鄧可，楊錦芬，王騰，王虹，王煥，蘇金鋒，詹若挺

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州　510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州　510006）

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陽(yáng)春砂基于轉(zhuǎn)錄組的萜類合酶基因挖掘及一個(gè)單萜合酶基因的克隆

鄧可1，楊錦芬1，王騰1，王虹1，王煥1，蘇金鋒2，詹若挺1

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

摘要：【目的】深入挖掘陽(yáng)春砂轉(zhuǎn)錄組中揮發(fā)性萜類合酶相關(guān)基因，為全面認(rèn)識(shí)陽(yáng)春砂揮發(fā)性萜類代謝途徑和分子調(diào)控模式奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā空砬捌诠ぷ鳙@得的陽(yáng)春砂2個(gè)轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，篩選已注釋的及利用本地blast方法再注釋的萜類合成途徑的unigene；并通過(guò)對(duì)部分候選unigene的表達(dá)量與揮發(fā)性萜類化合物含量的相關(guān)性分析及生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步篩選出相關(guān)基因；采用PCR及重組載體構(gòu)建的方法克隆其中一個(gè)單萜合酶基因，并對(duì)其編碼蛋白序列進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】篩選得到10個(gè)揮發(fā)性萜類合成上游途徑相關(guān)unigene及11個(gè)下游萜類合酶基因；相關(guān)性分析證明候選基因與陽(yáng)春砂主要揮發(fā)性萜類有較強(qiáng)相關(guān)性；并成功克隆得到AvTPS1基因，其序列包含1 803 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼600個(gè)氨基酸；其編碼蛋白含有單萜合酶蛋白特有的DDXXD、RRX8W和NSE/DTE等保守基序，N端含有一段葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明AvTPS1屬于TPS-b亞家族?！窘Y(jié)論】結(jié)合轉(zhuǎn)錄組、表達(dá)譜數(shù)據(jù)的深入挖掘和與揮發(fā)性萜類化合物數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)，有效篩選出了陽(yáng)春砂多個(gè)值得后續(xù)研究的萜類合酶基因；其中對(duì)AvTPS1的克隆及生物信息學(xué)分析為后續(xù)功能鑒定提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：陽(yáng)春砂；轉(zhuǎn)錄組；萜類合酶基因；基因克隆

砂仁是芳香化濕類中藥，也是我國(guó)“四大南藥”之一，其性溫，味辛，具有化濕開(kāi)胃、溫脾止瀉、理氣安胎等功效［1］。陽(yáng)春砂Amomum villosum Lour.是砂仁的主流品種，廣東陽(yáng)春所產(chǎn)的道地藥材陽(yáng)春砂品質(zhì)最佳［2-3］。揮發(fā)油是陽(yáng)春砂芳香化濕、行氣止痛的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。道地藥材陽(yáng)春砂果實(shí)揮發(fā)油中含有豐富的揮發(fā)性萜類，主要由單萜、倍半萜及其衍生物組成，如乙酸龍腦酯、樟腦、龍腦、芳樟醇和雙環(huán)大根香葉烯等，其中乙酸龍腦酯含量最高，具有顯著的藥理活性［4-7］。因此，揮發(fā)性萜類化合物在陽(yáng)春砂藥效方面發(fā)揮著重要作用。

植物萜類的合成途徑主要分4個(gè)階段［8］：首先是異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）及其雙鍵異構(gòu)體二甲基丙烯焦磷酸（dimethylally pyrophosphate，DMAPP）的合成。其合成途徑主要有2條，即細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸（mevalonate pathway，MVA）途徑和質(zhì)體中的脫氧木酮糖-5-磷酸（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatepathway，DXP）途徑［9 -11］。IPP和DMAPP在異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（isoprenyl transferases）作用下經(jīng)頭對(duì)尾或頭對(duì)頭融合形成不同長(zhǎng)度的異戊二烯焦磷酸鏈。之后經(jīng)萜類合酶，也稱萜環(huán)化酶（terpenoid synthases/cyclases，TPS）催化環(huán)化和重排生成萜骨架。最后，細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一些酶如P450單加氧酶等對(duì)萜骨架進(jìn)行羥基化、甲基化等修飾。最終萜類產(chǎn)物的種類、產(chǎn)量和比例都受到多個(gè)關(guān)鍵酶的調(diào)控。對(duì)陽(yáng)春砂藥效成分揮發(fā)性萜類生物合成途徑及相關(guān)酶基因進(jìn)行研究，將為全面深入認(rèn)識(shí)陽(yáng)春砂揮發(fā)性萜類代謝途徑和分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本課題組前期已獲得2個(gè)陽(yáng)春砂轉(zhuǎn)錄組及相應(yīng)多個(gè)表達(dá)譜［12-13］。本研究將通過(guò)各類生物信息學(xué)方法對(duì)轉(zhuǎn)錄組及表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，初步篩選出部分陽(yáng)春砂揮發(fā)性萜類代謝途徑相關(guān)基因；并通過(guò)關(guān)聯(lián)陽(yáng)春砂基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)和對(duì)應(yīng)樣品揮發(fā)性萜類含量變化數(shù)據(jù)，更全面地發(fā)掘萜類合酶基因。另一方面，也對(duì)篩選所得的其中1個(gè)萜類合酶基因進(jìn)行克隆，并分析其編碼蛋白序列，為進(jìn)一步的基因功能鑒定和應(yīng)用于陽(yáng)春砂揮發(fā)性萜類代謝工程的研究奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1植物材料所用陽(yáng)春砂材料種植于廣州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)城校區(qū)時(shí)珍山，移栽自廣東陽(yáng)春，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)楊錦芬研究員鑒定為陽(yáng)春砂Aomomum villosum Lour.。

1.2主要試劑植物RNA提取試劑盒購(gòu)自艾德萊生物有限公司；第一鏈cDNA合成試劑盒及pLB平末端克隆載體購(gòu)自天根生化科技有限公司；高保真PrimeSTAR酶、ExTaq酶和其他PCR所需試劑、電泳所需Marker、感受態(tài)細(xì)胞及純化回收試劑盒均購(gòu)自大連寶生物有限公司；引物合成和基因測(cè)序由廣州華大基因有限公司完成。

1.3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析本課題組前期已獲得陽(yáng)春砂果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組（命名為AvD）和茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組（AvM）數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)KEGG注釋數(shù)據(jù)中揮發(fā)性萜類相關(guān)通路的unigene并篩選代表基因（基因長(zhǎng)度≥700 bp，表達(dá)量較高）。結(jié)合陽(yáng)春砂中含有的主要揮發(fā)性萜類成分相關(guān)的生物合成途徑中的酶基因，在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）中查找并下載其他物種中已鑒定的揮發(fā)性萜類合酶氨基酸序列，作為探針序列，通過(guò)本地BLAST軟件blast-2.2.30+在2個(gè)陽(yáng)春砂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中進(jìn)行blastp比對(duì)，對(duì)unigene進(jìn)行再注釋，以相似度≥40%、比對(duì)長(zhǎng)度≥100、比對(duì)分?jǐn)?shù)≥100、基因長(zhǎng)度≥1 000 bp為條件篩選出候選unigene。利用本地BLAST軟件進(jìn)行blastn比對(duì)，關(guān)聯(lián)2個(gè)轉(zhuǎn)錄組間的unigene。

1.4相關(guān)性分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件的Pearson算法對(duì)課題組前期獲得的MeJA誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)春砂揮發(fā)性萜類含量數(shù)據(jù)［13］及轉(zhuǎn)錄組AvM中候選基因的表達(dá)量進(jìn)行雙變量線性相關(guān)系數(shù)計(jì)算；所得相關(guān)系數(shù)利用R語(yǔ)言軟件包中的pheatmap軟件繪制熱圖，熱圖繪制由廣州基迪奧生物科技有限公司協(xié)助完成。

1.5AvTPS1的克隆陽(yáng)春砂葉片總RNA的提取參照艾德萊EASYspin Plus植物RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取1 μg總RNA按照天根cDNA第1鏈合成說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA第1鏈的合成。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取候選AvTPS1核酸序列，根據(jù)ORFfinder預(yù)測(cè)所得開(kāi)放閱讀框，使用Primer Premier 5軟件在5’端與3’端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物AvF1：5’-TT TTATCCCACATTTCAC-3’與AvR1：5’-GCTCCATG TAGATAGATTATC-3’，使用高保真PrimeSTAR酶通過(guò)2輪PCR從陽(yáng)春砂cDNA中克隆基因編碼區(qū)全長(zhǎng)。PCR第1輪反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃變性10 s，53.5℃退火15 s，72℃延伸10 s，35個(gè)循環(huán)；取第1輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行第2輪擴(kuò)大PCR：95℃變性10 s，53.5℃退火15 s，72℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收純化后連接到pLB平末端克隆載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，進(jìn)行抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆單菌落用于檢測(cè)和測(cè)序。

1.6生物信息學(xué)分析運(yùn)用在線工具ORFfinder進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)；使用NCBI在線工具進(jìn)行blastp比對(duì)查找并下載同源相似性較高的相似序列信息；使用本地軟件ClustalX 2.1進(jìn)行多序列比對(duì)；利用Mega 5.1軟件的Neighbor-Joining算法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。使用在線工具ProtParam對(duì)蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)；ChloroP 1.1 Server和TargetP 1.1 Server進(jìn)行亞細(xì)胞定位；ProtScale的Kyte & Doolittle算法進(jìn)行親疏水性分析。使用SWISS-MODEL Workspace在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)編碼蛋白進(jìn)行同源建模。

2　結(jié)果與分析

2.1陽(yáng)春砂揮發(fā)性萜類合成上游途徑關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄組分析DXP途徑和MVA途徑中的關(guān)鍵酶——1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatesynthase，DXS）、1-去氧-D-木酮糖-5 -磷酸還原異構(gòu)酶（1 -deoxy -D -xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGR），以及異戊烯基轉(zhuǎn)移酶中催化合成香葉基焦磷酸（GPP）與法呢基二磷酸（FPP）的香葉基二磷酸合酶（geranyl diphosphate synthase，GPPS）和法呢基二磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)PPS）是本研究重點(diǎn)關(guān)注的萜類合成上游途徑關(guān)鍵酶。萜類相關(guān)的unigene在經(jīng)MeJA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組AvM中較未經(jīng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組AvD中得到更多的注釋［13］，因此對(duì)該部分轉(zhuǎn)錄組AvM的數(shù)據(jù)進(jìn)行重點(diǎn)展示。揮發(fā)性萜類合成上游途徑在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)應(yīng)到萜類骨架生物合成途徑（terpenoid backbone biosynthesis，ko00900），該通路共注釋21個(gè)酶基因共160個(gè)unigene；其中注釋到7個(gè)HMGR，10 個(gè)DXR，30個(gè)DXS，3個(gè)GPPS和1個(gè)FPPS unigene。本研究對(duì)篩選長(zhǎng)度最長(zhǎng)、表達(dá)量較高的10個(gè)unigene進(jìn)行展示并重命名，結(jié)果見(jiàn)表1。

其中，本研究中篩選得到的AvHMGR1、AvDXR1 和AvDXS1（Unigene0057019、Unigene0056545和Unigene0077967），與課題組前期通過(guò)同源克隆3個(gè)關(guān)鍵基因AvHMGR（FJ455511.1）、AvDXR （FJ459894.1）和AvDXS（FJ455512.1）［14-17］，序列相似度分別達(dá)到99.95%、99.88%和99.57%；推測(cè)這3個(gè)unigene即對(duì)應(yīng)前期克隆所得的上述3個(gè)關(guān)鍵基因。從2個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)推測(cè)，陽(yáng)春砂基因組中有多個(gè)HMGR、DXR和DXS基因，尤其是DXS，在轉(zhuǎn)錄組AvD中注釋到60個(gè)unigene［12］，結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn)的AvDXS在多種器官中的高表達(dá)量［15］，更可確認(rèn)其具有看家基因的特性。

2.2陽(yáng)春砂揮發(fā)性萜類合酶基因的轉(zhuǎn)錄組分析

2.2.1已注釋揮發(fā)性萜類合酶相關(guān)基因的整理萜類合酶基因（TPS）為揮發(fā)性萜類合成下游途徑的關(guān)鍵酶基因，對(duì)應(yīng)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的單萜生物合成途徑（monoterpenoid biosynthesis，ko00902）及倍半萜生物合成途徑（sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis，ko00909）2個(gè)通路中。其中轉(zhuǎn)錄組AvD僅在單萜通路中注釋到1個(gè)unigene，而經(jīng)MeJA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組AvM在單萜合成通路中共注釋3個(gè)單萜合酶基因（12個(gè)unigene），在倍半萜及三萜生物合成途徑中注釋到2個(gè)三萜合酶基因（13個(gè)unigene），但并未注釋到倍半萜合成相關(guān)酶基因，故不在本文中贅述。綜合2個(gè)陽(yáng)春砂轉(zhuǎn)錄組，被直接注釋到的3個(gè)單萜酶基因分別是月桂烯/羅勒烯合酶（myrcene/ocimene synthase，MS/OS，下簡(jiǎn)稱MS）、芳樟醇合酶［（3S）-linalool synthase，LIS］和新薄荷醇脫氫酶［（+）-neomenthol dehydrogenase，NDS］基因，其中LIS與NDS為轉(zhuǎn)錄組AvM中首次被注釋到的單萜合酶基因；篩選得長(zhǎng)度最長(zhǎng)、表達(dá)量較高的10個(gè)unigene，結(jié)果表2。

表1　已注釋的陽(yáng)春砂萜類骨架合成通路候選基因整理Table 1 Data of the annotated candidate genes involved in terpenoid backbone biosynthesis pathway of A.villosum

表2　已注釋的陽(yáng)春砂單萜合成通路候選基因整理Table 2 Data of the annotated candidate genes involed in monoterpenoid biosynthesis pathway of A.villosum

2.2.2本地blast再注釋揮發(fā)性萜類合酶相關(guān)基因的整理根據(jù)本課題組對(duì)陽(yáng)春砂果實(shí)揮發(fā)性萜類的測(cè)定結(jié)果［13］，陽(yáng)春砂種子團(tuán)及果皮中含量較高的單萜有乙酸龍腦酯、樟腦、龍腦、芳樟醇、β-蒎烯、α-蒎烯、月桂烯和松油醇等；倍半萜類則以雙環(huán)大根香葉烯為主。其中芳樟醇及月桂烯合酶相關(guān)基因已被注釋（表2），本部分主要關(guān)注其他7個(gè)化合物對(duì)應(yīng)的合酶基因，包括龍腦基二磷酸合酶［（+）-bornyl diphosphate synthase，BDS］、β-蒎烯合酶［（-）-beta-pinene synthase，BPS］、α-蒎烯合酶［（-）-alpha-pinene synthase，APS］、松油烯合酶（1，8-cineole synthase，TPS-Cin）和雙環(huán)大根香葉烯合酶（bicyclogermacrene synthase，BGS）5個(gè)合酶基因。從NCBI下載上述基因序列（具體序列信息詳見(jiàn)表3），以這些序列作為探針，在轉(zhuǎn)錄組AvD 和AvM中進(jìn)行本地blast再注釋，篩選出5個(gè)合酶（包括4個(gè)單萜合酶及1個(gè)倍半萜合酶）基因共17 個(gè)unigene，轉(zhuǎn)錄組信息及比對(duì)結(jié)果如表4所示。

2.2.3候選AvTPS的確定將2.2.1和2.2.2所得的來(lái)源于不同轉(zhuǎn)錄組卻被同一單萜合酶基因注釋上的unigene進(jìn)行blastn關(guān)聯(lián)比對(duì)，部分來(lái)自于不同轉(zhuǎn)錄組被注釋的unigene具有極高的相似度，當(dāng)相似度達(dá)到99%以上、比對(duì)分?jǐn)?shù)大于1 000時(shí)，認(rèn)為這些來(lái)源于不同轉(zhuǎn)錄組的相似unigene對(duì)應(yīng)陽(yáng)春砂中的同一基因（表4）。綜合上述結(jié)果，對(duì)篩選到的揮發(fā)性萜類合酶下游基因（AvTPS）進(jìn)行重命名，確定其代表unigene（表5），以測(cè)序長(zhǎng)度較長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄組AvDunigene作為AvTPS的核酸序列參考，以檢測(cè)部位及組別較多的轉(zhuǎn)錄組AvMunigene作為AvTPS的表達(dá)量參考以供后續(xù)分析使用。

表3　陽(yáng)春砂主要成分相關(guān)酶序列下載信息Table 3 Information of enzymes related to main volatile terpenes in A.villosum

表4　再注釋的陽(yáng)春砂揮發(fā)性萜類合酶候選基因整理Table 4 Data of the reannotated candidate genes of volatile terpene synthase of A.villosum

2.3候選基因表達(dá)量與主要揮發(fā)性萜類含量相關(guān)性分析提取上述2.1和2.2篩選所得春砂的主要揮發(fā)性萜類成分含量進(jìn)行相關(guān)分析，計(jì)算得到的Pearson相關(guān)系數(shù)如圖1所示，其中AvTPS3和AvTPS4的代表unigene由于在考察組別均未能測(cè)得表達(dá)量，故不參與分析。圖1結(jié)果顯示：大部分陽(yáng)春砂候選基因與除了α-蒎烯外的陽(yáng)春砂主要揮發(fā)性萜類均表現(xiàn)出相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值大于0.6的較強(qiáng)相關(guān)性，表明篩選得到的這些陽(yáng)春砂候選基因有較大可能參與揮發(fā)性萜類的合成過(guò)程。

圖1顯示：基因表達(dá)量與化合物含量的相關(guān)模式大體分為2種：第1種是與芳樟醇、β-蒎烯等陽(yáng)春砂果皮中主要成分正相關(guān)，與乙酸龍腦酯、樟腦、雙環(huán)大根香葉烯等種子團(tuán)中的主要成分［13］負(fù)相關(guān)；第2種則與種子團(tuán)中成分正相關(guān)，與果皮主要成分負(fù)相關(guān)。在上游候選基因的相關(guān)分析中（圖1-a），與單萜合成直接相關(guān)的DXP途徑的關(guān)鍵基因AvDXR和AvDXS基本與陽(yáng)春砂果皮中的主要成分正相關(guān)，而與種子團(tuán)中主要成分負(fù)相關(guān)；而AvDXS1則與MVA途徑的關(guān)鍵基因AvHMGR一樣呈現(xiàn)第2種相關(guān)模式；不僅印證了陽(yáng)春砂內(nèi)含有多個(gè)DXS基因的猜想，同時(shí)體現(xiàn)出，這2個(gè)途徑在陽(yáng)春砂果實(shí)不同部位中參與不同有效成分的合成。而在TPS候選基因的相關(guān)性分析（圖1-b）顯示：不同的AvTPS基因呈現(xiàn)出不一樣的相關(guān)模式，如果根據(jù)相關(guān)模式劃分，則相同模式的AvTPS5與AvTPS9、或AvTPS6與AvTPS11可能含有相似功能。

表5　AvTPS的命名與代表unigene的確定Table 5 AvTPS name and the candidate unigenes data

圖1　候選基因表達(dá)量與主要揮發(fā)性萜類含量相關(guān)系數(shù)熱圖Figure 1 Heat map of the correlation coefficient of candidate unigenes expression levels and main volatile terpene contents

2.4AvTPS1克隆及編碼蛋白序列分析根據(jù)AvTPS1（轉(zhuǎn)錄組Unigene0137026）的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，以陽(yáng)春砂葉片cDNA為模板，克隆AvTPS1含全長(zhǎng)ORF DNA片段；測(cè)序結(jié)果顯示：克隆所得的AvTPS1全長(zhǎng)cDNA共1 881 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)? 803 bp，編碼600個(gè)氨基酸，所得氨基酸序列與Unigene0137026的預(yù)測(cè)氨基酸序列一致。

AvTPS1編碼蛋白（以下簡(jiǎn)稱AvTPS1）預(yù)測(cè)分子量為68.92 kDa，等電點(diǎn)為5.56，分子式為C3086H4776N840O914S21，與已有的TPS蛋白序列性質(zhì)相似。經(jīng)ChloroP及TargetP預(yù)測(cè)，AvTPS1編碼蛋白N端含有一段葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)肽，信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)在42號(hào)位；而AvTPS1多肽鏈中親水區(qū)域大于疏水區(qū)域，預(yù)測(cè)該蛋白屬于親水性蛋白。利用SWISS-MODEL Workspace對(duì)AvTPS1進(jìn)行同源建模，與來(lái)源于留蘭香（Menthaspicata）的4S-檸檬烯合酶［20］及來(lái)源于鼠尾草（Salvia officinalis）的（+）-龍腦基二磷酸合酶［21］同源相似性分別為41.26%及42.96%，具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)與功能區(qū)。

取AvTPS1序列進(jìn)行NCBI blastp比對(duì)，比對(duì)上大量單萜或倍半萜合酶基因，其中與姜花葉綠體單萜合酶基因同源相似度最高，達(dá)到87%；選取相似度大于50%的序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)AvTPS1氨基酸序列中含有多個(gè)已知萜類合酶序列的保守模體（conserved motifs），如RRX8W、RXR、DDXXD和NSE/DTE［即（N，D）D（l，I，V）X（S，T）XXXE］，如圖2所示。其中，天冬氨酸富集區(qū)DDXXD和NSE/DTE這2個(gè)保守區(qū)，通過(guò)與金屬離子（如Mg2+和Mn2+）的絡(luò)合來(lái)結(jié)合催化底物（GPP等），是單萜、倍半萜以及二萜合成酶所屬的離子化依賴的萜類合酶共有的功能結(jié)構(gòu)域［22-23］；精氨酸保守區(qū)RRX8W能通過(guò)異構(gòu)作用間接催化生成環(huán)狀萜類［20］；而RXR區(qū)域則可能參與萜品烯的催化反應(yīng)［24］。這些保守模體的分析，更提示AvTPS1極有可能參與揮發(fā)性萜類的合成。

圖2　AvTPS1相似序列比對(duì)及功能結(jié)構(gòu)域展示Figure 2 Similar sequence alignment and functional domain of AvTPS1

將AvTPS1與已發(fā)表的植物萜類合酶氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3中涉及的TPS亞家族的劃分參照Chen等［25］在2011年劃分的新標(biāo)準(zhǔn)，分為T(mén)PS-a～TPS-h 7個(gè)亞家族，其中TPS-h亞家族未在圖中展示。圖3顯示：?jiǎn)屋萍氨栋胼坪厦付嗉杏赥PS-b、a、g和d 4個(gè)亞家族；而AvTPS1所在的TPS-b亞家族不僅是被子植物中顯花植物特有的家族，也是單萜合酶基因特有的亞家族，該家族的單萜合酶主要用于催化環(huán)狀單萜的合成［18，25］。

圖3　AvTPS1與其他已知萜類合酶（TPS）的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Figure 3 Phylogenetic analysis of AvTPS1 and other known terpene synthases

3　討論

本研究對(duì)陽(yáng)春砂轉(zhuǎn)錄組中陽(yáng)春砂揮發(fā)性萜類合成途徑相關(guān)基因進(jìn)行了深入挖掘，對(duì)已注釋到的揮發(fā)性萜類合成相關(guān)KEGG通路中的unigene進(jìn)行了提取和篩選，共獲得10個(gè)上游途徑候選unigene 和11個(gè)下游途徑合酶候選unigene，對(duì)已注釋基因的挖掘是目前在無(wú)參轉(zhuǎn)錄組中尋找目的基因的最常用方法［26］。但在陽(yáng)春砂轉(zhuǎn)錄組中，僅被注釋上3個(gè)下游的單萜合酶基因，同時(shí)還存在大量的未注釋基因，這些未被注釋的unigene可能包含陽(yáng)春砂中特異表達(dá)的功能基因［27］。所以利用本地blast反向比對(duì)的方法對(duì)陽(yáng)春砂轉(zhuǎn)錄組中的基因進(jìn)行再注釋，得到多個(gè)萜類合酶相關(guān)的17個(gè)再注釋unigene，后續(xù)的相關(guān)性分析和生物信息學(xué)分析也證明了這些unigene與萜類合成相關(guān)，從而驗(yàn)證了該方法的有效性。

在進(jìn)行本地blast再注釋的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，不同的探針序列會(huì)對(duì)相同的unigene進(jìn)行注釋，如表4 中Unigene0137026、Unigene0107445等unigene能同時(shí)被BDS、BPS、TPS-cin注釋上。推測(cè)原因有二：①是由于TPS酶和底物多樣性的特點(diǎn)［28］，很多萜類合酶能催化生成多種產(chǎn)物，如從鼠尾草中分離的龍腦基二磷酸合酶，除了生成（+）-龍腦基焦磷酸外，還能生成大量的（+）-α-蒎烯，（+）-莰烯和（±）-檸檬烯，同時(shí)具有龍腦二磷酸合酶和蒎烯合酶的功能［29］。②被子植物TPS的系統(tǒng)發(fā)育和譜系分化與植物自然分類系統(tǒng)聯(lián)系更密切，相同物種來(lái)源的TPS相似性遠(yuǎn)高于功能相同而來(lái)源不同的TPS，所以基于序列相似性的查找僅可以判斷其是否萜類合酶，卻不能預(yù)測(cè)其產(chǎn)物［18-19］，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)功能驗(yàn)證。萜類合酶基因在植物中多以基因家族的形式存在［30］，所以在unigene間關(guān)聯(lián)比對(duì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)篩選得到的候選基因中存在不少序列相似的unigene，這些unigene可能是一個(gè)基因家族中的不同成員，是同一萜類合酶的不同剪接，在陽(yáng)春砂中行使相似的功能。

本研究中無(wú)論是基因表達(dá)量與揮發(fā)性萜類含量的相關(guān)性分析，還是對(duì)克隆基因AvTPS1的生物信息學(xué)分析，均只是功能預(yù)測(cè)；但基因表達(dá)與化合物的生成中間還要經(jīng)過(guò)蛋白、激素等多方面調(diào)控，并非簡(jiǎn)單的線性相關(guān)關(guān)系，還須對(duì)候選基因進(jìn)行基于原核或真核的表達(dá)功能的功能鑒定。本課題組后續(xù)將克隆本研究篩選到的其他AvTPS，并通過(guò)基于原核和真核表達(dá)系統(tǒng)的功能鑒定，進(jìn)一步確認(rèn)AvTPS的催化功能及其在揮發(fā)性萜類合成過(guò)程中的作用。

參考文獻(xiàn)：

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

［2］丁平，劉軍民，徐鴻華.商品砂仁的質(zhì)量評(píng)析［J］.中國(guó)中藥雜志，2002，27（10）：786.

［3］陳蔚文，徐鴻華.嶺南道地藥材研究［M］.廣州：廣東科技出版社，2007.

［4］余競(jìng)光，孫蘭，周立東，等.中藥砂仁化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)中藥雜志，1997，22（4）：39.

［5］丁平，杜景峰，魏剛，等.砂仁與長(zhǎng)序砂仁揮發(fā)油化學(xué)成分的研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2001，36（4）：19.

［6］吳曉松，李曉光，肖飛.砂仁揮發(fā)油中乙酸龍腦酯鎮(zhèn)痛抗炎作用的研究［J］.中藥材，2004，27（6）：438.

［7］胡玉蘭，張忠義，林敬明.中藥砂仁的化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展［J］.中藥材，2005，28（1）：72.

［8］Kumari S，Priya P，Misra G .Structural and biochemical perspectives in plant isoprenoid biosynthesis［J］.Phytochem Rev，2013，12（2）：255.

［9］張長(zhǎng)波，孫紅霞，鞏中軍，等.植物萜類化合物的天然合成途徑及其相關(guān)合酶［J］.植物生理學(xué)通訊，2007，43（4）：779.

［10］Rohmer M.From molecular fossils of bacterial hopanoids to the formation of isoprene units：discovery and elucidation of the methylerythritol phosphate pathway［J］.Lipids，2008，43（12）：1095.

［11］Bouwmeester H J.Engineering the essence of plants［J］.Nat Biotechnol，2006，24（11）：1359.

［12］于安民.基于RNA-Seq的陽(yáng)春砂果實(shí)發(fā)育過(guò)程中糖和萜類代謝的研究［D］.廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

［13］王煥，楊錦芬，鄧可，等.茉莉酸甲酯影響陽(yáng)春砂揮發(fā)性萜類代謝和基因轉(zhuǎn)錄［J］.世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2014 （7）：1528.

［14］楊錦芬.陽(yáng)春砂萜類成分生物合成上游功能基因的克隆及表達(dá)分析［D］.廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2008.

［15］Yang J，Adhikari M N，Liu H，et al.Characterization and functional analysis of the genes encoding 1-deoxy-D-xylulose-5 -phosphate reductoisomerase and 1 -deoxy -D -xylulose -5 -phosphate synthase，the two enzymes in the MEP pathway，from Amomum villosum Lour.［J］.Mol Biol Rep，2012，39（8）：8287.

［16］魏潔書(shū).基于陽(yáng)春砂HMGR和DXR基因的萜類化合物生物合成調(diào)控研究［D］.廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

［17］魏潔書(shū)，楊錦芬，凌敏，等.茉莉酸甲酯調(diào)控陽(yáng)春砂HMGR、DXR和DXS基因表達(dá)［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，30 （1）：88.

［18］Bohlmann J，Meyer -Gauen G，Croteau R.Plant terpenoid synthases：molecular biology and phylogenetic analysis［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95（8）：4126.

［19］徐應(yīng)文，呂季娟，吳衛(wèi)，等.植物單萜合酶研究進(jìn)展［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，29（6）：3188.

［20］Hyatt D C，Youn B，Zhao Y，et al.Structure of limonene synthase，a simple model for terpenoid cyclase catalysis［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104（13）：5360.

［21］Whittington D A，Wise M L，Urbansky M，et al.Bornyl diphosphate synthase：structure and strategy for carbocation manipulation by a terpenoid cyclase［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99（24）：15375.

［22］Christianson D W.Structural biology and chemistry of the terpenoid cyclases［J］.Chem Rev，2006，106（8）：3412.

［23］Oldfield E，Lin F Y.Terpene biosynthesis：modularity rules ［J］.Angew Chem Int Ed Engl，2012，51（5）：1124.

［24］Aubourg S，Lecharny A，Bohlmann J.Genomic analysis of the terpenoid synthase（AtTPS）gene family of Arabidopsis thaliana ［J］.Mol Genet Genomics，2002，267（6）：730.

［25］Chen F，Tholl D，Bohlmann J，et al.The family of terpene synthases in plants：a mid-size family of genes for specialized metabolism that is highly diversified throughout the kingdom［J］.Plant J，2011，66（1）：212.

［26］郭溆.基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的石斛生物堿和人參皂苷生物合成相關(guān)基因的發(fā)掘、克隆及鑒定［D］.北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2013.

［27］Galata M，Sarker L S，Mahmoud S S.Transcriptome profiling，and cloning and characterization of the main monoterpene synthases of Coriandrum sativum L［J］.Phytochemistry，2014，102：64.

［28］Tholl D.Terpene synthases and the regulation，diversity and biological roles of terpene metabolism［J］.Curr Opin Plant Biol，2006，9（3）：297.

［29］Wise M L，Savage T J，Katahira E，et al.Monoterpene synthases from common sage（Salvia officinalis）.cDNA isolation，characterization，and functional expression of（+）-sabinene synthase，1，8-cineole synthase，and（+）-bornyl diphosphate synthase［J］.J Biol Chem，1998，273（24）：14891.

［30］李路路，王歡，孫明，等.岷江百合單萜合酶基因克隆與表達(dá)分析［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014（4）：397.

【責(zé)任編輯：黃玲】

Mining of Genes Involved in Terpenoid Synthases Based on Transcriptome Analysis and Cloning of Monoterpene Synthase from Amomum villosum Lour.

DENG Ke1，YANG Jinfen1，WANG Teng1，WANG Hong1，WANG Huan1，SU Jinfeng2，ZHAN Ruoting1
（1.Research Center of Chinese Medicinal Resource Science and Engineering，Ministry of Education Key Laboratory of Chinese Medicinal Resources from Lingnan，Joint Laboratory of National Engineering Research Center for the Pharmaceutics of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；2.School of Chinese Herbal Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

Abstract：Objective To dig out the related volatile terpene synthase genes from transcriptome of Amomum villosum Lour.，so as to lay the foundation for comprehensive understanding of volatile terpenoid biosynthesispathway and molecular regulation mode.Methods Based on the obtained results of the two transcriptome of Amomum villosum Lour.，we screened out the unigenes involved in volatile terpenoid biosynthesis pathway which had been annotated or was reannotated by blast method.After analyzing the correlation of the expression of partial candidate unigenes with the contents of volatile terpenoids and their bioinformatics，we selected out the relative unigenes.One monoterpene synthase gene of them was cloned by polymerase chain reaction（PCR）and recombinant vector construction methods，and then the protein coding sequences of the monoterpene synthase gene were analyzed.Results Ten candidate terpenoid biosynthesis upstream pathway unigenes and 11 candidate downstream pathway genes were obtained from the transcriptome of Amomum villosum Lour..The data proved that the expression of the candidate genes had a strong relationship with main volatile terpenes of Amomum villosum Lour..AvTPS1 had been cloned successfully，which contained 1 803 bp open reading frame（ORF），encoding 600 amino acids.The encoded protein of AvTPS1 contained the specific conservative sequences DDXXD，RRX8W and NSE/DTE which were special for terpene synthase protein，and N-terminal of the encoded protein had a chloroplast transit peptide.Phylogenetic analysis showed that AvTPS1 belonged to the subfamily of TPS-b terpene synthase.Conclusion Based on the results of transcriptome and gene expression profile of Amomum villosum Lour.，and on the correlation of gene expression profile with the content of volatile terpenoids，we found out several valuable candidate terpene synthases genes from Amomum villosum Lour..And the analysis results of clone and bioinformatics of AvTPS1 will supply evidence for the future study of gene function characterization.

Key words：Amomum villosum Lour.；transcriptome；terpene synthases gene；gene clone

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-3213（2016）03 - 0395 - 09

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03.026

收稿日期：2015-12-21

作者簡(jiǎn)介：鄧可（1991-），女，碩士研究生；E-mail：745074686@qq.com

通訊作者：楊錦芬（1978-），女，研究員；E-mail：yangif@gzucm.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81303163）；廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：Yq2013042）；廣州中醫(yī)藥大學(xué)青年英才培養(yǎng)項(xiàng)目（編號(hào)：AAC414124A08）