范仁根查文章周勇周建平單湘湘

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miR-590-5P通過下調(diào)靶基因S100A10表達(dá)、抑制Wnt信號通道調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖*

范仁根①查文章①周勇①周建平①單湘湘①

【摘要】目的：研究miR-590-5P對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響以及參與HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。方法：利用QPCR對肝癌細(xì)胞株miR-590-5P的表達(dá)譜系進(jìn)行分析和驗(yàn)證，生物信息技術(shù)預(yù)測S100A10可作為miR-590-5P的潛在靶基因，并通過實(shí)時(shí)定量PCR以及Western blot進(jìn)行驗(yàn)證。通過慢病毒載體在肝癌細(xì)胞株HepG2中過表達(dá)miR-590-5P，CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期變化，Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞Wnt信號相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：熒光定量檢測結(jié)果顯示，miR-590-5P在人肝癌細(xì)胞中低表達(dá)，而S100A10蛋白在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)。S100A10 3’UTR luciferase 報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證表明，miR-590-5P可以通過結(jié)合S100A10 3’UTR而抑制報(bào)告基因的表達(dá)。通過慢病毒系統(tǒng)在HepG2細(xì)胞中高表達(dá)miR-590-5P，可有效抑制S100A10基因的表達(dá)。在肝癌細(xì)胞HepG2中過表達(dá)miR-590-5P，可通過調(diào)控細(xì)胞周期，明顯抑制Wnt信號相關(guān)蛋白：Wnt5a、cMyc、CyclinD1的表達(dá)水平，促進(jìn)E-cadherin、Caspase3的表達(dá)，加速β-catenin蛋白的磷酸化，而調(diào)控細(xì)胞增殖。結(jié)論：miR-590-5P在人肝癌細(xì)胞中低表達(dá)，而S100A10基因在人肝癌細(xì)胞中過表達(dá)，S100A10為miR-590-5P的靶基因。miR-590-5P在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)，可有效抑制S100A10基因的表達(dá)，抑制Wnt通路的激活，使腫瘤細(xì)胞停滯在G1期，從而參與肝癌細(xì)胞增殖進(jìn)程。

【關(guān)鍵詞】miR-590-5P； 肝癌細(xì)胞

①江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院 江蘇 鹽城 224000

Medical Innovation of China， 2016，13（16）：004-008

First-author's address：First People's Hospital of Yancheng City，Yancheng 224000，China

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類進(jìn)化上保守，大小為20～25個(gè)核苷酸（nucleotide，nt）的非編碼小RNA。成熟的miRNA與其靶信使RNA3’端UTR完全或不完全配對后，通過切割或抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄后翻譯，參與調(diào)節(jié)生物的發(fā)育、細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等，并與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1］。miRNA的發(fā)現(xiàn)為基因表達(dá)調(diào)控研究打開了新的窗口，異常表達(dá)的miRNA及其靶基因的發(fā)現(xiàn)不僅豐富了腫瘤的發(fā)病機(jī)制，也為探索新的基因靶向治療提供依據(jù)［2］。S100A10（又名P11）是S100鈣結(jié)合蛋白家族成員之一，是一種鈣依賴性的信號通路的介導(dǎo)分子，在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常［3］。S100A10蛋白在Annexin Ⅱ介導(dǎo)的生物膜的聚集和融合過程中具有重要作用，參與Annexin Ⅱ四聚體形式介導(dǎo)的質(zhì)膜循環(huán)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中具有重要意義。筆者通過檢測HCC癌與癌旁臨床樣本（10例）中S100A10表達(dá)，顯示大部分HCC腫瘤組織S100A10較癌旁組織高表達(dá)，而miR-590-5P較癌旁組織低表達(dá)，提示S100A10、miR-590-5P與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本文擬通過分子生物和細(xì)胞技術(shù)探討miR-590-5P調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的潛在機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料 人肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞株QGY-7701、HepG2、SK-HEP-1、SMMC-7721、BEL-7402、Li-7（湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫），DMEM培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清FBS（Gibco），Lipofectamine 2000（Invitrogen），miR-590-5P/3P定量PCR引物（上海生工），DH5a感受態(tài)細(xì)胞（寶生物工程有限公司），慢病毒實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、慢病毒表達(dá)載體（System Biosciences公司）。0.25%胰蛋白酶-EDTA （Hyclone），RIPA裂解液（sigma），BCA蛋白定量試劑盒（Pierce），ECL發(fā)光試劑盒（GE），顯影膠片（KODAK），鼠S100A10抗體（Abcam），鼠Wnt-5a單抗（Abcam），鼠cMyc單抗（abcam），鼠Cyclin D1單抗（Santa cruz），鼠Caspase 3單抗（Santa cruz）、鼠β-catenin單抗（Santa cruz），雙熒光報(bào)告載體、雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測試劑盒（Promega），限制性內(nèi)切酶（NEB），PrimeSTAR HS DNA聚合酶（TaKaRa），DNA凝膠純化試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒（天根）。

1.2儀器 DU800核酸蛋白分析儀（Beckman），凝膠成像系統(tǒng)（上海培清科技），實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad），流式細(xì)胞儀（FACS Calibur，BD），PCR儀器（SENSO），冷凍低溫離心機(jī)（黑馬HEMR），組合式電泳、電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（Bio-Rad），超凈工作臺(tái)，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，電熱恒溫水槽（上海恒科技），化學(xué)發(fā)光儀（Promega）。

1.3方法

1.3.1QPCR檢測方法 以snRNA U6 作為miRNA QPCR的檢測內(nèi)參，其中U6上游引物為：TGGCACCCAGCACAATGAA，下游引物為：CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA，引物為生工生物工程（上海）股份有限公司購買，反應(yīng)條件參照試劑說明書相應(yīng)體系進(jìn)行操作，結(jié)果通過以snRNA U6為內(nèi)參計(jì)算2-ΔΔCT值比較各組miRNA表達(dá)差異。

1.3.2Western blot 使用RIPA裂解液裂解各組細(xì)胞，通過BCA蛋白定量試劑盒行蛋白定量，取20 μg的總蛋白行12% SDS-PAGE膠，120 V恒壓電泳（約1.5 h），轉(zhuǎn)膜、封閉和孵育抗體，通過HRP-ECL法，用X光膠片曝光，檢測各實(shí)驗(yàn)組S100A10、Wnt5a，cMyc，Cyclin D1，Caspase 3 and phosphorylation levels of β-catenin、β-actin（內(nèi)參）蛋白表達(dá)水平。

1.3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 參照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48 h檢測轉(zhuǎn)染水平。

1.3.4細(xì)胞增殖功能檢測（CCK-8法） 消化并收集各組細(xì)胞以1×103種于96孔板中，體積100 μL/孔，按照不同時(shí)間點(diǎn)（0、24、48 h）加入CCK-8（CK04，同仁化學(xué)），震蕩10 min后置酶標(biāo)儀上檢測490 nm處吸光度值。

1.3.5細(xì)胞周期檢測 收集各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS （pH=7.4）洗滌兩次，離心，收集細(xì)胞沉淀；加入預(yù)冷70%乙醇，于4 ℃放置過夜。PBS洗滌細(xì)胞兩次，1000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，加入100 μL PBS（含50 μg/mL PI、100 μg/mL RNase A），4 ℃避光常溫孵育30 min，上機(jī)（FACS Calibur，BD）檢測。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1miR-590-5P在人肝癌細(xì)胞中低表達(dá)，而S100A10在肝癌細(xì)胞中高表達(dá) QPCR、Western blot分別用于檢測miR-590-5P、S100A10在不同肝癌細(xì)胞株和正常肝細(xì)胞株中的表達(dá)水平。mir-590-5P在所有肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平明顯低于正常肝細(xì)胞株（L-02）（P＜0.01），見圖1。而S100A10在所有肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平明顯高于正常肝細(xì)胞株（L-02）（P＜0.01），結(jié)果提示：miR-590-5P在人肝癌細(xì)胞中低表達(dá)、S100A10在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，見圖2。而生物信息學(xué)預(yù)測miR-590-5P在S100A10保守位點(diǎn)有高分?jǐn)?shù)結(jié)合，因此可將其作為重要的候選靶基因，見圖3。

圖1　人肝癌細(xì)胞株中miR-590-5P含量

圖2　Western blotting檢測不同肝癌細(xì)胞株中S100A10蛋白含量

圖3　miR-590-5P與S100A10靶位點(diǎn)及突變位點(diǎn)配對圖

2.2miR-590-5P可以通過與靶基因S100A10的3’UTR直接作用下調(diào)其表達(dá) 構(gòu)建pcDNA-miR-590-5P重組表達(dá)載體及pS100A10A-3’UTR-PGL3報(bào)告基因重組質(zhì)粒，S100A10 3’UTR Luciferase報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證表明，miR-590-5P可以通過結(jié)合S100A10 3'UTR而抑制報(bào)告基因的表達(dá)，將預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)突變，其抑制效應(yīng)也隨即消失，提示：miR-590可以通過與靶基因S100A10的3’UTR直接作用下調(diào)其表達(dá)，見圖4。此外，筆者通過慢性病毒系統(tǒng)在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Lv-miR-590-5P，通過QPCR和Western blot對轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)miR-590-5P 在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)，且能有效抑制S100A10的表達(dá)，見圖5～6。

圖4　S100A10 3’UTR Luciferase報(bào)告分析

圖5　各組miR590-5P的表達(dá)水平

圖6　各組S100A10蛋白的表達(dá)水平

2.3HepG2細(xì)胞株中過表達(dá)miR-590-5P可明顯抑制細(xì)胞的增殖活性，使其細(xì)胞周期發(fā)生停滯HEPG2分別轉(zhuǎn)染miR-590-5P和空白質(zhì)粒，CCK-8法檢測細(xì)胞活性，與空白對照組相比較，在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)miR-590-5P，可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增值活性。同時(shí)筆者研究示：HepG2細(xì)胞株轉(zhuǎn)染Lv-miR-590-5P 24、48 h后，與對照組細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而72 h后，轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖7。因此筆者認(rèn)為miR-590-5P通過時(shí)間依賴機(jī)制（細(xì)胞周期改變）抑制肝癌細(xì)胞增殖，基于此筆者通過流式細(xì)胞儀檢測Lv-miR-590-5P轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期分布，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，其可以使細(xì)胞明顯阻滯于G1期，見圖8。

2.4HepG2細(xì)胞株中過表達(dá)mir-590-5P可抑制Wnt信號通道 在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)miR-590-5P，可抑制Wnt信號相關(guān)蛋白：Wnt5A、c-Myc、CyclinD1、MMP7的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)E-cadherin、Caspase3蛋白的表達(dá)，促進(jìn)β-catenin蛋白的磷酸化水平，見圖9。

圖7　 基因干預(yù)后各組細(xì)胞數(shù)情況

圖8　細(xì)胞周期檢測

圖9　Western blot檢測HepG2細(xì)胞過表達(dá)miR-590-5P及Wnt信號相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3　討論

miRNA作為一類具有調(diào)節(jié)作用的小RNA，它調(diào)節(jié)人體內(nèi)1/3的信使RNA（mRNA）的表達(dá)，且參與人體內(nèi)包括腫瘤發(fā)生在內(nèi)的多種生物學(xué)過程［4］。近來，越來越多的研究表明miRNA在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡途徑中發(fā)揮重要作用。已有研究表明，miR-21、miR-375、miR-224、miR-195、miR-15b等miRNA可通過直接或間接調(diào)控靶基因影響細(xì)胞的增殖、凋亡以及侵襲和轉(zhuǎn)移，進(jìn)而參與HCC的發(fā)生、發(fā)展［5-7］。Chung等［8］發(fā)現(xiàn)miRNA-15b可通過抑制腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）誘導(dǎo)的死亡受體凋亡通路，而抑制HCC細(xì)胞凋亡。GUO等［9］發(fā)現(xiàn)在激活的肝星狀細(xì)胞中高表達(dá)miRNA-15/16，可負(fù)向凋節(jié)靶點(diǎn)Bcl-2，進(jìn)而激活Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9，從而通過死亡受體、線粒體介導(dǎo)的凋亡通路誘導(dǎo)激活的肝衛(wèi)星干細(xì)胞凋亡。Wu等［10］研究表明：miR-184可抑制SOX7表達(dá)而調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖。而miR-590-5P位于人類基因組7號染色體長臂近端，且研究表明：miR-590的兩個(gè)臂5P和3P在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［11］。筆者的研究表明，在肝癌細(xì)胞中miR-590-5P低表達(dá)，并通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)其靶基因S100A10。

為了探索miR-590-5P對HCC細(xì)胞功能的影響，筆者通過在人HCC細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-590-5P寡聚核苷酸，上調(diào)miR-590-5P 在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-590-5P促進(jìn)β-catenin磷酸化、抑制c-Myc、CyclinD1蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯在G1期，而顯著抑制細(xì)胞增殖。

Wnt/β-catenin信號通路是一條進(jìn)化過程中高度保守的信號通路，以轉(zhuǎn)錄輔助因子β-catenin為主要介導(dǎo)因子，Wnt/β-catenin信號紊亂與肝癌等發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［12］。許多腫瘤細(xì)胞中存在Wnt/β-catenin信號通路的異?；罨掷m(xù)激活的β-catenin可以促進(jìn)下游靶基因，如CyclinD1、c-Myc等表達(dá)增高，從而引起細(xì)胞增殖［13-14］。同時(shí)肝癌細(xì)胞株中過表達(dá)miR-590-5P，Caspase3表達(dá)明顯增加，這表明miR-590-5P可活化Caspase3途徑，參與HepG2細(xì)胞凋亡，表明在體外實(shí)驗(yàn)中，miR-590-5P參與HepG2細(xì)胞的增殖及凋亡進(jìn)程［15］。然而這些實(shí)驗(yàn)效果只是建立在一種細(xì)胞模型中，因此需要更多的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

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MiR-590-5P Inhibits Growth of HepG2 Cells via Decreasing S100A10 Expression and Inhibiting Wnt Pathway

FAN Ren-gen，CHA Wen-zhang，ZHOU Yong，et al

【Key words】MiR-590-5P； Hepatoma cell

【Abstract】Objective：To study the effect of miR-590-5P on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells and the mechanism involved in the occurrence and development of HCC.Method：The QPCR was used on hepatocellular carcinoma cell line miR-590-5P expression spectrum analysis and verification，the bioinformaticsprediction S100A10 as miR-590-5P potential target genes and verified by quantitative real-time PCR and Western blot.By lentiviral vector in hepatocellular carcinoma cell line HepG2 cells over expressing miR-590-5P，detected by CCK-8 assay after transfection cell proliferation，flow cytometry was transfected into the cell cycle.After transfection，the cells Wnt signaling associated protein expression levels were detected by Western blot.Result：The results of fluorescence quantitative analysis showed that miR-590-5P was low expressed in human hepatocellular carcinoma cells，while S100A10 protein was highly expressed in hepatocellular carcinoma cells.3’UTR luciferase S100A10 reporting system validation showed that miR-590-5P can inhibit the expression of the reporter gene by binding to 3’UTR S100A10.The expression of S100A10 gene could be effectively inhibited by high expression of miR-590-5P in HepG2 cells through the slow virus system.In human hepatoma HepG2 cells overexpressing miR-590-5P，through the regulation of cell cycle，inhibit Wnt signaling related proteins： Wnt5a，cmyc and CyclinD1 expression level，promoted the expression of E-cadherin and Caspase3，acceleration of beta catenin protein phosphorylation，and regulation cell proliferation.Conclusion：MiR-590-5P in human hepatocellular carcinoma cells in low expression，and S100A10 gene in human hepatocellular carcinoma cells over expression，S100A10 for the miR-590-5P target gene.Overexpression of miR-590-5P in hepatocellular carcinoma cells can effectively inhibit the expression of S100A10 gene，inhibit the activation of Wnt pathway，so that the tumor cells in the G1 phase of stagnation，so as to participate in the process of proliferation of hepatocellular carcinoma cells.

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.16.002

*基金項(xiàng)目：鹽城市科技局、鹽城市衛(wèi)生局科技計(jì)劃項(xiàng)目（YK2014010）

通信作者：單湘湘

收稿日期：（2015-11-26） （本文編輯：周亞杰）