李俊雯， 楊紅彥， 靳令經(jīng)， 陳軼卉， 聶志余, 黃 敬

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200065； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院分院內(nèi)科，上海 200092；3. 同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院眼科，上海 200090)

?

·基礎(chǔ)研究·

李俊雯1， 楊紅彥2， 靳令經(jīng)1， 陳軼卉3， 聶志余1, 黃 敬2

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200065； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院分院內(nèi)科，上海 200092；3. 同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院眼科，上海 200090)

目的 探討慢性低灌注時(shí)，水通道蛋白-4(aquaporin-4， AQP4)的表達(dá)與構(gòu)型變化在血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)通透性增高中的作用。方法 Wistar大鼠采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)(2-vessel occlusion, 2VO)建立慢性低灌注模型，測(cè)定2VO術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)腦組織伊文思藍(lán)(evans blue， EB)含量，評(píng)價(jià)BBB通透性，RT-PCR和Western印跡法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)AQP4 mRNA及蛋白水平表達(dá)，免疫熒光雙標(biāo)法觀察AQP4的構(gòu)型變化。結(jié)果 2VO術(shù)后早期，BBB通透性迅速升高，AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)水平與BBB通透性變化趨勢(shì)一致，均在術(shù)后3d時(shí)達(dá)到高峰，1、2周時(shí)仍顯著升高(P<0.01)，隨著慢性缺血時(shí)間的延長，無論是BBB通透性還是AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均逐漸降低，至3個(gè)月時(shí)與假手術(shù)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而AQP4的功能構(gòu)型OAPs與BBB通透性變化趨勢(shì)呈負(fù)相關(guān)，2VO術(shù)后早期AQP4與GFAP共定位明顯減少，隨后逐漸增多，術(shù)后3個(gè)月時(shí)恢復(fù)至正常水平。結(jié)論 慢性低灌注狀態(tài)可引起B(yǎng)BB通透性升高，AQP4的表達(dá)與構(gòu)型改變與BBB通透性密切相關(guān)。

慢性低灌注； 血腦屏障； 水通道蛋白-4； 大鼠

血腦屏障(blood-brain barrier， BBB)是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基礎(chǔ)，由內(nèi)皮細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞足突，基膜及其間的緊密連接組成，其結(jié)構(gòu)的完整與功能的維持有賴于內(nèi)皮細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞表面水通道蛋白-4(aquaporin-4， AQP4)的表達(dá)及其活性形式OAPs(orthogonal arrays of particles)的形成[1-2]。目前，關(guān)于AQP4的研究主要集中在缺血再灌注損傷或膠質(zhì)細(xì)胞瘤等方面，而慢性低灌注時(shí)AQP4是否參與了BBB的損傷、作用機(jī)制如何尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過觀察雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎(2-vessel occlusion, 2VO)大鼠BBB通透性改變情況及其與AQP4表達(dá)、構(gòu)型變化之間的關(guān)系，探討AQP4在慢性低灌注時(shí)BBB損傷中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康成年雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量220～250g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。120只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組，每組按不同時(shí)間點(diǎn)分為低灌注后3d，1、2周，1、3個(gè)月5個(gè)亞組，行2VO術(shù)建立慢性低灌注模型。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物先結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈，1周后結(jié)扎另一側(cè)。假手術(shù)組只分離頸總動(dòng)脈不結(jié)扎。分別于術(shù)后3d，1、2周，1、3個(gè)月取材，測(cè)定腦組織伊文思藍(lán)(evans blue, EB)含量、AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)水平及OAPs聚合情況。

1.2 儀器與設(shè)備

小鼠抗AQP4抗體購自英國Abcam公司；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Alexa Fluor 488二抗和Alexa Fluor 594山羊抗小鼠抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗GFAP抗體購自丹麥Dako公司；小鼠抗tubulin抗體購自美國Sigma公司；Quantity One軟件購自美國Bio-Rad公司。

1.3 腦內(nèi)EB含量測(cè)定評(píng)價(jià)BBB通透性

Wistar大鼠尾靜脈注射2% EB,4ml/kg，在體循環(huán)2h后，腹腔注射戊巴比妥鈉60mg/kg麻醉，經(jīng)左心房灌注0.9%氯化鈉溶液，直至左心耳流出的液體清亮，斷頭取腦稱重。置入1ml的50%三氯乙酸溶液中，勻漿，離心半徑13.5cm，10000r/min，離心20min。取上清液，用無水乙醇以1∶3的比例稀釋后用酶標(biāo)儀測(cè)濃度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出大鼠腦內(nèi)EB含量。

1.4 RT-PCR測(cè)定AQP4mRNA表達(dá)

Wistar大鼠戊巴比妥鈉60mg/kg腹腔麻醉后，迅速斷頭取腦液氮保存。TRI法提取組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA, cDNA作為分析AQP4表達(dá)的RT-PCR反應(yīng)模板。引物設(shè)計(jì)由Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件完成，tubulin作為內(nèi)參。引物序列如下。AQP4上游引物： 5′-TTGCTTTGGACTCAGCA-TTG-3′,下游引物： 5′-GGGAGGTGTGACCA-GGTAGA-3′。Tubulin上游引物： 5′-TGAGGCC-TCCTCTCACAAGT-3′，下游引物： 5′-CGCACG-ACATCTAGGACTGA-3′。引物由上海BioSune公司合成。SYBR Green熒光染料嵌合法，使用Bio-Rad CFX96 PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。25μl 體系反應(yīng)條件如下。預(yù)變性： 95℃ 5min，變性： 95℃ 20s，退火： 60℃ 20s，延伸： 72℃ 1min。共40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增完畢進(jìn)行溶解曲線分析，讀取CT值，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用2-ΔΔCt表示其相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Western印跡法觀察AQP4蛋白表達(dá)

Wistar大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉60mg/kg麻醉后，迅速斷頭取腦液氮保存。取少量組織塊加入組織裂解液(RIPA裂解液，1%蛋白酶抑制劑，1%磷酸酶抑制劑)勻漿，4℃，離心半徑13.5cm，12000r/min，離心5min，抽提總蛋白。BCA法測(cè)定樣本的蛋白濃度。根據(jù)測(cè)得的蛋白濃度用上樣緩沖液調(diào)整樣品蛋白至相同濃度。95℃金屬浴10min，取蛋白樣品30μg 加入10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，150V 恒壓電泳，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。10%脫脂牛奶封閉2h后洗膜，加小鼠抗AQP4抗體(1∶1000)4℃ 孵育過夜。TBST(Tris-HCl吐溫緩沖液)漂洗，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶3000)，室溫孵育2h，TBST漂洗。LAS4000系統(tǒng)顯影檢測(cè)反應(yīng)條帶。其反應(yīng)條帶通過Quantity One軟件進(jìn)行定量分析。

1.6 免疫熒光雙標(biāo)觀察OAPs構(gòu)型

Wistar大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉60mg/kg麻醉后，經(jīng)左心房灌注0.9%氯化鈉溶液，直至左心耳流出的液體清亮為止，40%多聚甲醛溶液灌注直至大鼠全身抽搐，尾巴僵硬為止。斷頭取腦，置于40%多聚甲醛溶液中固定12h，分別移至10%、20%、30%蔗糖溶液中梯度脫水。冰凍冠狀切片，片厚8μm，PBS溶液漂洗3次，加入抗原修復(fù)液，96℃修復(fù)10min，室溫自然冷卻，用免疫染色封閉液室溫孵育后加入小鼠抗AQP4抗體(1∶100)和兔抗GFAP抗體(1∶200)孵育，4℃過夜。室溫復(fù)溫后，PBS溶液漂洗3次，加入熒光二抗(Alexa Fluor 488山羊抗兔和Alexa Fluor 594山羊抗小鼠抗體，1∶200)，避光條件下，室溫孵育2h。PBS溶液漂洗3次后滴加DAPI染液復(fù)染細(xì)胞核，避光孵育10min后PBS漂洗3次，雙蒸水漂洗2次，用防猝滅封片劑封片，在激光共聚焦顯微鏡下拍片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。組間資料比較采用單因素方差分析，兩組間的定量資料采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 慢性低灌注不同時(shí)間點(diǎn)腦組織EB含量

滲出BBB的EB含量在2VO術(shù)后快速升高，術(shù)后3d達(dá)到高峰，術(shù)后1、2周仍顯著高于假手術(shù)組(P<0.01),術(shù)后1個(gè)月仍高于假手術(shù)組(P<0.05)。2VO術(shù)后3個(gè)月EB含量與假手術(shù)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

圖1 2VO術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)腦組織EB含量Fig.1 Effect of CCH on EB extravasations1： 假手術(shù)組；2： 2VO術(shù)后3d組；3： 2VO術(shù)后1周組；4： 2VO 術(shù)后2周組；5： 2VO術(shù)后1個(gè)月組；6： 2VO術(shù)后3個(gè)月組；與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 慢性低灌注不同時(shí)間點(diǎn)AQP4 mRNA表達(dá)

2VO術(shù)后，AQP4 mRNA表達(dá)快速升高，3d達(dá)到頂峰。與假手術(shù)組相比，術(shù)后3d,1、2周，AQP4 mRNA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。術(shù)后1、3個(gè)月，AQP4 mRNA表達(dá)較3d，1、2周有所下降，與假手術(shù)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

圖2 2VO術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)各組AQP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Quantification of AQP4 mRNA expression after 2VO1： 假手術(shù)組；2： 2VO術(shù)后3d組；3： 2VO術(shù)后1周組；4： 2VO術(shù)后2周組；5： 2VO術(shù)后1個(gè)月組；6： 2VO術(shù)后3個(gè)月組；與假手術(shù)組比較，**P<0.01

2.3 慢性低灌注不同時(shí)間點(diǎn)AQP4蛋白表達(dá)

AQP4蛋白表達(dá)在2VO術(shù)后快速升高，3d達(dá)到頂峰，術(shù)后3d組、1周組與假手術(shù)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，術(shù)后2周，AQP4蛋白表達(dá)仍有升高，與假手術(shù)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，術(shù)后1、3個(gè)月，AQP4蛋白表達(dá)與假手術(shù)組無明顯差異，見圖3。

2.4 慢性低灌注不同時(shí)間點(diǎn)OAPs形成情況

與假手術(shù)組相比，各組微血管周圍的GFAP染色無明顯差異，微血管周圍AQP4的表達(dá)在術(shù)后 3d、1周表達(dá)較強(qiáng)，明顯高于假手術(shù)組；術(shù)后2周、1個(gè)月，AQP4熒光信號(hào)開始出現(xiàn)不連續(xù)；術(shù)后3個(gè)月，AQP4熒光信號(hào)漸恢復(fù)，與假手術(shù)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2VO術(shù)后3d、1周，GFAP和AQP4共定位與假手術(shù)組相比明顯減少；術(shù)后2周、1個(gè)月，GFAP和AQP4共定位與術(shù)后3d、1周相比有所增加，但較假手術(shù)組仍有減少；術(shù)后3個(gè)月，共定位情況與假手術(shù)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

圖3 2VO術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)各組AQP4蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Quantification of AQP4 protein expression after 2VO1： 假手術(shù)組；2： 2VO術(shù)后3d組；3： 2VO術(shù)后1周組；4： 2VO術(shù)后2周組；5： 2VO術(shù)后1個(gè)月組；6： 2VO術(shù)后3個(gè)月組；與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

慢性低灌注通常是指由動(dòng)脈狹窄所致的腦組織血供長期低于生理閾值而出現(xiàn)慢性缺血性神經(jīng)系統(tǒng)功能損害的病理狀態(tài)，可能與腦白質(zhì)疏松，血管性癡呆，短暫性腦缺血發(fā)作及動(dòng)脈硬化性腦梗死等發(fā)病有關(guān)[3-6]。慢性低灌注狀態(tài)可引起B(yǎng)BB通透性增高，BBB具有阻止有害物質(zhì)進(jìn)入腦內(nèi)和將營養(yǎng)物質(zhì)從外周血液轉(zhuǎn)運(yùn)至腦內(nèi)的雙重作用，其在控制血液和腦實(shí)質(zhì)間的物質(zhì)交換，穩(wěn)定大腦微環(huán)境方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為導(dǎo)致BBB通透性升高的原因是其兩側(cè)靜水壓和滲透壓平衡紊亂，隨著分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，研究者們發(fā)現(xiàn)AQP4也參與調(diào)節(jié)BBB的發(fā)育與成熟，其表達(dá)水平的高低與BBB完整性密切相關(guān)[7-9]。

AQP4是一種對(duì)水分子有高度選擇性的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在腦內(nèi)分布廣泛，主要存在于腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的膠質(zhì)細(xì)胞，微血管內(nèi)皮細(xì)胞，室管膜上皮細(xì)胞及脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞，參與BBB對(duì)水分的轉(zhuǎn)運(yùn)以及腦脊液的分泌與吸收的調(diào)節(jié)，作為滲透壓感受器參與全身代謝，另外在功能上也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外K+、水的代謝[10-12]。AQP4的功能狀態(tài)是由4個(gè)亞基以非共價(jià)鍵連接形成的四聚體OAPs(orthogonal arrays of particles)，稱為顆粒的直角排列，正是由于星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面OAPs的存在，使得星形膠質(zhì)細(xì)胞有了極性，從而維持BBB的完整性[13]。

目前，評(píng)價(jià)BBB通透性的經(jīng)典方法是對(duì)滲出至腦組織的EB含量做定量分析。EB是一種偶氮基熒光染料，易與血清蛋白結(jié)合，正常生理情況下，血管內(nèi)的EB不能透過BBB進(jìn)入腦組織，但在BBB受損時(shí)，部分EB就可以通過BBB的內(nèi)皮細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞足突等結(jié)構(gòu)滲入腦組織，可以通過計(jì)算滲出血管外的EB含量來評(píng)價(jià)BBB的通透性。本研究結(jié)果顯示，大鼠慢性低灌注后BBB通透性迅速升高，術(shù)后3d即達(dá)到最高峰，1、2周時(shí)仍有明顯損傷，隨后漸漸緩解，至3個(gè)月后BBB通透性恢復(fù)至正常。目前，有多項(xiàng)研究[14-17]表明，慢性低灌注可引起明顯的BBB損傷，尤其在大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型中，BBB通透性升高多出現(xiàn)在缺血早期即2周內(nèi)，與本研究結(jié)果一致。在BBB中，內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞都表達(dá)AQP4，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞是AQP4的高表達(dá)細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，AQP4的mRNA和蛋白表達(dá)水平變化趨勢(shì)與BBB損傷變化呈正相關(guān)，在2VO術(shù)后早期即術(shù)后3d，1、2周急劇升高，隨著慢性低灌注時(shí)間的延長，其表達(dá)逐漸減少，至術(shù)后3個(gè)月時(shí)BBB通透性，AQP4表達(dá)均恢復(fù)至正常水平。該結(jié)果表明AQP4表達(dá)水平的高低與BBB通透性密切相關(guān)。

AQP4的功能狀態(tài)是其四聚體形式OAPs，這種特殊構(gòu)型是維持BBB的穩(wěn)定和功能正常所必需的。Wolberg等[18]發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者BBB通透性顯著升高，而其主要原因就是OAPs的減少。OAPs的正確形成與AQP4的數(shù)目及其在細(xì)胞膜上的位置排列密切相關(guān)。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)，是一種中間纖維蛋白，可特異性識(shí)別星形膠質(zhì)細(xì)胞，GFAP和AQP4免疫熒光雙標(biāo)法觀察二者共定位的熒光信號(hào)強(qiáng)度和連續(xù)性可以反映OAPs的形成情況。結(jié)果顯示，在慢性低灌注早期，形成的OAPs明顯減少，而后逐漸增多，至3個(gè)月時(shí)恢復(fù)至正常水平，OAPs的減少與BBB通透性升高的時(shí)間一致，表明除了AQP4表達(dá)多少與BBB通透性相關(guān)，AQP4是否能夠定向錨定在星形膠質(zhì)細(xì)胞偽足膜上也與BBB功能的維持密切相關(guān)。推測(cè)慢性腦缺血狀態(tài)引起AQP4表達(dá)改變從而影響其在星形膠質(zhì)細(xì)胞偽足膜表面的錨定，使其不能正確形成其功能結(jié)構(gòu)OAPs，破壞了BBB的結(jié)構(gòu)和功能的完整性。

目前，關(guān)于AQP4的研究多集中在急性缺血再灌注或膠質(zhì)細(xì)胞瘤等病理狀態(tài)下其在腦水腫形成和發(fā)展中的作用，而本研究顯示慢性低灌注狀態(tài)可引起B(yǎng)BB通透性增高，AQP4表達(dá)水平升高，其功能結(jié)構(gòu)OAPs表達(dá)減少。表明AQP4不僅參與了腦組織中水分子的轉(zhuǎn)運(yùn)與調(diào)節(jié)，在一定病理?xiàng)l件下其表達(dá)水平和構(gòu)型也與BBB完整性密切相關(guān)。至于AQP4使BBB通透性升高的具體分子機(jī)制則有待進(jìn)一步的研究。BBB的完整性受損可引起大分子的滲漏，而大分子如免疫球蛋白和蛋白酶的外滲則可能是其他許多慢性腦缺血相關(guān)疾病如白質(zhì)疏松的啟動(dòng)因素，期望本研究的結(jié)論能夠?yàn)榕R床上與慢性低灌注相關(guān)的腦血管病及認(rèn)知功能障礙等疾病的防治提供新的研究思路。

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Effect of aquaporin- 4 on increased blood-brain barrier permeability during chronic hypoperfusion in rats

LIJun-wen1,YANGHong-yan2,JINLing-jing1,CHENYi-hui3,NIEZhi-yu1,HUANGJing2

(1. Dept. of Neurology, Tongji Hospital, Tongji University, Shanghai 200065, China；2. Dept. of Internal Medicine, Branch of Tongji Hospital, Tongji University, Shanghai 200092, China; 3. Dept. of Ophthalmology，Yangpu Hospital, Tongji University, Shanghai 200090, China)

Objective To investigate the effect of the expression and configuration of aquaporin-4 (AQP4) on permeability increasing of blood-brain barrier (BBB) during chronic hypoperfusion in rats. Methods Rat models of chronic hypoperfusion were established by bilateral common carotid artery occlusion (2-vessel occlusion, 2VO). BBB permeability was verified by evans blue(EB) content, the mRNA and protein expression of AQP4 was evaluated. OAPs was assessed by visualising the distribution and expression of AQP4 on astrocyte end-feet membranes. Results At early phase of postoperation, the permeability of BBB significantly increased compared with that in sham group(P<0.01)，and the changing trends of mRNA and protein expression of AQP4 were consistent with the EB concentration. They were significantly increased to reach its maximal value compared with the sham rats and then gradually decreased at 1 week, 2 weeks and 1 month after 2VO, and returned to the control levels after 3 months. Double labelling with GFAP and AQP4 demonstrated that AQP4 was correctly anchored on astrocyte end-feet membranes, and was redistributed on membranes in the 3-day, 1-week and 2-week groups, and the GFAP and AQP4 were co-localized on astrocyte end-feet membranes after 3 months. Conclusion The permeability of BBB was increased in hypoperfusion rats, the expression and configuration change of AQP4 are closely related to the BBB permeability.

chronic cerebral hypoperfusion; blood-brain barrier; aquaporin-4； rat

10.16118/j.1008-0392.2016.05.003

2016-03-29

國家自然科學(xué)基金(81000492、81300771)

李俊雯(1988—),女，碩士研究生.E-mail： lijunwen.neurology@hotmail.com

黃 敬.E-mail： jinghuang@#edu.cn

R 743

A

1008-0392(2016)05-0014-06