宗姍姍, 趙 鑫, 羅成鳳, 李春青, 王 凱, 周 倩

(同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院婦產(chǎn)科，上海 200040)

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·基礎(chǔ)研究·

吲哚胺2,3雙加氧酶對人絨毛膜癌JEG-3細胞增殖及遷移能力的影響

宗姍姍, 趙 鑫, 羅成鳳, 李春青, 王 凱, 周 倩

(同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院婦產(chǎn)科，上海 200040)

目的 觀察吲哚胺2，3雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)對人絨毛膜癌JEG-3細胞體外增殖、遷移能力的影響。方法 通過IDO抑制劑(1-L-MT)及短發(fā)夾RNA基因干擾抑制IDO表達，利用MTS增殖實驗、Transwell遷移試驗檢測對細胞增殖和遷移能力的影響。結(jié)果 基因敲減能明顯降低IDO表達水平。1-L-MT和基因敲減的JEG-3細胞與對照組相比，細胞的增殖和遷移能力明顯下降。結(jié)論 抑制IDO能夠降低絨癌細胞系JEG-3細胞的增殖和遷移能力。

絨毛膜腫瘤； 吲哚胺2,3雙加氧酶； JEG-3； 細胞增殖； 細胞遷移

吲哚胺2,3雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase， IDO)是一種含亞鐵血紅素的酶，廣泛分布于人體多種組織和細胞內(nèi)，是肝臟外唯一可以催化色氨酸分子中吲哚環(huán)裂解沿犬尿氨酸途徑代謝的限速酶，具有多種免疫調(diào)節(jié)作用。近年來研究表明IDO在多種腫瘤組織中表達增高[1-3]，不僅調(diào)節(jié)免疫細胞，而且能夠促進腫瘤細胞本身的生長，促進腫瘤轉(zhuǎn)移[4-5]。IDO抑制劑1-L-MT作為癌癥潛在治療靶點，已進入臨床前期研究[6-7]。絨毛膜癌作為一種高度惡性的腫瘤，對婦女的生命健康存在嚴(yán)重威脅[8]。本研究利用藥物及基因敲減技術(shù)抑制IDO基因在JEG-3細胞中的表達，觀察對細胞增殖和遷移能力的影響，為絨毛膜癌診治方案的完善提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

人絨毛膜癌JEG-3細胞由同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院轉(zhuǎn)化中心實驗室提供。DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購買自美國Gibco公司；shRNA試劑盒購買自上海中喬新舟生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒購買自美國TaKaRa公司；IDO抗體購自美國Millipore公司；GAPDH抗體購買自上?？党缮镉邢薰?；MTS增殖檢測試劑購自北京Promega公司；遷移熒光染料Calcein-AM購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 JEG-3細胞培養(yǎng) JEG-3細胞培養(yǎng)液α-MEM，加入10%FBS和1%青霉素/鏈霉素；將細胞置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d換液。選指數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 消化計數(shù)生長良好的JEG-3細胞，鋪于6孔板，每孔5萬個細胞，加入病毒混合液，用Polybrene促轉(zhuǎn)染，操作步驟按說明書進行。轉(zhuǎn)染12h，加入嘌呤霉素篩選，選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株進行后續(xù)實驗。

1.2.3 熒光定量PCR檢測IDO的mRNA表達 收集對數(shù)生長期各組細胞，用TRIzol提取總RNA，用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄，天根Real-Time PCR試劑盒進行擴增。引物序列如下。IDO上游引物: 5′-GGCTTCTTCCTCGTCTCTCTATTG-3′；IDO下游引物: 5′-TGACGCTCTACTGCACT-GGATAC-3′；GAPDH上游引物: 5′-ACTCCACGA-CGTACTCAGCG-3′； GAPDH下游引物: 5′-GGTCGGACTCAACGGATTTG-3′。 Real-Time反應(yīng)條件： 預(yù)變性95℃ 30 s， PCR反應(yīng)(95℃ 5 s，60℃ 20 s)40個循環(huán)。按相對定量ΔΔCT法，每次實驗樣品設(shè)三復(fù)孔，計算平均CT值。ΔCT(IDO, 樣品1)=平均CT(IDO, 樣品1)-平均CT(GAPDH, 樣品1)。設(shè)定正常早孕組20例樣品ΔCT平均值為基值，所有40例的ΔCT與之相減，得ΔΔCT。當(dāng)各組織PCR 擴增效率一致時，采用公式： fold change=2(-ΔΔCT)。應(yīng)用Studentt-test 進行統(tǒng)計分析。根據(jù)溶解曲線分析模板是否純凈單一，如果溶解曲線圖中表現(xiàn)為單一峰，說明引物特異性高，無非特異性熒光，對模板的定量準(zhǔn)確。

1.2.4 Western印跡法檢測IDO蛋白表達 取對數(shù)生長期的各組細胞，預(yù)冷的蛋白裂解液提取蛋白質(zhì)。BCA法檢測蛋白濃度，以每孔30μg上樣。SDS-PAGE凝膠垂直電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1h，加入抗人IDO一抗(1∶500)，4℃孵育12～16h。山羊抗鼠IgG二抗(1∶2 000)室溫下孵育1h，ECL顯影，在FluorChem E上顯色曝光，AlphaView SA系統(tǒng)上測定蛋白條帶的灰度值。GAPDH蛋白為內(nèi)參。計算目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值。

1.2.5 細胞增殖實驗 取生長良好的各組細胞，調(diào)整濃度為2萬/ml，鋪入96孔板，每孔100μl，設(shè)6個復(fù)孔。加入不同濃度的IDO抑制劑1-L-MT(0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mmol/L)，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。每孔加入20μl的MTS，注意避光，輕輕晃動細胞培養(yǎng)板，使其混勻，細胞培養(yǎng)箱中避光孵育1h。在酶標(biāo)儀中測量每孔490nm的吸光值(D490)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出各孔的對應(yīng)細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 細胞遷移實驗 取生長良好的各組細胞，重懸于含2%FBS的培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度為17萬/ml，Transwell板上室每孔鋪上述細胞懸液300μl，下室每孔加含10%FBS的培養(yǎng)基800μl，重復(fù)2個復(fù)孔。加或不加不同濃度的IDO抑制劑1-L-MT，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。下室每孔加入熒光染色劑Calcein-AM 1μl，培養(yǎng)箱孵育30min。熒光顯微鏡下拍攝照片，并計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 基因干擾抑制IDO表達

基因干擾效果檢測 Real-Time PCR及Western印跡法檢測顯示，相比于對照組，IDO特異性shRNA 基因干擾的JEG-3細胞IDO的mRNA表達水平下降65%，IDO蛋白表達水平下降53%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，見圖1。

圖1 Western印跡法檢測基因干擾后IDO蛋白表達Fig.1 IDO protein expression in shRNA-transfected JEG-3 cells and control shown by Western blotting

2.2 1-L-MT和shRNA干擾IDO表達抑制JEG-3細胞增殖能力

當(dāng)不同濃度的1-L-MT加入JEG-3細胞培養(yǎng)基處理48h后，細胞的增殖受到一定程度的抑制。當(dāng)1-L-MT 的濃度為0.5mmol/L及以下時，對JEG-3細胞的增殖能力沒有明顯抑制。當(dāng)1-L-MT 的濃度大于1mmol/L時，JEG-3細胞的增殖能力受到明顯抑制，隨著在培養(yǎng)基中1-L-MT的濃度增高，抑制效應(yīng)越加明顯，即有一個劑量依賴的趨勢，見圖2。通過將shRNA轉(zhuǎn)染入JEG-3細胞進一步證實IDO對絨癌細胞增殖能力的影響，與對照組相比，干擾組增殖能力明顯降低。

2.3 1-L-MT和shRNA干擾IDO表達抑制JEG-3細胞遷移能力

不同濃度的1-L-MT 加入JEG-3培養(yǎng)基處理48h后，用Transwell系統(tǒng)培養(yǎng)16h，檢測JEG-3細胞的遷移情況，與對照組相比，JEG-3細胞的遷移功能都受到一定程度的抑制，并且2mmol/L時抑制作用明顯強于1mmol/L。通過將shRNA轉(zhuǎn)染入JEG-3細胞進一步證實IDO對絨癌細胞遷移能力的影響，與對照組相比，干擾組遷移能力降低43%，見圖3、4。

圖2 1-L-MT和IDO基因干擾抑制JEG-3細胞增殖能力Fig.2 Cell proliferation in 1-L-MT-treated and shRNA-transfected JEG-3 cells and controls與不加1-L-MT組相比，*P<0.05，**P<0.01

圖3 1-L-MT抑制JEG-3細胞遷移能力Fig.3 Cell migration in 1-L-MT-treated JEG-3 cells and control

圖4 shRNA干擾IDO表達抑制JEG-3細胞遷移能力Fig.4 Cell migration in shRNA-transfected JEG-3 cells and controls

3 討 論

絨毛膜癌是高度惡性的滋養(yǎng)細胞腫瘤，嚴(yán)重威脅育齡期婦女生命。目前臨床多藥聯(lián)合化療方案使多數(shù)患者病情得到緩解，然而耐藥病例仍有一部分比例，因此需要不斷探索新的治療方法。正常情況下，滋養(yǎng)層細胞對子宮內(nèi)膜的侵襲受到嚴(yán)格而精準(zhǔn)的調(diào)控，體內(nèi)多種細胞因子均能夠調(diào)控絨毛膜癌細胞的惡性侵襲[9]。IDO作為一種免疫調(diào)節(jié)分子被廣泛研究，而近年來研究發(fā)現(xiàn)，IDO不僅具有調(diào)節(jié)免疫的作用，還對多種腫瘤細胞的生長具有促進作[4-5,10]。將IDO-cDNA轉(zhuǎn)入鼠源性卵巢癌細胞系OV2944-HM-1中后，種植于免疫完全小鼠體內(nèi)，腫瘤腹膜轉(zhuǎn)移顯著增多[11]。而IDO缺陷小鼠肺腫瘤轉(zhuǎn)移的機會則明顯減少。

近年來多篇報道發(fā)現(xiàn)，IDO對于多種腫瘤細胞本身的生長具有重要作用，IDO表達高的肺癌患者預(yù)后較差，表達IDO的細胞比不表達IDO的細胞有更強的增殖和轉(zhuǎn)移能力[12-14]，而在絨毛膜癌細胞中，IDO是否能夠調(diào)節(jié)其功能，目前還未見報道。

本研究應(yīng)用IDO特異性抑制劑1-L-MT處理JEG-3細胞后，檢測其增殖和遷移功能，發(fā)現(xiàn)其增殖和遷移能力都明顯降低。為了進一步證實IDO對絨癌細胞系JEG-3細胞的調(diào)節(jié)作用，對絨癌細胞系JEG-3細胞進行了IDO基因敲減，發(fā)現(xiàn)相比于對照組，IDO基因敲減組的絨癌細胞增殖和遷移能力明顯受到抑制。說明IDO對于絨癌細胞系JEG-3細胞的增殖和遷移能力具有調(diào)控作用，有可能為絨癌的治療提供新的靶點。

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Effect of indoleamine 2,3-dioxygenase on proliferation and migration in JEG-3 cells

ZONGShan-shan，ZHAOXin，LUOCheng-feng，LIChun-qing，WANGKai，ZHOUQian

(Dept. of Obstetrics and Gynecology， First Maternity and Infant Hospital, Tongji University， Shanghai 200040， China)

Objective To investigate the effect of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) on proliferation and migration of human choriocarcinama JEG-3 cells. Methods JEG-3 cell function was studied by IDO inhibitor(1-L-MT) or shRNA. The proliferation and migration of JEG-3 cells were determined by MTT assay and Transwell system, respectively. Results shRNA knockdown significantly decreased IDO expression. 1-L-MT and shRNA knockdown of IDO decreased the proliferation and migration of JEG-3 cells. Conclusion The inhibitory of IDO can suppress the proliferation and migration of trophoblast cellsinvitro.

choriocarcinama; IDO; JEG-3; proliferation; migration

10.16118/j.1008-0392.2016.02.007

2015-11-29

國家自然科學(xué)基金(81270703)；上海市科學(xué)技術(shù)委員會項目(14140900203)

宗姍姍(1989—)，女，住院醫(yī)師，碩士研究生.E-mail： zongshan39@163.com

周 倩.E-mail： shzhouqian@126.com

R 737.33

A

1008-0392(2016)02-0031-04