趙瑤瑤，季慧寧，馬 瑩，周慶瑤，葛繪春，張麗媛，2*（.黑龍江八一農(nóng)墾大學 食品學院，黑龍江 大慶 6339；2.吉林大學 化學學院，吉林 長春 3002）

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改進的QuEChERS法測定大豆中三嗪類除草劑

趙瑤瑤1，季慧寧1，馬 瑩1，周慶瑤1，葛繪春1，張麗媛1，2*
（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學 食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.吉林大學 化學學院，吉林 長春 130012）

摘 要：為了得到有效的凈化分離和萃取方法，對經(jīng)典QuEChERS法進行改進。建立大豆中三嗪除草劑萃取、凈化的新型QuEChERS法，高效液相色譜法對其進行檢測?？疾燧腿╊愋?、用量，吸附劑類型、用量，樣品溶液pH值以及萃取時間等對萃取、凈化效果的影響。在最有條件下，該方法線性關(guān)系良好，西瑪通、草凈津、敵草凈、特丁通、特丁津的檢出限分別是5.0，6.4，8.5，5.9和4.8μg/kg，回收率在93.1-107.8%之間，相對標準偏差低于5.6 %。

關(guān)鍵詞：QuEChERS法；萃取；凈化；三嗪除草劑；大豆；

1 三嗪類除草劑的概念

三嗪類除草劑作為選擇性內(nèi)吸傳導型苗前、苗后除草劑，是早在20世紀50年代就推出的傳統(tǒng)型除草劑，其通過光合系統(tǒng)（PSⅡ）以D蛋白為作用靶標，抑制植物的光合作用而發(fā)揮作用，對一年生禾本科雜草和闊葉雜草有很好的防除作用，對某些多年生雜草也有一定的抑制作用，在農(nóng)業(yè)中用途十分廣泛。但是由于除草劑是高度化學穩(wěn)定的且用量較大，會在環(huán)境中殘留很多年，因此會產(chǎn)生危害生物和環(huán)境的嚴重副作用，造成生態(tài)破壞［1-3］。大量的研究報道已經(jīng)證實三嗪除草劑可能導致先天性缺陷，并可能致癌，引起內(nèi)分泌失調(diào)等［4-6］。目前此類除草劑的危害越來越引起人們的關(guān)注，許多國家和地區(qū)都制定了食品中三嗪類除草劑殘留最高限量規(guī)定［7-10］，歐盟（EU）立法規(guī)定了農(nóng)藥的最大殘留限量（MRL）并確定了對人類食物中除草劑的MRL為0.01mg/ kg。

在分析復雜基質(zhì)時樣品的前處理是十分重要的。如液-液萃取法（LLE），索氏萃取法加壓溶劑萃取法（PLE），固相萃?。⊿PE），基質(zhì)固相分散法（MSPD），分散固相萃取（DSPE），以及快速（Quick）、簡易（Easy）、廉價（Cheap）、有效（Effective）、耐用（Rugged）和安全法（Safe）的QuEChERS法［11，12］。QuEChERS法因其安全性，簡單性，可調(diào)性，有效性，高效性以及結(jié)果可靠性等優(yōu)點，在近幾年的樣品制備中應用越來越廣泛。QuEChERS法是Anastassiades等人于2003年為檢測水果和蔬菜中的農(nóng)藥而開發(fā)的方法。該方法包括用乙腈從水基質(zhì)中萃取，同時使用無水MgSO4與NaCl混合，在上清液中加入MgSO4和PSA，用分散固相萃取法凈化分離。高效液相色譜法（HPLC）作為監(jiān)測這些極性和熱穩(wěn)定性除草劑的常用方法。

本實驗中，乙酸乙酯和正己烷的混合物代替乙腈作為萃取大豆中三嗪除草劑的萃取劑。用少量的NaCl代替鹽混合物以避免鹽的凝絮。此外，將PSA的量從25mg/mL減至10mg/mL。用冷凍離心去除脂肪。此改進的QuEChERS法在處理復雜基質(zhì)時能夠獲得快速、簡便、廉價、有效和干凈的除草劑萃取。

2 實驗部分

2.1儀器和試劑

Agilent1200型高效液相色譜儀，配有多波長檢測器、真空脫氣機和Chemstation工作站（美國Agilent公司）；電子分析天平（ALC-310型，上海民橋科學儀器有限公司）；SH-36型攪拌器（正慧，上海，中國），RE-52AA型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（亞榮，上海，中國）；超聲波清洗器（KQ2200E，中國昆山儀器有限公司）；高速離心機（Allegre 64R，美國貝克曼公司）；純水凈化儀（Milli-Q，法國Millipore公司）；移液槍（Finnpipetter F3，賽默飛世爾科技公司）；微量注射器（美國Agilent公司）；針式有機相濾膜（0.22 μm，天津蘭博儀器有限公司）

西瑪通、草凈津、敵草凈、特丁通、特丁津均購于國家藥物與生物制品研究所。每種農(nóng)藥對照品均用甲醇配制濃度為500μg/mL的標準儲備液。每周甲醇稀釋標準儲備液制得不同濃度的標準工作溶液。所有的溶液在4℃的冰箱中儲存。

2.2樣品

大豆購于當?shù)卮笮统胁⒂?°C儲存。取大豆粒，粉粹，過80目篩子，每份稱取5.000g大豆粉末，分別將標準混合工作液加入到粉末樣品中，為了便于均勻混合加入5mL丙酮，振蕩10分鐘，制得含有三嗪除草劑的加標樣品。放置的加標樣品也是用上述方法配得，將加標樣品儲存在了密封瓶中，并在4℃的條件下分別放置了7天，14天，21天和28天。

2.3HPLC條件選擇

流動相A和B分別是水和乙腈，在柱溫35℃的條件下梯度洗脫以達到分離目的。梯度如下：0-5min，40-60% B；5-10min， 60-80%B；15-25min， 80-40%B。流動相的流速為0.5mL?min-1。樣品進樣量為20μL，紫外檢測波長為228 nm。

2.4QuEChERS萃取過程

準確稱取5.000g樣品加入到25mL離心管中，加水5mL，選擇使用0.5mol?L-1NaOH和0.5mol?L-1 HCl調(diào)節(jié)樣品溶液pH值到7，用力振蕩20s。隨后，向管中加入10mL萃取劑（乙酸乙酯：正己烷=1：1）和0.5g NaCl，超聲萃取2min。樣品在0℃以15000 rpm離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一支含有100mg吸附劑的離心管中，攪拌混合2min，以4000rpm離心10min。然后，轉(zhuǎn)移上清液至雞心瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸干后用200μL溶劑（甲醇）回溶。得到的溶液在-10℃以15000rpm離心10min。最后，用PTFE濾膜將上清液過濾后進樣分析。

2.5方法評價

2.5.1線性關(guān)系

校正曲線（工作曲線）是由加標樣品中目標分析物分析后得到的峰面積和其相應的濃度繪。用上述萃取方法處理2.2中加標的樣品。以峰面積A對分析物的濃度C制作工作曲線。數(shù)據(jù)的線性以線性相關(guān)系數(shù)進行評價。檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）分別是產(chǎn)生3倍和10倍信噪比時對應的最低濃度值。

2.5.2精密度和回收率

對于同一樣品，一天內(nèi)分析3次，求得日內(nèi)精密度，對于同一樣品，在三天內(nèi)每天分析一次，求得日間精密度。日內(nèi)和日間精密度以相對標準偏差（RSDs）表示。

3 結(jié)果與討論

3.1改進萃取條件的優(yōu)化

在實驗條件優(yōu)化過程中，所有的實驗進行三次平行樣測定。

3.1.1溶液pH值的影響

考察樣品溶液pH值分別為2、4、6、8、10時對實驗結(jié)果的影響，如圖1，實驗結(jié)果表明當溶液pH值從2調(diào)到6時，目標分析物的回收率逐漸增大并達到最大值；當pH值再繼續(xù)增加時回收率下降，主要是因為三嗪類除草劑在弱酸環(huán)境中性質(zhì)穩(wěn)定，在強酸堿環(huán)境中易分解。

因此pH值選擇6為最佳。

圖1 溶液pH值的影響

3.1.2萃取劑的影響（類型和用量）

萃取效果的好壞直接影響著目標分析物的分析結(jié)果。為了獲得最優(yōu)參數(shù)，實驗考察包括甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷和乙酸乙酯/正己烷在內(nèi)的五種有機單溶劑和混合溶劑的萃取效果。實驗結(jié)果如圖2所示，當使用乙酸乙酯/正己烷作為萃取劑時得到較高的回收率、更干凈的譜圖以及較低的基線噪聲。

圖2 萃取劑類型的影響

萃取劑體積對實驗的影響也進行了考察。在2-10mL內(nèi)增加萃取劑的體積，分析物峰面積的增大，但是當萃取劑體積大于10mL時，峰面積不發(fā)生變化。因此，選擇萃取劑的最優(yōu)體積為8mL。

3.1.3吸附劑的影響（類型和用量）

實驗考察C18，PSA（N-丙基乙二胺），Al2O3，硅酸鎂和硅膠在內(nèi)的六種吸附劑對實驗結(jié)果的影響。通過比較目標分析物的回收率發(fā)現(xiàn)當選擇PSA時回收效果最好，這主要是因為多數(shù)的雜質(zhì)都被吸附在PSA上，PSA是與NH2相似的吸附劑，有兩個氨基PKa值分別為10.1和10.9。有比氨基柱更強的離子交換能力。同時PSA可與金屬離子產(chǎn)生鰲合作用，有利于提取金屬離子，能夠有效去除有機酸、色素和金屬離子等雜志，凈化效果最佳，結(jié)果如圖3。

圖3 吸附劑類型的影響

PSA用量（0mg-250mg）對實驗結(jié)果的影響也被考察，當PSA用量低于100mg時，目標分析物的回收率隨PSA的量增加而增大；當PSA的量大于100mg時，峰面積略微降低，因此，選擇PSA的量在100mg為最佳。

3.1.4萃取時間的影響

通過在1-8min內(nèi)進行實驗來評估萃取時間的影響。當超聲萃取時間從1min到2min時，目標分析物的回收率明顯增大，但當萃取時間持續(xù)延長時峰面積卻基本不再變化，證明萃取過程完成。因此，選定萃取時間為2min。

3.2方法評價

3.2.1回歸方程

在最優(yōu)化的實驗條件下，從加標樣品中萃取五種三嗪除草劑并進行分析。以加標目標分析物所獲得的峰面積為縱坐標，以除草劑含量為橫坐標，繪制工作曲線。結(jié)果如表1，表中列出線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

通過工作曲線計算方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ），LOD和LOQ均由下式計算：LOD =3σ/k， LOQ =10σ/k，其中σ是將11個空白樣品直接進樣進行HPLC分析得到的信號的標準偏差，k是工作曲線的斜率。該方法能夠取得很好的線性且全部分析物的相關(guān)系數(shù)都在0.9983到0.9999范圍內(nèi)，結(jié)果令人滿意。

表1 分析性能Table 1 Analytical performance

3.2.2精密度和回收率

為了評價方法的精密度和準確性，制備三個加標水平（10μg/mL，50μg/mL，100μg/mL）的加標樣品進行日內(nèi)精密度和日間精密度的分析，日內(nèi)精密度是通過1天之內(nèi)平行測定3次加標樣品所得到回收率的相對標準偏差。日間精密度是通過每天分析1次加標樣品，連續(xù)分析3天所得回收率的相對標準偏差。結(jié)果如表2所示。

表2 樣品分析結(jié)果Table 2 Analytical results of samples

2 Simeton 95.2 3.6 4.9 94.9 3.3 4.7 94.5 3.4 4.4 Cyanazine 97.8 3.4 5.0 98.8 3.1 5.1 97.2 3.5 4.7 Desmetryn 93.1 3.5 4.8 93.2 3.4 5.0 94.2 3.7 4.8 Terbumeton 104.3 3.5 5.1 105.4 3.6 4.8 105.9 4.0 4.6 Terbuthylazine 106.9 3.7 5.4 107.1 3.3 4.7 107.8 3.6 5.1 Simeton 94.8 3.8 5.3 94.4 3.4 4.8 93.7 3.1 4.4 Cyanazine 98.1 4.1 5.6 98.7 3.2 4.7 96.6 3.3 4.9 3 Desmetryn 94.2 3.9 4.8 93.7 3.5 4.6 95.4 3.3 4.7 Terbumeton 104.3 3.7 4.9 105.4 3.4 4.5 104.8 3.2 4.6 Terbuthylazine 106.8 3.6 4.8 107.2 2.9 4.2 107.2 3.4 4.8 Simeton 96.1 3.2 5.1 94.9 3.2 4.4 95.2 3.3 4.8 Cyanazine 97.4 4.0 4.9 96.7 3.1 4.9 95.7 3.3 4.9 4 Desmetryn 93.8 3.7 4.7 94.1 3.3 4.7 93.9 3.2 4.8 Terbumeton 104.9 3.4 5.1 105.4 3.4 5.1 105.1 3.0 4.2 Terbuthylazine 107.4 4.1 4.8 106.8 3.1 4.7 106.9 3.4 4.8

3.2.3樣品分析

為了考察改進QuEChERS法的適用性，對加入三種標準濃度（10μg/kg、50μg?mL-1和100μg?mL-1）的大豆樣品（樣品1-4）進行分析。結(jié)果列于表2中。表中結(jié)果表示，現(xiàn)有方法能夠得到很好的回收率（93.1-107.8%）和精密度（≤5.60%）。空白樣和加標樣的色譜圖如圖4所示。

圖4 色譜圖 （a） 標準溶液，（b） 加標樣品，（c） 空白樣品

4 結(jié)論

本實驗為了改進QuEChERS法凈化效率低的缺點，進一步得到有效的凈化分離和萃取方法，成功用乙酸乙酯和正己烷的混合物萃取大豆中五種三嗪除草劑，用PSA作為吸附劑吸附樣品溶液中的雜質(zhì)。實驗考察萃取劑、吸附劑、樣品溶液pH值以及萃取時間對萃取效能和效率的影響，最后選定最優(yōu)條件。

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A Modified Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe Method for the Determination of Triazine Herbicides in Soybean Sample

Zhao Yaoyao1， Ji Huining1， Ma Ying1， Zhou Qingyao1， Ge Huichun1，Zhang Liyuan1，2
（1.College of Food， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China；2.College of Chemistry， Jilin University， 130012，China）

Abstract:The classic Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe method was improved in order to get effective purification，separation and extraction method. A new type method was developed to extraction and purification of triazine herbicides from soybean sample. The high performance liquid chromatography was applied to the determination of the herbicides. The influence factors， including the effect of extraction agent， the effect of adsorbent， pH value of sample solution and extraction time， were investigated. Under the optimized experimental conditions， the linearities for determining the analytes were good. The limits of detection for simeton， cyanazine，desmetryn，terbumeton and terbuthylazine were 5.0， 6.4， 8.5， 5.9， and 4.8 μg/kg， respectively. When the present method was applied to the analysis of four soybean samples， the recoveries of the analytes ranged from 93.1% to 107.8% and relative standard deviations were lower than 5.6%.

Key words：QuEChERS method；extraction；purification；triazine herbicides；soybean；

基金項目：黑龍江省大學生創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新訓練項目，項目編號：201510223013；黑龍江省自然基金面上項目，項目編號：B2015010。

作者簡介：張麗媛（1981-），女，黑龍江大慶人，碩士，講師；研究方向：儀器分析，食品安全。