招鉅泉馬均寶劉紅軍

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超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因分型特點(diǎn)及其對(duì)抗生素敏感性分析

招鉅泉1馬均寶2劉紅軍3

【摘要】目的 探討超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的基因分型特點(diǎn)及其對(duì)抗生素的敏感性。方法 選取2014年8月至2015年8月從佛山市南海區(qū)第四人民醫(yī)院收治的不同住院患者，及其不同部位有效分離出來(lái)的大腸埃希菌100株和肺炎雷伯菌150株，對(duì)所有菌株實(shí)施科學(xué)化的分離與鑒定，然后采用紙片擴(kuò)散的藥敏實(shí)驗(yàn)方式來(lái)明確超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的基因分型情況，觀察所有菌株對(duì)抗生素藥物的敏感情況。結(jié)果 從大腸埃希菌100株和肺炎雷伯菌150株中確認(rèn)出來(lái)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株有120株，其中40株大腸埃希菌中攜帶TEM型基因占45%，80株肺炎克雷伯菌單獨(dú)攜帶有TEM 型β-內(nèi)酰胺酶基因占25%。此外，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌對(duì)于頭孢菌素類以及青霉素類抗生素的實(shí)際敏感性為0%～40%。結(jié)論 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的基因分型以TEM型為主，且具有相對(duì)較強(qiáng)的耐藥性。

【關(guān)鍵詞】超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；基因分型；抗生素；敏感性

1佛山市南海區(qū)第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東佛山 528200

2佛山市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東佛山 528000

3廣州達(dá)安臨床檢驗(yàn)中心有限公司實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510000

現(xiàn)階段，大腸埃希菌以及肺炎克雷伯菌屬于臨床上比較常見的病菌，從某種程度上講也是醫(yī)院感染科比較常見的致病菌［1］。目前，隨著頭孢菌素在臨床中的廣泛使用，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌與大腸埃希菌的感染情況也越來(lái)越嚴(yán)重，這是β-內(nèi)酰胺類型抗生素產(chǎn)生耐藥性的重要原因之一。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶主要是由質(zhì)粒介導(dǎo)，非常容易在同一種屬或者是不同種屬之間的細(xì)菌進(jìn)行傳遞，進(jìn)而形成暴發(fā)流行，最終給治療帶來(lái)困難，包括患者的病死率不斷增高、住院時(shí)間日益延長(zhǎng)、治療費(fèi)用上升以及治療過程中的選擇性不斷狹窄等［2］。而且，隨著新型抗生素在臨床中的應(yīng)用，相關(guān)人員更應(yīng)該對(duì)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶抗生素的敏感性實(shí)施科學(xué)化分析研究［3］。為探討超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的基因分型特點(diǎn)及其對(duì)抗生素的敏感性，本研究選取2014年8月至2015年8月我院收治的不同住院患者及其不同部位有效分離出來(lái)的大腸埃希菌100株和肺炎雷伯菌150株，并將其作為分析研究對(duì)象，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年8月至2015年8月我院收治的不同住院患者及其不同部位有效分離出來(lái)的大腸埃希菌100株和肺炎雷伯菌150株，對(duì)研究中的所有菌株采用常規(guī)方法以及板條進(jìn)行科學(xué)化鑒定，具體質(zhì)控菌株是大腸埃希菌，型號(hào)為ATCC25922。

1.2 方法

1.2.1 紙片擴(kuò)散法實(shí)施藥敏實(shí)驗(yàn) 借助雙紙片協(xié)同試驗(yàn)方法進(jìn)行初篩，具體操作方法是將阿莫西林棒酸紙片放置于培養(yǎng)皿中央，然后在其周圍20 mm位置貼上頭孢他啶紙片、頭孢噻肟紙片、頭孢曲松紙片以及氨曲南紙片。抗生素紙片均購(gòu)于Ox-oid有限公司，在35 ℃條件下科學(xué)培養(yǎng)18 h，當(dāng)阿莫西林棒酸紙片以及周圍其他紙片之間出現(xiàn)協(xié)同性抑菌作用時(shí)，則可初篩診斷為超廣譜β-內(nèi)酰胺酶呈現(xiàn)為陽(yáng)性。初篩實(shí)驗(yàn)完成后，再采用濃度梯度方法進(jìn)行確認(rèn)，采用瑞士公司提供的標(biāo)準(zhǔn)化Etest（E試驗(yàn)）試條，根據(jù)規(guī)范化方法進(jìn)行操作。Etest試條主要包括含有或不含有棒酸的氨曲南藥物成分、頭孢他啶藥物成分以及頭孢噻肟藥物成分，其中棒酸可以使最小抑菌濃度（MIC）下降約8倍以上，可以診斷為ESBLs呈現(xiàn)為陽(yáng)性。

1.2.2 核型的檢測(cè)方法與電泳檢測(cè)方法 采用美國(guó)公司提供的相關(guān)檢測(cè)工具，該檢測(cè)過程主要包括菌細(xì)胞的溶解、菌株DNA片段在凝膠電泳方面的分離、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ對(duì)細(xì)菌DNA專業(yè)化的酶切情況，以及將大腸桿菌與肺炎肺炎雷伯菌rRNA所操縱的DNA探針和所分離出來(lái)的DNA片段之間的雜交情況。嚴(yán)格根據(jù)DNA具體位置以及強(qiáng)度實(shí)施自動(dòng)化核型分析與比較。如果相似系數(shù)≥0.93，則可判定為相同核型。在脈沖場(chǎng)的凝膠電泳檢測(cè)方法中采用限制性內(nèi)切酶類型SpeⅠ的消化細(xì)菌DNA，然后利用濃度為1%的瓊脂糖凝膠在CHEF-DRⅡ型電泳儀上實(shí)施檢測(cè)。脈沖時(shí)間控制在5～60 s，溫度13 ℃，電壓200 V，實(shí)際電泳時(shí)間控制在23 h，比較每一菌株在電泳條帶上的變化情況，當(dāng)3條以上電泳帶存在差異時(shí)，則可認(rèn)為是不同分型；當(dāng)1～3條條帶存在差異時(shí)，可認(rèn)為是不同亞型。在β-內(nèi)酰胺酶的制備過程中，需要將細(xì)菌接種于5 ml胰大豆液中進(jìn)行過夜培養(yǎng)，然后再選取劑量為0.5 ml，并稀釋至為9.5 ml相對(duì)新鮮的胰大豆液中，在37 ℃條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)約5 h，確保離心收集的細(xì)胞懸浮于250 μl 0.2 mol/L pH值為5.5的醋酸鈉中，將干冰和37 ℃的水進(jìn)行反復(fù)凍融，冰浴約30 min，收集上清β-內(nèi)酰胺酶粗提物，-37 ℃保存，將其作為電聚焦的電泳樣品。電聚焦電泳檢測(cè)過程，需要在含有兩性的電解質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化聚丙烯酰胺的凝膠上實(shí)施，其兩性電解質(zhì)pH在3.5～9.5、5.5～8.5以及4.0～6.5，并采用已知等電點(diǎn)值進(jìn)行判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的實(shí)際基因分型特征以及對(duì)抗生素的實(shí)際敏感性。

2 結(jié)果

2.1 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶檢出情況 經(jīng)過紙片擴(kuò)散法從大腸埃希菌100株和肺炎雷伯菌150株中確認(rèn)出來(lái)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株有120株，其中包括大腸埃希菌40株和肺炎雷伯菌80株，得出大腸埃希菌的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶實(shí)際檢出率為40.0%，而肺炎雷伯菌的實(shí)際檢出率為53.3%；不同標(biāo)本所進(jìn)行分離出來(lái)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌存在差異性。120株超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株中，呼吸科檢出56例（46.7%），重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）檢出30例（25.0%），老年科檢出25例（20.8%），燒傷科檢出9例（7.5%），不同科室的分離情況存在差異性。這種情況可能與抗生素應(yīng)用情況有著密切關(guān)系。

2.2 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因分型情況 從基因分型情況上進(jìn)行分析，40株大腸埃希菌中，單獨(dú)攜帶有TEM型β-內(nèi)酰胺酶基因有18株（45.0%），單獨(dú)攜帶SHV型基因有3株（7.5%），同時(shí)攜帶SHVB-內(nèi)酰胺酶基因基因與TEM型基因的有19株（47.5%）。80株肺炎克雷伯菌基因分型中，單獨(dú)攜帶有TEM型β-內(nèi)酰胺酶基因有20株（25.0%），單獨(dú)攜帶SHV型β-內(nèi)酰胺酶基因有8株（10.0%），同時(shí)攜帶SHV型基因以及TEM型基因的β-內(nèi)酰胺酶基因有52株（65.0%）。

2.3 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶對(duì)抗生素藥物的敏感性情況 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌對(duì)于頭孢菌素類以及青霉素類的實(shí)際敏感性為0%～40%。青霉素類與頭孢菌素類以及加酶抑制劑之間的合劑對(duì)于超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的實(shí)際效果好于未加酶抑制劑的實(shí)際效果，而且哌拉西林他唑巴坦以及頭孢哌酮舒巴坦的抗生素敏感性相對(duì)較高，均＞30%。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌對(duì)于亞胺培南、美羅培南以及多黏菌素B的敏感性均為100.00%，對(duì)于頭孢唑林、哌拉西林以及頭孢噻肟的敏感性均為0.00%。拉氧頭孢以及頭孢西丁的敏感性也相對(duì)較高，分別為78.03%以及68.25%，見表1。

表1 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶對(duì)抗生素的敏感性情況（%）

3 討論

現(xiàn)階段，從某種程度上講，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的出現(xiàn)屬于第3代頭孢菌素最終選擇的結(jié)果，其中肺炎克雷伯菌以及大腸埃希菌屬于比較典型的代表菌，而且不同國(guó)家以及地區(qū)之間因抗生素使用情況的差異（使用種類以及數(shù)量）而不同，其基因分型也存在較大差異［4］。一般情況下，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌雖然會(huì)對(duì)頭孢類抗生素具有較強(qiáng)耐藥性，盡管個(gè)別細(xì)菌體外試驗(yàn)相對(duì)敏感，但體內(nèi)治療效果卻不明顯［5］。此外，因細(xì)菌所攜帶的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌質(zhì)粒能夠同時(shí)攜帶喹諾酮類、氨基糖甙類以及磺胺類等藥物的耐藥基因，所以可以使超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌存在多種耐藥表型［6］。在基因分型方面，核型分析屬于自動(dòng)過程，操作方法相對(duì)簡(jiǎn)單、快捷，但是因所反映rRNA基因的相關(guān)區(qū)域酶切位點(diǎn)出現(xiàn)改變，且分辨率較低，所以只能進(jìn)行初步分型，尤其是對(duì)于分型情況存在差異者，可以做出流行病學(xué)的不相關(guān)結(jié)論，核型相同的情況下需要進(jìn)行脈沖場(chǎng)的凝膠電泳分型，其分辨率較高，能夠反映基因相關(guān)性，效果顯著［7］?？傊?，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌具有較強(qiáng)耐藥性，且耐抗生素的種類相對(duì)較多，在臨床上應(yīng)高度重視超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的檢測(cè)以及監(jiān)測(cè)，避免引起醫(yī)院大面積的流行感染。

本研究中，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌具有較強(qiáng)的多重耐藥性，而且超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌以及大腸埃希菌均攜帶了不同程度上的SHV型和TEM型β-內(nèi)酰胺酶基因，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌對(duì)于頭孢菌素類以及青霉素類抗生素的實(shí)際敏感率性為0%～40%。針對(duì)所需研究的第一亞群情況對(duì)β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌情況進(jìn)行基因分型調(diào)查，所分離出的β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌菌株以及攜帶有TEM型的β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌菌株情況與郭小兵等［1］研究的菌株類型相比較具有一致性，然而不同基因分型情況所占比率有較大差異［8］。說明超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的基因分型以TEM型為主，且具有相對(duì)較強(qiáng)的耐藥性。

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【中圖分類號(hào)】R446.5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.05.088

作者簡(jiǎn)介：招鉅泉（1964.03-），大專學(xué)歷，副主任檢驗(yàn)師。主要從事微生物學(xué)方向的研究