張占卿, 陸 偉, 王雁冰, 翁齊鋮, 張智勇, 周新蘭

(1. 上海市公共衛(wèi)生臨床中心肝炎二科，上海 201508； 2. 日本富士瑞必歐株式會社上海代表處，上海 200336)

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·基礎(chǔ)研究·

血清乙型肝炎核心相關(guān)抗原陰性正常參考值的探討

張占卿1, 陸 偉1, 王雁冰1, 翁齊鋮2, 張智勇2, 周新蘭1

(1. 上海市公共衛(wèi)生臨床中心肝炎二科，上海 201508； 2. 日本富士瑞必歐株式會社上海代表處，上海 200336)

目的 探討血清HBcrAg合理的陰性正常參考值。方法 初治的乙型肝炎患者230例和非乙型肝炎患者52例入選本研究。血清HBcrAg采用化學(xué)發(fā)光酶免疫法和Fujirebio Lumipulse G1200全自動化學(xué)發(fā)光免疫系統(tǒng)檢測。數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0軟件。結(jié)果 血清HBcrAg呈非正態(tài)分布(P<0.01)。HBsAg陽性患者血清HBcrAg與HBV DNA呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。血清HBcrAg診斷HBsAg陽性患者的ROC曲線下面積(0.953)顯著大于對角參考線下面積(P<0.01)。當(dāng)血清HBcrAg≥1500U/ml、≥1250U/ml、≥1000U/ml、≥750U/ml、≥500U/ml時，其診斷HBsAg陽性患者的靈敏度和特異度分別為0.865和0.981、0.865和0.962、0.870和0.923、0.896和0.904、0.909和0.885。結(jié)論 血清HBcrAg<1000U/ml可能是合理的陰性正常參考值。

乙型肝炎核心相關(guān)抗原； 化學(xué)發(fā)光酶免疫法； 正常參考值

乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen, HBcAg)僅存在于完整的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)顆粒，HBV裂解釋放的HBcAg極易與血液中預(yù)存的抗-HBc結(jié)合，因此，檢測血清HBcAg的試劑至今未能面世。乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)和HBcAg均由HBV前C/C基因編碼，其一級結(jié)構(gòu)高度同源。Kimura等[1]和Rokuhara等[2]先后開發(fā)和發(fā)展了檢測血清乙型肝炎核心相關(guān)抗原(hepatitis B core-related antigen, HBcrAg)即變性開解為一級結(jié)構(gòu)的HBeAg和HBcAg的EIA(Enzyme immunoassay)和CLEIA(chemiluminescence enzyme immunoassay)試劑；隨后，Kimura等[3]發(fā)現(xiàn)，CLEIA檢測的血清HBcrAg不僅包括HBeAg和HBcAg，而且涵蓋HBeAg形成前的中間產(chǎn)物P22cr蛋白。血清HBcrAg的計量單位為U/ml，以大腸埃希菌表達(dá)的重組前體HBeAg(pro-HBeAg)為標(biāo)準(zhǔn)，與前體HBeAg 10fg/ml相對應(yīng)的HBcrAg的免疫反應(yīng)被定義為1U/ml[1-2]。雖然血清HBcrAg的臨床價值正逐步被評價[4-9]，但其陰性正常參考值尚未被進(jìn)一步研究。確定血清HBcrAg陰性正常參考值是進(jìn)一步合理評價其應(yīng)用潛能的一個前提條件。本研究就230例乙型肝炎和52例非乙型肝炎肝病患者血清HBcrAg檢測的結(jié)果，與血清HBV DNA比較，采用受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線法，探討血清HBcrAg合理的陰性正常參考值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2012年1月至2014年12月在上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心住院的初治肝病患者282例，其中乙型肝炎230例，包括急性乙型肝炎8例，慢性乙型肝炎222例；非乙型肝炎52例，包括慢性丙型肝炎14例，非酒精性脂肪肝5例，原因不明肝炎33例。診斷符合中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會、感染病學(xué)分會《慢性乙型肝炎防治指南(2010版)》，中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會、傳染病與寄生蟲病學(xué)分會《丙型肝炎防治指南》，中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會《非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂)》中的標(biāo)準(zhǔn)。HBsAg陽性且HBeAg陽性患者中，男95例，女41例，男∶女 = 2.32∶1；年齡10～66歲，平均(33.90±10.08)歲；HBsAg陽性但HBeAg陰性患者中，男57例，女37例，男∶女= 1.54∶1；年齡17～63歲，平均(41.79±11.28)歲；HBsAg陰性且抗-HBc陰性患者中，男16例，女10例，男∶女 = 1.60∶1；年齡18～86歲，平均(44.27±17.95)歲；HBsAg陰性但抗-HBc陽性患者中，男12例，女14例，男∶女 = 0.86∶1；年齡28～72歲，平均(49.81±12.32)歲，見表1。

表1 282例肝病患者的診斷、血清HBV標(biāo)記物及HBV DNA載量

1.2 血清HBcrAg和HBsAg、HBeAg、HBV DNA檢測

早晨空腹采集靜脈血，分離血清，-40℃凍存。血標(biāo)本留用得到了上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心倫理委員會的批準(zhǔn)。血清HBcrAg采用化學(xué)發(fā)光酶免疫法(sensitive chemiluminescence enzyme immunoassay, CLEIA)和Fujirebio Lumip-ulse G1200全自動化學(xué)發(fā)光免疫系統(tǒng)檢測，試劑由Fujirebio株式會社提供，批準(zhǔn)文號： SAX5031(日本)，檢測上限為107IU/ml，如超過檢測上限，則血清作10倍稀釋后重新檢測。血清HBsAg和HBeAg采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法(chemiluminescence microparticle imuno-assay, CMIA)和Abbott Architect I2000全自動化學(xué)發(fā)光免疫系統(tǒng)及其配套試劑檢測，正常參考值分別為<0.05IU/ml和<1.0 S/CO；其中HBsAg檢測上限為250IU/ml，如超過檢測上限，則血清作500倍稀釋后重新檢測。血清HBV DNA采用Bio-Rad Icycler熒光定量PCR儀檢測，試劑購自深圳匹基生物工程有限公司，檢測范圍5×102～5×107IU/ml。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0軟件。血清HBcrAg和HBV DNA的正態(tài)性檢驗采用單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗。HBsAg陽性患者血清HBcrAg與HBV DNA之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。血清HBcrAg和HBV DNA在血清HBV標(biāo)記物不同表達(dá)模式患者之間的差異比較采用Mann-WhitneyU檢驗。血清HBcrAg和HBV DNA陰性正常參考值的確定采用ROC曲線法，根據(jù)ROC曲線確定血清HBcrAg和HBV DNA鑒別HBV感染狀態(tài)的最佳截斷值，計算基于最佳截斷值的診斷參數(shù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HBsAg陽性患者血清HBcrAg和HBV DNA的分布特征

血清HBcrAg和HBV DNA均表現(xiàn)為非正態(tài)分布(Z= 2.451和Z=2.391,P均<0.01)，見圖1。采用Blom、Tukey、Rankit、Waerden 4種方法進(jìn)行正態(tài)性秩轉(zhuǎn)換，血清HBcrAg和HBV DNA仍表現(xiàn)為非正態(tài)分布(Z=2.575和Z=2.078、Z=2.575和Z=2.079、Z=2.573和Z=2.073、Z=2.581和Z=2.088,P均<0.01)。

2.2 HBsAg陽性患者血清HBcrAg與HBV DNA之間的相關(guān)性

HBsAg陽性且HBeAg陽性和HBsAg陽性但HBeAg陰性患者，血清HBcrAg與HBV DNA均呈顯著正相關(guān)(r=0.597,P<0.01和r=0.675,P<0.01)；HBsAg陽性患者，血清HBcrAg與HBV DNA呈顯著正相關(guān)(r=0.787,P<0.01)。

2.3 血清HBcrAg和HBV DNA鑒別HBsAg與HBsAg陰性患者的ROC曲線

分別以HBsAg陰性且抗-HBc陰性、HBsAg陰性但抗-HBc陽性、HBsAg陰性為對照，血清HBcrAg和HBV DNA診斷HBsAg陽性且HBeAg陽性、HBsAg陽性但HBeAg陰性、HBsAg陽性患者的ROC曲線下面積均顯著大于對角參考線下面積(P均<0.01)，并且血清HBcrAg與HBV DNA診斷HBsAg陽性且HBeAg陽性、HBsAg陽性但HBeAg陰性、HBsAg陽性患者的ROC曲線下面積之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表2～4，圖1A～C。

基于HBsAg陰性且抗-HBc陰性、HBsAg陰性但抗-HBc陽性、HBsAg陰性對照的血清HBcrAg診斷HBsAg陽性且HBeAg陽性與HBsAg陽性但HBeAg陰性患者的ROC曲線下面積之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=3.454、Z=3.612、Z=3.073，P均<0.01)，血清HBV DNA診斷HBsAg陽性且HBeAg陽性與HBsAg陽性但HBeAg陰性患者的ROC曲線下面積之間的差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=2.709、Z=2.709、Z=2.150，P均<0.01)。

表2 血清HBcrAg和HBV DNA診斷HBsAg陽性且HBeAg陽性患者的ROC曲線下面積

a:Z= 0.811,P= 0.418; b:Z= 0.885,P= 0.373; c:Z= 0.244,P= 0.803

表3 血清HBcrAg和HBV DNA診斷HBsAg陽性但HBeAg陰性患者的ROC曲線下面積

a:Z= 0.243,P= 0.810; b:Z= 0.157,P= 0.873; c:Z= 0.219,P= 0.826

表4 血清HBcrAg和HBV DNA診斷HBsAg陽性患者的ROC曲線下面積

a:Z=0.030,P=0.976; b:Z=0.159,P=0.873; c:Z=0.100,P=0.920

圖1 血清HBcrAg和HBV DNA鑒別HBsAg陽性與HBsAg陰性患者的ROC曲線Fig.1 ROC curves of serum HBcrAg and HBV DNA for discriminating HBsAg-positive and HBsAg-negative patients(1) 測試變量： A： HBsAg陽性且HBeAg陽性，B： HBsAg陽性但HBeAg陰性，C： HBsAg陽性；(2) 陰性對照： HBsAg陰性

2.4 血清HBcrAg和HBV DNA鑒別HBsAg陽性與HBsAg陰性患者的最佳截斷值及對應(yīng)的診斷參數(shù)

分別以HBsAg陰性且抗-HBc陰性、HBsAg陰性但抗-HBc陽性、HBsAg陰性為對照，血清HBcrAg診斷HBsAg陽性且HBeAg陽性患者的最佳截斷值分別為≥1875U/ml、≥1327U/ml、≥1648U/ml，其對應(yīng)的靈敏度和特異度分別為0.993和0.962、0.993和0.962、0.982和0.962；診斷HBsAg陽性但HBeAg陰性患者的最佳截斷值分別為≥649U/ml、≥548U/ml、≥849U/ml，其對應(yīng)的靈敏度和特異度分別為0.766和0.923、0.787和0.885、0.755和0.923；診斷HBsAg陽性患者的最佳截斷值分別為≥649U/ml、≥1648U/ml、≥1648U/ml，其對應(yīng)的靈敏度和特異度分別為0.900和0.923、0.865和1.000、0.865和0.981。見表5～7。

血清HBV DNA診斷HBsAg陽性且HBeAg陽性患者的最佳截斷值分別為≥569IU/ml、≥569IU/ml、≥561IU/ml，其對應(yīng)的靈敏度和特異度分別為0.963和1.000、0.963和1.000、0.969和0.981；診斷HBsAg陽性但HBeAg陰性患者的最佳截斷值分別為≥515IU/ml、≥515IU/ml、≥515IU/ml，其對應(yīng)的靈敏度和特異度分別為0.809和1.000、0.809和1.000、0.809和1.000；診斷HBsAg陽性患者的最佳截斷值分別為≥515IU/ml、≥515IU/ml、≥515IU/ml時，其對應(yīng)的靈敏度和特異度分別為0.900和1.000、0.900和1.000、0.900和1.000，見表5～7。

*計量單位： HBcrAg: log10U/ml; HBV DNA: log10IU/ml

*計量單位： HBcrAg: log10U/ml; HBV DNA: log10IU/ml

表7 血清HBcrAg和HBV DNA鑒別血清HBsAg陽性與HBsAg陰性患者的最佳截斷值及其對應(yīng)的診斷參數(shù)

*計量單位： HBcrAg: log10U/ml; HBV DNA: log10IU/ml

2.5 血清HBcrAg和HBV DNA鑒別HBsAg陽性與HBsAg陰性患者的合理截斷值及對應(yīng)的診斷參數(shù)

以HBsAg陰性為對照，當(dāng)血清HBcrAg≥1500U/ml、≥1250U/ml、≥1000U/ml、≥750U/ml、≥500U/ml時，其診斷HBsAg陽性患者的靈敏度和特異度分別為0.865和0.981、0.865和0.962、0.870和0.923、0.896和0.904、0.909和0.885；當(dāng)血清HBV DNA≥500IU/ml時，其診斷HBsAg陽性患者的靈敏度和特異度分別為0.900和1.000，見表8。

表8 血清HBcrAg鑒別血清HBsAg陽性與HBsAg陰性患者的截斷值及其對應(yīng)的診斷參數(shù)

3 討 論

初步的應(yīng)用研究[2，4-9，10]認(rèn)為，慢性乙型肝炎患者血清HBcrAg水平與血清HBV DNA載量和肝組織內(nèi)HBV DNA、HBV cccDNA含量均呈顯著正相關(guān)；在核苷(酸)類藥物治療過程中，血清HBcrAg水平動態(tài)變化與血清HBV DNA載量保持平行，但其變化幅度小于血清HBV DNA；血清HBcrAg水平的動態(tài)變化對核苷(酸)類藥物治療中的耐藥和停藥后復(fù)發(fā)有預(yù)測作用。最近，Seto等[11]采用Lumipulse G1200檢測了349例慢性HBV感染者的血清HBcrAg水平，結(jié)果顯示，從免疫耐受期、經(jīng)免疫激活期到免疫控制期，血清HBcrAg水平逐步降低；但從免疫控制期到免疫再激活期，血清HBcrAg水平有所升高；血清HBcrAg水平在免疫耐受期與免疫激活期、免疫激活期與免疫控制期、免疫控制期與免疫再激活期之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。提示血清HBcrAg定量檢測有預(yù)測慢性HBV感染狀態(tài)和潛在的預(yù)測慢性乙型肝炎疾病狀態(tài)的效能。

血清HBcrAg定量檢測性能評價的研究文獻(xiàn)較少。Kimura等[1]的開發(fā)研究指出，血清HBcrAg的檢測范圍為4×102～1×107U/ml；批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為9.8%～11.3%和4.3%～12.7%；108例HBsAg陰性且HBV DNA陰性健康對照和丙型肝炎患者的血清HBcrAg均<8.9×102U/ml，其平均值分別為(4.5±1.3)U/ml和(4.5±1.0)U/ml。因此，研究者將血清HBcrAg的陰性正常參考值暫定為1×103U/ml。最近，Park等[12]對血清HBcrAg Lumipulse G1200定量檢測的性能進(jìn)行了再評價，檢測高水平HBcrAg混合血清(平均HBcrAg： 312.74kU/ml)的批內(nèi)、批間和日間變異系數(shù)分別為3.1%、2.9%和1.4%，低水平HBcrAg混合血清(平均HBcrAg： 0.13kU/ml)的批內(nèi)、批間和日間變異系數(shù)分別為39.8%、34.7%和2.0%；但是，受高水平和低水平血清HBcrAg樣本數(shù)量的限制，研究者對血清HBcrAg的線性范圍未做驗證。提示Fujirebio Lumipulse G1200檢測低水平血清HBcrAg的精度有限。

有限的血清HBcrAg定量檢測性能評價的研究[1,12]是基于血清HBcrAg的正態(tài)分布，但是，研究者對血清HBcrAg的分布特征未做描述。本研究顯示，血清HBcrAg(log10U/ml)或HBV DNA(log10IU/ml)均表現(xiàn)為非正態(tài)分布；無論HBeAg陽性或陰性HBV感染者，血清HBcrAg與HBV DNA均呈顯著正相關(guān)；不考慮HBeAg狀態(tài)，血清HBcrAg與HBV DNA呈高度正相關(guān)。因此，采取ROC曲線法確定血清HBcrAg的陰性正常參考值應(yīng)當(dāng)是更合理的方法。

本研究分別以HBsAg陰性且抗-HBc陰性、HBsAg陰性但抗-HBc陽性、HBsAg陰性作為陰性對照，以HBsAg陽性且HBeAg陽性和HBsAg陽性且HBeAg陰性作為HBV感染的狀態(tài)變量，繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，雖然基于三類陰性對照人群的血清HBcrAg與HBV DNA診斷HBsAg陽性且HBeAg陽性和HBsAg陽性但HBeAg陰性感染的ROC曲線下面積之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但基于同類陰性對照人群的血清HBcrAg和HBV DNA診斷HBsAg陽性且HBeAg陽性與HBsAg陽性但HBeAg陰性感染的ROC曲線下面積之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；基于Youden指數(shù)確定的基于同類陰性對照人群的血清HBcrAg診斷HBsAg陽性且HBeAg陽性與HBsAg陽性且HBeAg陰性感染的最佳截斷值的差異較大，而血清HBV DNA診斷HBsAg陽性且HBeAg陽性與HBsAg陽性且HBeAg陰性感染的最佳截斷值的差異較小，提示與血清HBV DNA相比，血清HBcrAg診斷HBV感染的陰性參考值的變異相對較大。

Seto等[11]的研究曾將血清HBcrAg陰性正常參考值設(shè)定為<100U/ml，但缺乏相關(guān)的文獻(xiàn)支持。本研究對血清HBcrAg≥1500U/ml、≥1250U/ml、≥1000U/ml、≥750U/ml、≥500U/ml 診斷HBsAg陽性患者的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度進(jìn)行比較的結(jié)果指出，將HBcrAg≥1000U/ml 或≥750U/ml 診斷HBsAg陽性患者的穩(wěn)定性較好。本研究結(jié)果支持HBcrAg定量檢測性能評價研究[12]和開發(fā)研究[1]的結(jié)論： 與血清HBV DNA相比，CLEIA檢測低水平的血清HBcrAg的精度有限；血清HBcrAg<1000U/ml可能是合理的陰性正常參考值。

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Negative normal reference value of serum hepatitis B core-related antigen

ZHANGZhan-qing1,LUWei1,WANGYan-bing1,WENGQi-cheng2,ZHANGZhi-yong2,ZHOUXin-lan1

(1. Division Ⅱ of Department of Hepatology， Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, Shanghai 201508, China; 2. Shanghai Representative Office, Fujirebio Incorporation of Japan, Shanghai 200336， China)

Objective To explore the rational negative normal reference value of serum hepatitis B core-related antigen (HBcrAg). Methods Two hundred and thirty patients with Na?ve hepatitis B and 52 non- hepatitis B patients were enrolled in the study. Serum HBcrAg levels were measured by Fujirebio Lumipulse G1200 automatic chemiluminescence immunoassay system. SPSS 16.0 software was used for data processes and statistical analyses. Results Serum HBcrAg values were non-normal distribution (P<0.01). Serum HBcrAg values were positively correlated with HBV DNA in HBsAg-positive patents (P<0.01). The area under ROC curve of serum HBcrAg in the diagnosis of HBsAg-positive patients was 0.953. When the cut-off values of serum HBcrAg were taken as 1500U/ml, 1250U/ml, 1000U/ml, 750U/ml, 500U/ml, the sensitivity and specificity in diagnosis of HBsAg-positive patients were 0.865 and 0.981, 0.865 and 0.962, 0.870 and 0.923, 0.896 and 0.904, 0.909 and 0.885. Conclusion Serum HBcrAg<1000U/ml may be the reasonable negative normal reference value.

hepatitis B core-related antigen; chemiluminescence enzyme immunoassay; normal reference

10.16118/j.1008-0392.2016.02.006

2015-12-02

上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會重點科研項目(20134032);國家傳染病“十二五”科技重大專項(2013ZX10002005)

張占卿(1964—)，男，主任醫(yī)師，碩士.E-mail： doctorzzqsphc@163.com

R 512.6+2

A

1008-0392(2016)02-0024-07