楊燕蘭 梁嘉雯

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淺談微生物實(shí)驗(yàn)室中細(xì)菌的鑒定方法建立及探索

楊燕蘭 梁嘉雯

【摘要】目的 對(duì)潔凈室收集到的某一微生物進(jìn)行鑒定。方法 采用無(wú)菌操作技術(shù)對(duì)所采集的環(huán)境菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，結(jié)合革蘭氏染色法技術(shù)及API鑒定系統(tǒng)，對(duì)環(huán)境菌進(jìn)行鑒定分析，從而建立起微生物實(shí)驗(yàn)室中細(xì)菌的鑒定方法與步驟。結(jié)果 待鑒定菌有96.1%的可能性是表皮葡萄球菌，2.1%的可能性是產(chǎn)色葡萄球菌。結(jié)論 該方法的鑒定概率屬于“好的鑒定”。

【關(guān)鍵詞】微生物鑒定；革蘭氏染色；API鑒定系統(tǒng).

Objective To identify a microorganism collected in the clean room. Methods Using aseptic technique collected bacteria were isolated and cultured environment，combined with gram staining technology and API identification systems，forensic analysis of environmental bacteria，in order to establish microbiological laboratory methods and procedures identified in bacteria. Results The possibility that the unknown microorganism is staphylococcus epidermidis is 96.1%，the possibility that the unknown microorganism is staphylococcus chromogenes is 2.1%. Conclusion The identification probability of the method belongs to “good identification”.

【Key words】Microbial Identification，Gram staining，API identification system.

在1970年之前，世界各國(guó)的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室一直沿用100多年前由革蘭巴斯德和克霍及皮特里等人創(chuàng)建的傳統(tǒng)鑒別方法來(lái)鑒別微生物［1］。直至20世紀(jì)中葉，微生物學(xué)家才開(kāi)始致力于微生物的致病力、生理及基因等方面的研究，并將數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)及分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于微生物分類(lèi)學(xué)，從而建立了微生物數(shù)碼鑒別系統(tǒng)［2］。將微生物的各種生理生化特征進(jìn)行分類(lèi)、編號(hào)并建成編碼數(shù)據(jù)庫(kù)，再將未知微生物鑒別時(shí)所得到的生理生化特征轉(zhuǎn)換成數(shù)值，將數(shù)值與編碼數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)照比較，從而獲知未知微生物的鑒別方法稱(chēng)為數(shù)值（或數(shù)碼）鑒別系統(tǒng)［3］。在眾多的細(xì)菌快速鑒定系統(tǒng)中，由法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)的API系統(tǒng)以其快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)而成為目前在世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣的微生物鑒別系統(tǒng)［4］。該系統(tǒng)由試劑條、添加試劑及檢索工具等配套形成完整的微生物鑒定系統(tǒng)。

微生物鑒定是藥品微生物檢驗(yàn)中的重要環(huán)節(jié)，《中國(guó)藥典》2015年版通則相應(yīng)章節(jié)中對(duì)檢出微生物的鑒定做了明確規(guī)定［5］。對(duì)受控環(huán)境收集到的微生物進(jìn)行微生物的常規(guī)特征（包括菌落形態(tài)學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、革蘭染色及一些關(guān)鍵生化反應(yīng)）進(jìn)行分析，以滿足鑒別需要［3］，微生物菌群信息有助于預(yù)期常見(jiàn)菌群，并有助于評(píng)估清潔或消毒規(guī)程、方法、清潔劑或消毒劑及微生物監(jiān)測(cè)方法的有效性，尤其當(dāng)超過(guò)監(jiān)測(cè)限度時(shí)，微生物鑒定信息有助于污染源的調(diào)査［6］。筆者在此參考《中國(guó)藥典》2015年版四部（通則9204）“微生物鑒定指導(dǎo)原則”，結(jié)合實(shí)際，借助API鑒定系統(tǒng)，對(duì)潔凈室收集到的某一微生物進(jìn)行鑒定，從而建立起微生物鑒定方法。

1　材料與方法

1.1儀器和試劑

生物安全柜（BSC-1300IIA2型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；藥品恒溫保存箱（MRR-680，廣州萬(wàn)寶特種制冷設(shè)備有限公司）。

培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板（TSA）；法國(guó)生物梅里埃公司API Staph試劑條；革蘭氏染液。

1.2菌株來(lái)源

進(jìn)入潔凈室（B級(jí)）實(shí)驗(yàn)人員戴好手套進(jìn)行表面環(huán)境菌采集，用直徑55 mm的培養(yǎng)皿對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的五指長(zhǎng)按10 s進(jìn)行取樣，最終收集到1株環(huán)境菌。

2　試驗(yàn)步驟

2.1待鑒定菌純化分離

挑取待鑒定菌，用平板劃線法將其接到TSA培養(yǎng)基平板上，于30～35℃純培養(yǎng)18～24 h，得到單一的細(xì)菌。

2.2革蘭染色及鏡檢結(jié)果

2.2.1涂片 取清潔無(wú)油的載玻片一塊，在玻片中央滴一滴純化水。以接種環(huán)挑取菌落，與水充分混勻制成薄涂片。

2.2.2干燥 玻片置于室溫自然風(fēng)干。

2.2.3固定 用火焰固定菌體于玻片上，固定時(shí)只能用微熱，使玻片迅速通過(guò)火焰，以手背接觸玻片背面，以不燙手為宜。

2.2.4染色 將甲紫染液滴加在已固定的涂片上，染1 min后純化水洗干凈；滴加革蘭碘液作用1 min，水洗后瀝干；滴加95%乙醇脫色，側(cè)動(dòng)玻片，至無(wú)紫色脫落為止（20～30 s），水洗；滴加番紅染液復(fù)染30 s～1 min，水洗，待干。

2.2.5鏡檢：已染色的玻片，自然風(fēng)干或用吸水紙輕輕印在涂抹上將水吸干。干燥后，于涂抹處滴加香柏油一滴，鏡檢所觀察的現(xiàn)象為菌體呈球狀，紫色，為革蘭氏陽(yáng)性球菌。

2.3試劑條的選擇、接種及培養(yǎng)［7］

2.3.1根據(jù)上述鏡檢結(jié)果，先進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，直接滴加數(shù)滴觸酶試劑于已分離純化的培養(yǎng)物上，立即觀察結(jié)果，結(jié)果若產(chǎn)生氣泡，則為陽(yáng)性反應(yīng)。選取API Staph試劑條（鑒別對(duì)象：葡萄球菌和微球菌），然后按該試劑條要求進(jìn)行接種。

圖1　菌種鑒定結(jié)果

2.3.2試劑條的準(zhǔn)備：準(zhǔn)備一個(gè)培養(yǎng)盒，倒入約5 ml水于盤(pán)的蜂窩小凹中，形成一個(gè)濕潤(rùn)的環(huán)境。然后記錄菌株資料于盤(pán)的邊沿部分，從包裝中取出試劑條放到盤(pán)中。接種物的制備：小心開(kāi)啟裝有對(duì)應(yīng)的懸浮液的安瓿瓶，以接種針從分離物的平板上挑取已分純單個(gè)菌落至懸浮基物中，仔細(xì)研勻以達(dá)到均一的細(xì)菌懸液。試劑條的接種：將試劑條梢向前傾斜，置吸管或PSI滴管的頭靠在杯的邊緣，避免氣泡形成。用吸管將細(xì)菌懸液加入對(duì)應(yīng)各小管。管下字母用“___”標(biāo)示則表示此管要用礦物油覆蓋，“［___］”則表示用細(xì)菌懸液充滿管道，其余小管則只加滿杯部。

2.3.3將此試劑條放置于35℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

3　結(jié)果判讀與鑒定結(jié)果［8　］

試劑條經(jīng)培養(yǎng)后，則可參考說(shuō)明表按要求向需滴加反應(yīng)試劑的管中滴入試劑，根據(jù)顏色判斷各個(gè)管為陽(yáng)性反應(yīng)或是陰性反應(yīng)，將反應(yīng)的“+”、“-”結(jié)果得出一組7位數(shù)的數(shù)碼，將數(shù)碼輸入apiweb軟件則可得出此菌種鑒定結(jié)果。根據(jù)API數(shù)碼檢索手冊(cè)中鑒定概率的說(shuō)明，%id ≥99.9為“極好的鑒定”；%id 99.8～99.0為“很好的鑒定”；%id 98.9～90.0為“好的鑒定”；%id 88.9～80.0為“可接受的鑒定”；%id 79.9以下為“低分辨率”。

如圖1所示，可以看到“有意義的分類(lèi)單位”以及“下一個(gè)分類(lèi)單位”的鑒定率分別是96.1%和2.1%，表示待鑒定菌有96.1%的可能性是表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），而只有2.1%的可能性是產(chǎn)色葡萄球菌（Staphylococcus chromogenes），前者的鑒定率達(dá)到了“%id 98.9～90.0”，屬于好的鑒定。

4　小結(jié)

微生物鑒定是藥品微生物檢驗(yàn)中的重要環(huán)節(jié)，對(duì)受控環(huán)境收集到的微生物進(jìn)行分析和鑒定，有助于對(duì)微生物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境進(jìn)行有效監(jiān)控。本文結(jié)合日常對(duì)受控環(huán)境微生物監(jiān)控的實(shí)際工作，采用多種技術(shù)手段，對(duì)進(jìn)入潔凈室（B級(jí)）實(shí)驗(yàn)人員手套進(jìn)行表面環(huán)境菌采集，最終收集到1株環(huán)境菌，并對(duì)此菌株進(jìn)行分析，從而建立起微生物實(shí)驗(yàn)室中細(xì)菌的鑒定方法與步驟。本方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、易推廣的優(yōu)點(diǎn)。

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Establishment and Exploration of identification of bacteria in microbiology laboratories

YANG Yanlan LIANG Jiawen Laboratory Center，Guangzhou Baiyunshan Tianxin Pharmaceutical CO.LTD，Guangzhou Guangdong 510300，China

【Abstract】

【中圖分類(lèi)號(hào)】R927

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1674-9316（2016）09-0116-02

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2016.09.079

作者單位：廣州白云山天心制藥股份有限公司化驗(yàn)中心，廣東 廣州510300