5觀測(cè)指標(biāo)手術(shù)后24 h、48 h每組各剖殺5只大鼠。1）腸組織含水量。稱取腸組織濕質(zhì)量，然后放入恒溫箱（100.0±2.0）℃干燥，24 h后取出，稱取干質(zhì)量，計(jì)算腸組織含水量。計(jì)算公式：腸組織含水量=（腸濕質(zhì)量－腸干質(zhì)量）/腸濕質(zhì)量×100%，以%表示。2）小腸黏膜組織中ATP、ADP、AMP含量測(cè)定。距回盲部20 cm處取回腸組織0．5 g，置液氮保存，用高效液相色譜法測(cè)定ATP、ADP、AMP含量。3）病理學(xué)觀察。取小腸組織常規(guī)制作病理切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察并照相。小腸組織學(xué)結(jié)構(gòu)變化程度判定采用Ozkan標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分：正常小腸黏膜；小腸黏膜水腫變性，上皮細(xì)胞表面與固有層分離；上皮細(xì)胞壞死，局限在絨毛尖端；絨毛完全壞死；黏膜全層壞死。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠腸組織含水量比較見表1。姜黃素治療組各時(shí)間點(diǎn)腸組織含水量與假手術(shù)組對(duì)比升高（P＜0.05），但比膿毒癥組各時(shí)間點(diǎn)大鼠腸組織含水量均降低（P＜0.05）。

表1　各組大鼠腸組織含水量比較（±s）

表1　各組大鼠腸組織含水量比較（±s）

與假手術(shù)組相同時(shí)間點(diǎn)比較，*P＜0.05；與膿毒癥組相同時(shí)間點(diǎn)比較，△P＜0.05。下同。

組別　時(shí)間　含水量（%）假手術(shù)組　造模結(jié)束24 h　71.56±1.24 （n＝5）　造模結(jié)束48 h　70.86±1.31膿毒癥組　造模結(jié)束24 h　81.36±1.47*（n＝5）　造模結(jié)束48 h　82.54±1.84姜黃素治療組　造模結(jié)束24 h　78.63±1.39*（n＝5）　造模結(jié)束48 h　79.54±1.42△

2.2各時(shí)間點(diǎn)小腸黏膜組織中ATP、ADP、AMP含量見表2。小腸黏膜組織中ATP、ADP、AMP含量與假手術(shù)組比較，膿毒癥組和姜黃素治療組大鼠小腸黏膜組織中ATP、ADP含量明顯降低（P＜0.05），AMP含量升高（P＜0.05）；姜黃素治療組大鼠小腸黏膜組織中ATP、ADP含量又較膿毒癥組明顯升高（P＜0.05），AMP含量明顯降低（P＜0.05）。

表2　各時(shí)間點(diǎn)小腸黏膜組織中ATP、ADP、AMP含量比較（μmoL/g，±s）

表2　各時(shí)間點(diǎn)小腸黏膜組織中ATP、ADP、AMP含量比較（μmoL/g，±s）

組別　時(shí)間　AMP假手術(shù)組　造模結(jié)束24 h　1.61±0.21 （n＝10）　造模結(jié)束48 h　1.60±0.22膿毒癥組　造模結(jié)束24 h　2.56±0.24*ATP　ADP 6.30±0.54　3.90±0.32 6.27±0.60　3.87±0.34 3.66±1.24*2.56±0.26*（n＝10）　造模結(jié)束48 h　3.26±0.31*2.46±1.24*2.04±0.24*姜黃素治療組　造模結(jié)束24 h　4.57±1.24*3.26±0.27*2.15±0.18*（n＝10）　造模結(jié)束48 h　3.86±1.24*△2.58±0.24*△2.82±0.17*△

2.3大鼠小腸組織形態(tài)改變見圖1～圖3。在光鏡下檢查，膿毒癥組和姜黃素組均有不同程度的小腸黏膜水腫、白細(xì)胞浸潤(rùn)、出血和上皮細(xì)胞壞死脫落，其程度隨時(shí)間而加重。

圖1　假手術(shù)組大鼠小腸黏膜（HE，×200）

圖2　姜黃素組48 h小腸黏膜水腫白細(xì)胞浸潤(rùn)，但較膿毒血癥組減輕（HE，×200）

圖3　膿毒癥組48 h小腸黏膜壞死白細(xì)胞浸潤(rùn)（HE，×200）

3　討論

膿毒癥是指由感染引起的SIRS，它是由于機(jī)體對(duì)病原微生物及其產(chǎn)物產(chǎn)生的致炎性刺激失控，導(dǎo)致過度炎性反應(yīng)引起MODS，膿毒癥是急診危重癥患者死亡原因之一。膿毒癥時(shí)腸道功能受損的可能機(jī)制為：1）應(yīng)激狀態(tài)時(shí)全身炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)功能紊亂，腸道血流灌注相對(duì)減少，腸道缺血、缺氧，超過代償極限時(shí)可出現(xiàn)腸黏膜病理性氧代謝，隨之出現(xiàn)厭氧代謝、黏膜酸中毒，腸道黏膜屏障受損；2）嚴(yán)重膿毒癥、MODS時(shí)應(yīng)激或全身炎癥反應(yīng)造成分解代謝增加、負(fù)氮平衡，由于禁食、全胃腸外營養(yǎng)（TPN）可使腸道缺乏進(jìn)行自身修復(fù)所必需的谷氨酰胺，導(dǎo)致腸黏膜細(xì)胞數(shù)量減少，進(jìn)一步加重腸道屏障功能受損；3）在膿毒癥時(shí)，特別是膽道、腸道感染后，進(jìn)入腸道的細(xì)菌和內(nèi)毒素刺激腸壁內(nèi)的大量淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其他炎性細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)，炎癥介質(zhì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞反應(yīng)失控?fù)p傷腸道屏障功能。炎癥介質(zhì)種類繁多，相互之間作用復(fù)雜，主要的炎癥介質(zhì)有TNF-α、IL-6、IL-8等，在這些炎性介質(zhì)中，TNF-α是一種非常重要的炎癥因子和免疫調(diào)節(jié)因子，在炎癥瀑布反應(yīng)中起核心作用，是導(dǎo)致炎性介質(zhì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的始發(fā)因子；IL-6急性期損傷的誘導(dǎo)物，是炎性反應(yīng)的促發(fā)劑，是細(xì)胞因子釋放第二高潮期中的主要因子；IL-8參與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。炎癥啟動(dòng)后，在眾多炎性介質(zhì)中繼發(fā)產(chǎn)生，眾炎性介質(zhì)多相互作用加重瀑布效應(yīng)。研究表明，TNF-α產(chǎn)生最早，IL-6較TNF-α延遲，約8 h近高峰，而IL-8是過渡到MODS的危險(xiǎn)指標(biāo)。TNF-α由單核巨噬細(xì)胞和活化的T淋巴細(xì)胞分泌，是引起腸道黏膜損傷重要因子之一，能促進(jìn)血小板活化因子釋放、生成白三烯和氧自由基、誘導(dǎo)一氧化氮合成，從而產(chǎn)生大量一氧化氮引起細(xì)胞損傷，導(dǎo)致腸黏膜水腫、充血、甚至壞死，細(xì)胞間緊密連接受損，直接造成腸道黏膜損傷，小腸選擇性吸收及防御屏障功能障礙、腸道菌群失調(diào)、腸道內(nèi)微生態(tài)屏障紊亂，而TNF-α又能刺激單核和巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-8、CRP等炎性介質(zhì)，以及刺激中性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放各種蛋白酶和其他水解酶及氧自由基、粘附因子、可溶性免疫反應(yīng)抑制因子等，對(duì)機(jī)體造成炎性損害進(jìn)一步加重，最終導(dǎo)致小腸、腦、心、肝、腎等MODS，甚至死亡。

姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等多方面的作用［5-11］。Memist等［12］研究結(jié)果認(rèn)為膿毒癥大鼠經(jīng)姜黃素預(yù)處理后，其肝、腎及小腸組織變性壞死程度較未處理組明顯減輕，證實(shí)姜黃素對(duì)膿毒癥臟器有保護(hù)作用。相關(guān)研究［13-14］證實(shí)姜黃素能夠顯著降低細(xì)菌膿毒癥小鼠血清AST、ALT、TNF-α和一氧化氮含量，提示姜黃素具有明顯的肝臟保護(hù)作用，提高存活率。梁小仲等［15］研究證實(shí)嚴(yán)重腹腔感染可明顯上調(diào)膿毒癥大鼠肺組織高遷移率族蛋白B1（HMGB1）mRNA和HMGB1蛋白表達(dá)水平。姜黃素可能通過抑制肺組織HMGB1，下調(diào)膿毒癥大鼠肺組織髓過氧化物酶（MPO）活性，減輕肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，減緩脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷程度，提高膿毒癥大鼠的生存率。姜云龍等［16］在最近的研究中發(fā)現(xiàn)姜黃素可明顯減輕膿毒癥狀態(tài)下脾臟淋巴細(xì)胞凋亡，且這一作用可能是通過拮抗線粒體凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)他認(rèn)為姜黃素的強(qiáng)效抗氧化特性，可以使過多的自由基直接作用于細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而姜黃素可通過清除活性氧自由基，抑制氧自由基產(chǎn)生進(jìn)而影響胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，改善機(jī)體的免疫功［17-19］，從而起到對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。

小腸黏膜組織中ATP、ADP、AMP含量反應(yīng)了腸黏膜的活性，此次研究中，發(fā)現(xiàn)姜黃素通過提高腸黏膜中ATP、ADP含量，降低AMP含量，對(duì)腸道起到保護(hù)作用，而劉蓮等［20］研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有明顯促進(jìn)動(dòng)物胃腸運(yùn)動(dòng)作用，但具體的通道目前仍不明確，需進(jìn)一步研究。

本次研究表明，姜黃素能有效減輕重癥膿毒癥大鼠的病情，對(duì)膿毒癥大鼠腸道功能起到保護(hù)作用，但本實(shí)驗(yàn)中筆者也發(fā)現(xiàn)單純使用姜黃素并不能完全控制膿毒癥大鼠腸道功能的損害，這進(jìn)一步提示我們膿毒癥大鼠腸道功能的損傷是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要進(jìn)一步深入的研究。在當(dāng)前對(duì)膿毒癥發(fā)生機(jī)制尚不完全清晰、難于提出有效治療建議的情況下，應(yīng)用姜黃素處理膿毒癥大鼠，可以減輕大鼠小腸黏膜組織的水腫程度，改善腸道能量代謝，從而對(duì)膿毒癥時(shí)腸黏膜功能損害等起到一定的抑制作用，保護(hù)腸道的屏障功能，從而改善膿毒癥預(yù)后，為膿毒癥的治療提供新的思路。

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·證治探討·

·薪火傳承·

The Study on the Protective Effect of Curcumin on Small Intestinal Function in Septic Rats

ZHANG Lang，WANG Yongchun，ZHU Wenjuan.The Department of General Surgery of the First People′S Hospital of Huzhou，Zhejiang，Huzhou 313000，China.

【Abstract】Objective：To study the protective effect and mechanism of curcumin on small intestinal function in septic rats.Methods：30 SD rats were randomly divided into the sham group，sepsis group，and curcumin group.Septic models were induced with cecal ligation and puncture（CLP）.In the sham group，the abdomen was opened without CLP.In curcumin group，curcumin was intravenously injected curcumin in abdomina after CLP.Five rats of the each group were sacrificed at 24 h and 48 h respectively after CLP.Moisture capacity levels of ADP，ATP and AMP of the small intestinal mucosa were measured.Pathological changes of small intestinal mucosa were observed.Results：The levels of tissue edema in the small intestinal mucosa of curcumin group were significantly higher than those of the sham group（P＜0.05），while significantly lower than the sepsis group（P＜0.05）.Compared with the septic group，the levels of ATP and ADP in the small intestinal mucosa of curcumin group were significantly higher（P＜0.05）；and the level of AMP of the small intestinal mucosa of curcumin group was much lower（P＜0.05）；severer pathological changes were found in the sepsis group than that in curcumin group.Conclusion：In some degree，curcumin may improve edema of small intestine and Inhibition of energy metabolism in rats with sepsis.

【Key words】Curcumin；Sepsis；Rats；Small intestinal function；Protective

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-745X（2016）04-0627-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.018

*基金項(xiàng)目：浙江省湖州市科技局項(xiàng)目（2013GY13）

收稿日期（2015-12-02）